CN117363744A - 一种仿刺参性别分子标记、引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种仿刺参性别分子标记、引物及其应用，包括4个雄性特异的分子标记和一个雌雄共有分子标记，雄性特异的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑4所示，雌雄共有分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。本发明研究表明，所获得的4个雄性性别特异性DNA分子标记在仿刺参性别鉴定中具有准确性和普适性。本发明公开了上述4个仿刺参性别特异性分子标记的核苷酸序列、4对性别特异引物及其在仿刺参性别鉴定方面的应用，这对仿刺参的遗传育种工作的发展具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及DNA分子标记技术领域、棘皮类海参性别鉴定技术领域，具体涉及一种仿刺参性别分子标记、引物及其应用。
背景技术
仿刺参(又称刺参)，属于棘皮动物门海参纲楯手目刺参科仿刺参属，有着特殊的进化地位和繁殖生活史，因此具有重要的科学研究价值。另一方面，仿刺参具有良好的品质和较高的经济价值，是重要的海水养殖产品。然而，最近我国仿刺参养殖产业遭遇了育种变态困难，种质资源退化等问题，因此亟需一种准确、可靠的性别鉴定手段，对仿刺参性别进行鉴定，以推动仿刺参性别控制育种、遗传选育等相关研究。仿刺参难以从外观区分雌雄，具有同形性染色体，性染色体也难以从外观进行区分。因此，寻找性别特异分子标记是一种对仿刺参进行性别鉴定的理想方法。
近些年来，科研人员用RAPD(随机扩增多态性DNA片段)、SSR(简单重复序列)、SNP(单核苷酸多态性)等方法，对多种水产生物进行性别鉴定，为鉴定水产生物的遗传性别奠定的基础。然而这些筛选性别特异分子标记的方法存在工作量大、耗时长、准确率较低的局限性。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明提供了4个仿刺参雄性特异分子标记及其引物，各引物独立使用均可鉴定仿刺参性别，具有结果稳定、准确、可靠的优点。
仿刺参的性别由染色体决定，具有同形性染色体，在结构和基因含量等方面具有很高的相似性，难以区分。发明人通过对雌雄基因组进行基因组结构变异(SV)联合基因组覆盖度(Coverage)的分析，发现仿刺参具有多处性别特异位点。迄今为止，国内外尚无提供仿刺参多对遗传性别分子标记的报道。因此，开发多遗传性别分子标记以准确鉴定仿刺参的性别在性别控制育种中具有极大的生产应用价值。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
4个仿刺参雄性特异分子标记，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示。4对性别特异引物，包括AJ-1上游引物、AJ-1下游引物、AJ-2上游引物、AJ-2下游引物、AJ-3上游引物、AJ-3下游引物、AJ-4上游引物、AJ-4下游引物，核苷酸序列分别如SEQ IDNO:5到SEQ ID NO:12所示。
一个仿刺参雌雄共有分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，一对共有引物，所述引物包括Ref-1上游引物和Ref-1下游引物，其中Ref-1上游引物的核苷酸序列如SEQID NO:14所示，Ref-1下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
另一方面，本发明提供所述仿刺参性别特异性分子标记在仿刺参雌雄性别鉴定中的应用。
具体而言，应用所述分子标记进行仿刺参雌雄性别鉴定的方法为：
(1)合成用于扩增所述仿刺参性别特异性分子标记的引物对；
(2)制备仿刺参群体的基因组DNA样品；
(3)以步骤(2)中的基因组DNA样品为模板，采用步骤(1)设计的引物对进行PCR扩增，扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果判断仿刺参性别。
优选的，步骤(1)中，所述引物为AJ-1上游引物、AJ-1下游引物、AJ-2上游引物、AJ-2下游引物、AJ-3上游引物、AJ-3下游引物、AJ-4上游引物、AJ-4下游引物、Ref-1上游引物和Ref-1下游引物。
优选的，所述步骤(3)中，根据电泳结果判断仿刺参性别的方法为：
若引物对Ref-1的电泳结果在269bp处具有条带，且引物对AJ-1电泳结果在417bp处、引物对AJ-2电泳结果在304bp处、引物对AJ-3电泳结果在477bp处或引物对AJ-4电泳结果在427bp处具有特异性DNA条带，则说明检测的仿刺参为雄性仿刺参；
若引物对Ref-1的电泳结果在269bp处具有条带，且引物对AJ-1电泳结果在417bp处、引物对AJ-2电泳结果在304bp处、引物对AJ-3电泳结果在477bp处或引物对AJ-4电泳结果在427bp处不具有特异性条带，则说明检测的仿刺参为雌性仿刺参。
优选的，进行PCR扩增时，每20μL的PCR反应体系包括仿刺参基因组DNA样品50ng，上游引物0.5-1μL和下游引物0.5-1μL，2×Taq MasterMix 10μL，加水补足反应体系至20μL。
优选的，进行PCR扩增时，PCR反应程序是：95℃变性3min；95℃变性15s、58℃退火20s、72℃延伸30s、进行25个循环；72℃延伸10min。
优选的，步骤(2)中的仿刺参基因组DNA样品的制备采用传统的酚氯仿提取法获得。
与现有技术相比，本发明的有益成果在于：
(1)本发明基于雌雄仿刺参的基因组高通量测序数据，利用基因组结构变异(SV)结合基因组覆盖度(Coverage)的分析方法，准确、快速的筛选出了4个仿刺参雄性特异分子标记，并设计提供了4对雄性特异引物，可以对仿刺参的性别进行快速、可靠的鉴定。
(2)本发明方法建立一种利用仿刺参雄性特异引物进行性别鉴定的方法，利用4对仿刺参雄性特异引物和1对雌雄共有引物，只需要一个PCR反应就可以鉴定仿刺参性别。相较于传统的鉴定性别的方法，4对引物均可独立使用鉴定性别，耗时短、效率高、可靠性高。
附图说明
图1：本发明实施例1所提供的4个雄性特异分子标记在仿刺参遗传性别鉴定结果示意图。
图2：本发明实施例1所提供的仿刺参性腺样本的组织学切片结果图，其中1、2、3号个体为雄性性腺，4、5、6号个体为雌性性腺。
图3：本发明实施例2所提供的雄性特异引物AJ-1在仿刺参雌雄各12只个体中的遗传性别鉴定结果示意图，其中1-12为雄性个体，13-24为雌性个体，所有个体均能扩增出269bp的共有条带，所有雄性个体均能扩增出417bp的条带，M表示100bp DNA ladder。
图4：本发明实施例2所提供的雄性特异引物AJ-2在仿刺参雌雄各12只个体中的遗传性别鉴定结果示意图，其中1-12为雄性个体，13-24为雌性个体，所有个体均能扩增出269bp的共有条带，所有雄性个体均能扩增出304bp的条带，M表示100bp DNA ladder。
图5：本发明实施例2所提供的雄性特异引物AJ-3在仿刺参雌雄各12只个体中的遗传性别鉴定结果示意图，其中1-12为雄性个体，13-24为雌性个体，所有个体均能扩增出269bp的共有条带，所有雄性个体均能扩增出477bp的条带，M表示100bp DNA ladder。
图6：本发明实施例2所提供的雄性特异引物AJ-4在仿刺参雌雄各12只个体中的遗传性别鉴定结果示意图，其中1-12为雄性个体，13-24为雌性个体，所有个体均能扩增出269bp的共有条带，所有雄性个体均能扩增出427bp的条带，M表示100bp DNA ladder。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明进行清楚、完整的描述。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供的4个仿刺参雄性特异分子标记，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示。4对性别特异引物，包括AJ-1上游引物、AJ-1下游引物、AJ-2上游引物、AJ-2下游引物、AJ-3上游引物、AJ-3下游引物、AJ-4上游引物、AJ-4下游引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5到SEQ ID NO:12所示。一个仿刺参雌雄共有分子标记，核苷酸序列如SEQID NO:13所示，一对共有引物，所述引物包括Ref-1上游引物和Ref-1下游引物，其中Ref-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，Ref-1下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
具体的，SEQ ID NO:1的序列信息如下所示：
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具体的，SEQ ID NO:2的序列信息如下所示：
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具体的，SEQ ID NO:3的序列信息如下所示：
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具体的，SEQ ID NO:4的序列信息如下所示：
TTAATGACAAAAATAGTTTGTTATAAGTGATTTGAATGTGGTCTTTACAAATTCAGTGAGTGGGAGCTGAAAACCTGGGACATGCTAAATCCCAAACACTGATAGCCCTGACACTGTTCTTTGCATTTACTTGCAATGTACTGATCATTGCATGGTTTGCAAGAAAGTCTGAAAAAATCTTTTCAAACCTTTGTTATCAGCAGAAAACCAATTGTAGACGAGACTCAATATCGTGTATTTCTGGTGATGGAGAGTTGTCTCCTGCTATTGTTGAAGTTATGTTCTGCATTTAGTGGACCTGTGGAGGCAGTGGTGTGGAACATTATAGGGTCCATGATAAGGGTCAGGCAGATATGTAAAGAATGTGCTAACATCACCTTCTGGGACAGCCAGACATTAGAAGGAAAAATTACCCATGGCAACTTGATAATGAGTGCAGGGATTCTGTTTGCAGCATCAAATCCTTCAAAGACACTGCGGGTCTTTTCAAATATGTATTGTCCTGCCATTACGAAACGGACATT
具体的，SEQ ID NO:13的序列信息如下所示：
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引物合成：根据获得的仿刺参雄性特异性片段设计雄性特异引物AJ(用于检测序列为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4的片段)，结合共有核苷酸序列(SEQ ID NO：13)设计引物Ref-1。具体序列见下表：
本实施例中的上述仿刺参雄性特异性别分子标记及性别特异引物通过以下方式获得，其步骤包括：
将雄性和雌性仿刺参样品各20只进行基因组重测序，测序深度为20×，将获得的数据使用bwa软件对比到参考基因组，Samtools去除重复，使用Delly和BAMStats软件对基因组进行基因组结构变异(SV)及基因组覆盖度(Coverage)的预测，最终筛选获得4个雄性特异片段，设计4对雄性特异引物。选择一段位于28S rRNA上的雌雄共有分子标记，设计一对雌雄共有引物。
DNA样品的制备：取在繁殖期通过排精卵观察确认性别的仿刺参雌雄性别各3只。采用传统的酚氯仿法抽提仿刺参体壁的基因组DNA，并用1.5％的琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(NanoDrop2000)进行质量和浓度检测。
PCR扩增：选择上述4对雄性特异引物以及1对雌雄共有引物对仿刺参雌雄各3个个体进行PCR检测，PCR扩增反应总体系20μL，包括2×Taq MasterMix 10μL，5对雄性特异上、下游引物(2μM)各1μL，1对雌雄共有上、下游引物(2μM)各0.5μL，模板DNA 50ng。
PCR反应程序为：95℃变性3min；95℃变性15s、58℃退火20s、72℃延伸30s、进行25个循环；72℃延伸10min；4℃保存PCR反应产物。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，4对雄性特异引物可在仿刺参雄性个体中获得特异性扩增条带，在雌性个体中均未检测到扩增片段；1对雌雄共有引物在仿刺参雌雄个体中均检测到269bp条带(图1)。
性腺组织学判定：将上述16只仿刺参性腺置于4％多聚甲醛中固定过夜，使用甲醇梯度脱水后用乙醇置换，乙醇、二甲苯透明、石蜡固定包埋、组织切片。用伊红/苏木精染色后，在显微镜下进行观察，进一步鉴定仿刺参性别。根据切片结果显示的生殖细胞类型，1、2、3号个体为确实为雄性仿刺参，5、6、7号个体为雌性仿刺参(图2)。
本实施例结合海参养殖场人工分选、分子鉴定结果和性腺组织学结果，三者吻合，证明筛选得到的4个性别特异分子标记均可准确的鉴定出仿刺参雌雄性别。
实施例2
本实施例提供利用实施例1中的4对仿刺参性别分子标记引物进行仿刺参性别鉴定的方法，包括下述步骤：
设计上述4对仿刺参雄性分子标记引物，具体过程参照实施例1；
仿刺参DNA样品制备：从山东威海仿刺参养殖场获得性成熟，排精排卵后的雌、雄性别仿刺参各12只。分别取体壁，同样采用传统的酚氯仿法制备基因组DNA样品。
PCR扩增验证：采用引物AJ1-AJ4及Ref-1对上述雌、雄各12个仿刺参基因组DNA样品进行PCR验证。PCR扩增反应总体系20μL，包括2×Taq MasterMix 10μL，5对雄性特异上、下游引物(2μM)各1μL，1对雌雄共有上、下游引物(2μM)各0.5μL，模板DNA 50ng。
PCR反应程序为：95℃变性3min；95℃变性15s、58℃退火20s、72℃延伸30s、进行25个循环；72℃延伸10min；4℃保存PCR反应产物。
PCR反应结束后，产物经琼脂糖凝胶电泳。电泳结果表明引物AJ1-AJ4在12只雄性仿刺参基因组DNA样品中均能扩增出条带。采用引物AJ-1扩增出特异性条带的大小是417bp、引物AJ-2扩增出特异性条带的大小304bp、引物AJ-3扩增出特异性条带的大小477bp、引物AJ-4扩增出特异性条带的大小427bp，在12只雌性仿刺参DNA样品中均不能扩增出条带。并且采用引物Ref-1扩增出的雌雄共有条带大小是269bp，在雌雄各12只仿刺参基因组DNA用品中均能扩增出条带(图3-图6)。表明分子标记AJ1-AJ4可用于仿刺参性别的鉴定，独立使用均可鉴定性别，不受仿刺参不同群体的影响，操作便捷，可以获得更加准确、可靠的性别鉴定结果，结果稳定。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.仿刺参性别分子标记，包括4个仿刺参雄性特异性分子标记中的至少一个，其特征在于，4个仿刺参雄性特异性分子标记的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的仿刺参性别分子标记，其特征在于，还包括一个仿刺参雌雄共有的分子标记，所述仿刺参雌雄共有的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
3.用于扩增权利要求1或权利要求2所述仿刺参性别分子标记的引物，其特征在于，包括用于扩增SEQ ID NO:1所示分子标记的引物对AJ-1，用于扩增SEQ ID NO:2所示分子标记的引物对AJ-2，用于扩增SEQ ID NO:3所示分子标记的引物对AJ-3，用于扩增SEQ ID NO:4所示分子标记的引物对AJ-4，和/或，用于扩增SEQ ID NO:13所示分子标记的引物对Ref-1；
所述引物对AJ-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，引物对AJ-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，引物对AJ-3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQID NO:10所示，引物对AJ-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，引物对Ref-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示。
4.权利要求1或权利要求2所述仿刺参性别分子标记在仿刺参雌雄性别鉴定中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成用于扩增所述仿刺参性别分子标记的引物对；
(2)制备仿刺参群体的基因组DNA样品；
(3)以步骤(2)中的基因组DNA样品为模板，采用步骤(1)设计的引物对进行PCR扩增，扩增反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳结果判断仿刺参性别。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述引物对为权利要求3所述的引物对。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中，根据电泳结果判断仿刺参性别的方法为：
若引物对Ref-1的电泳结果在269bp处具有条带，且引物对AJ-1电泳结果在417bp处、引物对AJ-2电泳结果在304bp处、引物对AJ-3电泳结果在477bp处或引物对AJ-4电泳结果在427bp处具有特异性DNA条带，则检测的仿刺参为雄性仿刺参；
若引物对Ref-1的电泳结果在269bp处具有条带，且引物对AJ-1电泳结果在417bp处、引物对AJ-2电泳结果在304bp处、引物对AJ-3电泳结果在477bp处或引物对AJ-4电泳结果在427bp处不具有特异性条带，则检测的仿刺参为雌性仿刺参。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，进行PCR扩增时，每20μL的PCR反应体系包括仿刺参基因组DNA样品50ng，上游引物0.5-1μL和下游引物0.5-1μL，2×Taq MasterMix10μL，加水补足反应体系至20μL。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，进行PCR扩增时，PCR反应程序是：95℃变性3min；95℃变性15s、58℃退火20s、72℃延伸30s、进行25个循环；72℃延伸10min。
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