CN114959056A - 一种鉴定雌性克氏原螯虾的ssr标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物分子标记筛选领域。具体涉及一种鉴定雌性克氏原螯虾的SSR标记及其应用。本发明主要步骤为(1)分别提取雌、雄性克氏原螯虾基因组DNA。(2)对雌雄群体克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测，设计相关引物扩增目片段，通过琼脂糖电泳检测目的片段是否被扩增出。(3)利用PAGE胶电泳检测并进行统计分析。通过PAGE胶电泳后显影、读带，对雌雄克氏原螯虾群体间的带型进行统计分析。结果表明：检测到的雌性和雄性克氏原螯虾群体样本显示所有雌性或雄性样本在PCM1237位点含有A、B、C三种等位基因，雌性克氏原螯虾基因型为纯合型或杂合型，而雄性克氏原螯虾基因型仅为纯合型。即杂合型一定是雌性克氏原螯虾。

Description

一种鉴定雌性克氏原螯虾的SSR标记及其应用
技术领域
本发明属于水产动物分子标记筛选技术领域，具体涉及一种鉴定雌性克氏原螯虾的SSR分子标记的筛选及其应用。
背景技术
克氏原螯虾(Procambarua clarkii)俗称小龙虾，隶属于十足目(Decapoda)、螯虾科(Ambaridae)，是存活于淡水中的一种甲壳类动物。克氏原虾原产于美国南部和墨西哥东北部，经由日本引入中国南京地区，后逐步向整个长江流域等地区扩散；由于其味道鲜美，营养丰富，深受人们喜爱，目前小龙虾已成为我国重要的经济水产品。
目前，虽然关于克氏原螯虾性别鉴定的分子标记已有相关的专利文献和报道。例如沈宇东等，2021提供了一种克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记及其筛选方法和应用(申请号2021112932524)，但是该文献中标记引物只能特异扩增出雄性克氏原螯虾带型，而雌性克氏原螯虾则不能扩增出特异性条带(即，无特异序列特征)。沈宇东等2021年专利申请所用的性别分子标记若未扩增出特异性条带，不能充分说明受检测的虾即为雌性，这种方法极易导致假阳性的结论。为此，本发明开发在雌性克氏原螯虾中能特异扩增出具有明确序列特征的标记，对克氏原螯虾雌性个体的鉴定具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种高效的鉴别雌性克氏原螯虾的分子标记及其应用。本发明筛选出的SSR分子标记PCM1237，不仅在雄、雌性克氏原螯虾中均能扩增出特异性条带，而且通过选择其特异带型能鉴定出的个体一定是雌性克氏原螯虾。因此，本发明的分子标记PCM1237可确切地鉴定出雌性克氏原螯虾。
本发明操作简便，实验步骤少、成本低，能广泛应用在生产实践中。经检测，该筛选及鉴定方法能有效鉴别雌性克氏原螯虾，是一种基于DNA序列能有效鉴别雌性克氏原螯虾的分子标记及筛选方法和鉴定方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种SSR标记在雌性克氏原螯虾鉴定中的应用，所述的应用包括下列步骤：
1)分别提取雌、雄性克氏原螯虾基因组DNA，每个性别样本至少提取150尾；
2)设计引物：根据克氏原螯虾基因组测序数据，利用Primer3软件设计正向引物PCM1237-F5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'；
3)对雌、雄群体克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测：
以正向引物PCM1237-F 5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'，
和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'扩增目的片段，利用琼脂糖电泳检测目的片段是否被扩增出；
4)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并进行统计分析：将扩增出的PCR产物用4％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，电泳胶板用0.2％的硝酸银溶液进行染色，用含有0.5％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液进行显影、漂洗和晾干，对上述各个群体进行带型统计分析；
5)检测到雌性和雄性克氏原螯虾群体样本，显示所有雌性或雄性样本在PCM1237位点是否含有A、B、C三种等位基因，判定雌性克氏原螯虾基因型为纯合型或杂合型，判定雄性克氏原螯虾基因型仅为纯合型，判定杂合型为雌性克氏原螯虾；
PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后；72℃再延伸7min；4℃保存。
进一步，本发明所述的应用还包括用SSR标记特异鉴定和筛选雌性克氏原螯虾。
本发明根据克氏原螯虾的基因组序列(Shi et al.,2018)，通过分析微卫星特征序列，设计了2873对SSR标记引物。采集雌、雄性克氏原螯虾群体样本(各150尾)，提取基因组DNA，利用上述PCR扩增条件对2873对引物进行扩增与多态性筛选，得到多态性标记PCM1237。
通过对SSR标记PCM1237的PCR产物的带型分析，归纳与总结，得出被测样本是否为雌性克氏原螯虾。
本发明具有以下优点：
(1)本发明鉴定结果准确；雌性克氏原螯虾与雄性克氏原螯虾在SSR标记PCM1237位点的基因型差异显著。
(2)本发明的可重复性高：本发明所得分子标记为显性标记，操作简便，成本低，实验周期短，可应用于雌性克氏原螯虾的规模化鉴别，在胚胎期和幼虾期均可高效地应用。
附图说明
图1：以2019年采集雌、雄性克氏原螯虾群体样本DNA为模板，用PCM1237标记，利用PCR方法扩增产物的PAGE电泳胶图。
图2：以2020年采集雌、雄性克氏原螯虾群体样本DNA为模板，用PCM1237标记，利用PCR方法扩增产物的PAGE电泳胶图。附图标记说明：不同性别的克氏原螯虾用黑线隔开。
图3：以2021年取样2个地域的雌、雄性克氏原螯虾群体的DNA为模板，用PCM1237标记，利用PCR方法扩增产物的PAGE电泳胶图。附图标记说明：不同地域来源克氏原螯虾用蓝线隔开，不同性别来源的克氏原螯虾用黑线隔开。
具体实施方式：
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的是本发明筛选的分子标记引物组合。
序列表SEQ ID NO:3本发明筛选的分子标记引物组合扩增的PCR产物A基因型的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO:4本发明筛选的分子标记引物组合扩增的PCR产物B基因型的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO:5本发明筛选的分子标记引物组合扩增的PCR产物C基因型的核苷酸序列
实施例1：
一种SSR标记在雌性克氏原螯虾鉴定中的应用，所述的应用包括下列步骤：
(1)提取雌雄克氏原螯虾群体的基因组DNA，每个群体收集不少于150尾的基因组DNA样本。
(2)根据克氏原螯虾基因组测序的序列片段，利用Primer3软件设计正向引物PCM1237-F5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'。所述分子标记为SSR标记。
(3)PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后；72℃再延伸7min；4℃保存。
(4)对雌雄克氏原螯虾群体的DNA样本进行PCR检测：利用引物PCM1237扩增目的片段，并用琼脂糖电泳检测其目的片段是否被扩出。
(5)利用PAGE胶进行电泳检测并进行统计分析：将扩增出的PCR产物用4％的PAGE胶电泳后，再用0.2％硝酸银对胶板进行染色，最后用含有0.5％甲醛的0.5M氢氧化钠溶液对胶板进行显影、漂洗和晾干，之后对各个群体进行带型分析。
(6)统计分析显示：所有雌性或雄性克氏原螯虾群体样本在PCM1237位点含有A、B、C三种等位基因，但雌性克氏原螯虾基因型含有纯合型或杂合型，而雄性克氏原螯虾基因型仅为纯合型，即杂合型个体一定为雌性。
(7)采集雌、雄克氏原螯虾群体，各群体采样至少150尾。
(8)本标记适用于鉴定雌性克氏原螯虾群体，用于鉴定和筛选出雌性克氏原螯虾个体。
(9)引物设计与筛选：根据克氏原螯虾的基因组序列(Shi et al.,2018)，通过分析微卫星特征序列，设计了2873对SSR标记引物。通过对雌雄克氏原螯虾群体样本采集，并提取基因组DNA，利用上述PCR扩增条件对2873对引物进行扩增与多态性筛选得到多态性标记PCM1237。
(10)通过对SSR标记PCM1237的PCR产物的带型分析，归纳与总结，得出杂合型的个体即为雌性克氏原螯虾。
本发明2019年自武汉市白沙洲水产品批发市场购买克氏原螯虾，分别采集150尾克氏原螯虾雌虾和150尾克氏原螯虾雄虾并取样。
一种鉴定雌性克氏原螯虾群体的分子标记的方法，其步骤为：
1.基因组DNA提取：
(1)剪取克氏原螯虾肌肉样品50-100mg于1.5mL离心管内，用剪刀剪碎。
(2)向剪碎样本中加入蛋白酶K(20mg/mL)10μL，组织裂解液600μL混匀，55℃水浴4h，每隔30min颠倒混匀一次，待肌肉组织完全被裂解后取出，于冰上静置冷却至室温。
(3)向裂解样品加入7.5M的乙酸铵溶液200μL，上下颠倒使乙酸铵溶液与裂解样品溶液充分混匀后在冰上静置10min；在4℃,12000r/min条件下离心10min，转移750μL上清液于新离心管内，加入等体积的异丙醇上下颠倒混匀2min并做好标记。
(4)在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃上清液留沉淀，向含有沉淀的离心管内加入75％乙醇1mL洗涤沉淀。
(5)在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃上清液留沉淀，向含有沉淀的离心管内加入无水乙醇1mL再次洗涤沉淀。
(6)在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃上清液晾干沉淀，向含有沉淀的离心管内加入超纯水(d2H2O)100μL溶解沉淀，待沉淀完全溶解后得到克氏原螯虾总DNA溶液。
(7)组织裂解液每100mL组分如下：1M Tris-HCL 1mL；0.5M EDTA 20mL；十二烷基硫酸钠2g。蛋白酶K(20mg/mL)于上海生工生物技术服务有限公司订购，其他化学试剂为国药集团订购保存使用。
2.引物设计：根据克氏原螯虾基因组测序的片段序列，利用Primer3软件设计了如下SSR标记PCM1237的引物组合，其中引物组合的正向引物PCM1237-F5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'。
3.PCR扩增：PCR扩增体系总体积为20μL，包括4μL 10×Buffer，0.2μLdNTPs(10mM),0.1μL rTaq酶，微卫星上下游引物(10μmol/L)各1μL，提取的DNA模板2μL，无菌水11.7μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
4.对扩增产物的检测：扩增产物用5×TBE(每1000mL中含54g Tris·base、27.5g硼酸、4.75gNa2EDTA·2H2O)缓冲液配制的4％丙烯酰胺电泳胶，电泳液为1×TBE，电泳条件为2000V，200mA，100W，电泳过程每隔5min点一道样品，最后一道点样后电泳30min。取出电泳胶板用0.2％硝酸银染色10min，用含有0.3％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液显影后清水冲洗干净、晾干、读带。
5.结果分析：雌性克氏原螯虾出现的基因型为纯合型或杂合型(样本数量为150份)，雄性克氏原螯虾仅出现纯合型基因型(样本数量为150份)。根据电泳图与统计数据可以发现检测雌、雄克氏原螯虾群体中PCM1237位点的基因型差异明显：即，雌性克氏原螯虾基因型含有纯合型或杂合型，而雄性克氏原螯虾基因型仅为纯合型；即杂合型克氏原螯虾个体一定为雌性(见图1)。
实施例2：
为验证PCM1237可以鉴定雌性克氏原螯虾群体的特异性，进行了第一次重复验证试验。
2020年5月到华中农业大学双水双绿研究院监利基地采集克氏原螯虾群体雌、雄虾分别取样，剪取尾部肌肉于无水乙醇中-20℃保存，利用分子标记按下述方法进行雌性克氏原螯虾群体的雌、雄性别鉴定。
一种鉴定雌性克氏原螯虾群体的分子标记的方法，其步骤如下：
1.提取克氏原螯虾基因组DNA：方法和步骤同实施例1
2.引物设计：根据克氏原螯虾基因组测序的序列，利用Primer3软件设计SSR标记PCM1237的引物，PCM1237-F 5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'和PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'。
3.PCR扩增：PCR扩增体系为20μL，包括4μL 10×Buffer，0.2μL dNTPs(10mM),0.1μL rTaq酶，微卫星上下游引物(10μmol/L)各1μL，提取的DNA模板2μL，无菌水11.7μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
4.产物检测：扩增产物用5×TBE(每1000mL中含54g Tris·base、27.5g硼酸、4.75gNa2EDTA·2H2O)缓冲液配制的4％丙烯酰胺电泳胶，电泳液为1×TBE，电泳条件为2000V，200mA，100W，电泳过程每隔5min点一道样品，最后一道点样后电泳30min。取出电泳胶板用0.2％硝酸银染色10min，取出用含有0.3％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液显影，清水冲洗干净、晾干、读带。
5.结果分析：雌性克氏原螯虾出现的基因型为纯合型或杂合型(样本数量为23份)，雄性克氏原螯虾仅出现纯合型基因型(样本数量为33份)。根据电泳图与统计数据可以发现检测雌、雄群体中PCM1237位点的基因型存在明显差异：雌性克氏原螯虾基因型含有纯合型或杂合型，而雄性克氏原螯虾基因型仅为纯合型，即杂合型个体一定为雌性(见图2)。
实施例3：
为验证PCM1237标记引物可以鉴定雌性克氏原螯虾群体的特异性，因此进行第二次重复验证试验。
2021年6月选取来自2个地理区域的克氏原螯虾雌雄个体，采集DNA样本。克氏原螯虾具体来源如下：
表1采集2个地理区域的克氏原螯虾雌、雄性个体的DNA样本
Figure BDA0003643169820000061
按雌雄群体分开取样，剪取虾尾部肌肉于无水乙醇中并于-20℃保存，利用分子标记按下述方法进行雌性克氏原螯虾群体鉴定。
一种鉴定雌性克氏原螯虾群体的分子标记方法，步骤如下：
1.克氏原螯虾基因组DNA提取：具体步骤同实施例1。
2.引物设计：根据克氏原螯虾基因组测序的片段序列，利用Primer3软件设计SSR标记PCM1237的正向引物为PCM1237-F 5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'。
3.PCR扩增：PCR扩增体系为20μL，包括4μL 10×Buffer，0.2μL dNTPs(10mM),0.1μL rTaq酶，微卫星上下游引物(10μmol/L)各1μL，提取的DNA模板2μL，无菌水11.7μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
4.产物检测：扩增产物用5×TBE(每1000mL中含54g Tris·base、27.5g硼酸、4.75gNa2EDTA·2H2O)缓冲液配制的4％丙烯酰胺电泳胶，电泳液为1×TBE，电泳条件为2000V，200mA，100W，电泳过程每隔5min点一道样品，最后一道点样后电泳30min。取出电泳胶板用0.2％硝酸银染色10min，取出用含有0.3％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液显影，清水冲洗干净、晾干、读带。
5.结果与分析：雌性克氏原螯虾出现的基因型为纯合型或杂合型，雄性克氏原螯虾仅出现纯合型基因型。根据电泳图与统计数据可以发现检测雌、雄性克氏原螯虾群体中PCM1237位点的基因型存在明显差异，即：雌性克氏原螯虾基因型为纯合型或杂合型；雄性克氏原螯虾基因型仅为一种纯合型；杂合型个体一定为雌性克氏原螯虾(见图3)。
主要参考文献
1.彭波等.克氏原螯虾体征性状与肌肉质量的相关及通径分析[J].水产科学,2021,40(5):8；
2.沈宇东等，一种克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记及其筛选方法和应用，中国发明专利申请公开文献；申请号202111293252 4，2021年；
3.REN,X.,PENG,G.H.,ZHANG H.Y.,PENG,B.&BAI,X.F.,2022.Sex differencesin the disease resistance of red swamp crayfish(Procambarus clarkii).Aquaculture,548:2；
4.SHI,L.L.,YI,S.K.&LI,Y.H.,2018.Genome survey sequencing of red swampcrayfish Procambarus clarkii.Molecular Biology Reports,45:799-806。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种鉴定雌性克氏原螯虾的SSR分子标记及其应用
<141> 2022-05-13
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<400> 5
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agagacagac aaagtgtgag tgtgccaggg atctgtcaca tctcccaggg gtggtaagca 120
cagagagggt gaagaagtgt gcg 143

Claims (2)

1.一种SSR标记在雌性克氏原螯虾鉴定中的应用，其特征在于，所述的应用包括下列步骤：
1)分别提取雌、雄性克氏原螯虾基因组DNA，每个性别样本至少提取150尾；
2)设计引物：根据克氏原螯虾基因组测序数据，利用Primer3软件设计正向引物PCM1237-F 5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'；
3)对雌、雄群体克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测：
以正向引物PCM1237-F 5'-CGCACACTTCTTCACCCTCT-3'，和反向引物PCM1237-R 5'-AGGAGTCTTTTAACATGAGAGATTTT-3'扩增目的片段，利用琼脂糖电泳检测目的片段是否被扩增出；
4)利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并进行统计分析：将扩增出的PCR产物用4％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，电泳胶板用0.2％的硝酸银溶液进行染色，用含有0.5％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液进行显影、漂洗和晾干，对上述各个群体进行带型统计分析；
5)检测到雌性和雄性克氏原螯虾群体样本，显示所有雌性或雄性样本在PCM1237位点是否含有A、B、C三种等位基因，判定雌性克氏原螯虾基因型为纯合型或杂合型，判定雄性克氏原螯虾基因型仅为纯合型，判定杂合型为雌性克氏原螯虾；
PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后；72℃再延伸7min；4℃保存。
2.一种SSR标记在雌性克氏原螯虾鉴定中的应用，其特征在于，所述的应用还包括用SSR标记特异鉴定和筛选雌性克氏原螯虾。
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