CN110846419B - 用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的ssr引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用,其包括正向引物P3‑89F和反向引物P3‑89R,其中正向引物P3‑89F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列,反向引物P3‑89R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。本发明可以实现欧鳇和闪光鲟间的快速种间鉴定,且鉴定结果准确。
Description
技术领域
本发明属于水产动物种质鉴定领域,具体涉及用于欧鳇和闪光鲟种间鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用。
背景技术
鲟鱼,即鲟形目鱼类(Acipenseriformes),是古老的软骨硬磷鱼类,起源于白垩纪时期,迄今已有2亿年的历史,素有“水中活化石”之称。其骨可成胶、肉质细腻、味道鲜美,营养价值高,尤其是鲟鱼子酱富含优质蛋白质、氨基酸和微量元素,被誉为“黑色黄金”,与鹅肝、松露并称为世界三大美食。随着鲟鱼养殖业的快速发展,我国已经成为世界鲟鱼养殖第一大国。目前生产鱼子酱的养殖品种主要以杂交鲟和外来鲟为主,其中外来鲟欧鳇(Husohuso)和闪光鲟(Acipenser stellatus)生产的鱼子酱价值最高,在我国人工养殖的比重逐年增加,进一步的,随着鱼子酱进出口贸易的法制化,鱼子酱品种鉴定越来越收到重视。
此外,欧鳇和闪光鲟等外来鲟的大范围养殖中可能会出现,导致其与我国特有的中华鲟、长江鲟、施氏鲟等进行杂交繁殖,造成遗传污染。
综上所述,对欧鳇和闪光鲟等进行快速、准确的物种鉴定具有重要的意义。但由于欧鳇和闪光鲟属于多倍体鲟鱼,遗传鉴定较二倍体鱼类更为复杂,截止目前,有关欧鳇和闪光鲟种质、种间和相关的副产品等的简便、快速和有效的鉴定方法尚未建立。
发明内容
本发明针对上述现有技术中的缺陷,提供了一种用于欧鳇和闪光鲟种间鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用,其可以实现欧鳇和闪光鲟间的快速种间鉴定,且鉴定结果准确。
本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下:
一方面,提供了一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组,其包括正向引物P3-89F和反向引物P3-89R,其中正向引物P3-89F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列,反向引物P3-89R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
优选的,所述正向引物P3-89F可用荧光染料进行标记。
一方面,提供了一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的试剂盒,其包括上述SSR引物对组。
优选的,所述试剂盒还包括:水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液中的一种或多种。
一方面,提供了一种欧鳇和闪光鲟间的物种鉴定方法,其包括如下步骤:
S1、提取待鉴定的欧鳇和闪光鲟的DNA样本;
S2、合成上述SSR引物对组,且利用所述SSR引物对组、以步骤S1中获取的DNA样本为模板进行PCR扩增;
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行检测,以获得PCR扩增产物多态性原始数据;
以及S4、对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析,以得出测序峰图数据,并根据所述测序峰图数据对欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
优选的,在进行PCR扩增时,所述正向引物P3-89F的退火温度为50~60℃;所述反向引物P3-89R的退火温度为50~58℃。
优选的,在进行PCR扩增时,所述正向引物P3-89F与反向引物P3-89R的退火温度均为52℃。
另一方面,还提供一种上述SSR引物对组和/或上述试剂盒和/或上述鉴定方法在欧鳇和闪光鲟的种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
另一方面,还提供一种分离的SSR标志物,其通过上述SSR引物对组扩增获得。
优选的,所述SSR标志物包括1个微卫星核心序列TAG。
本发明可实现欧鳇和闪光鲟间的快速种间鉴定,且鉴定结果准确。
附图说明
图1为本发明的SSR引物在欧鳇1号个体的扩增结果;
图2为本发明的SSR引物在欧鳇2号个体的扩增结果;
图3为本发明的SSR引物在欧鳇3号个体的扩增结果;
图4为本发明的SSR引物在欧鳇4号个体的扩增结果;
图5为本发明的SSR引物在欧鳇5号个体的扩增结果;
图6为本发明的SSR引物在欧鳇6号个体的扩增结果;
图7为本发明的SSR引物在闪光鲟1号个体的扩增结果;
图8为本发明的SSR引物在闪光鲟2号个体的扩增结果;
图9为本发明的SSR引物在闪光鲟3号个体的扩增结果;
图10为本发明的SSR引物在闪光鲟4号个体的扩增结果;
图11为本发明的SSR引物在闪光鲟5号个体的扩增结果;
图12为本发明的SSR引物在闪光鲟6号个体的扩增结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1:
本实施例提供了一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组,其包括正向引物P3-89F和反向引物P3-89R,其中P3-89F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(即TAGCCACCACTGCAAAACAG),P3-89R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列(即GCTTCCAGGAAACAGTGGAA);进一步的,所述正向引物P3-89F可用荧光染料进行标记。
实施例2:
本实施例提供了一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的试剂盒,其包括实施例一所述的引物对组、水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液和分子量标记物中的一种或多种。
实施例3:
本实施例提供了一种欧鳇和闪光鲟间的物种鉴定方法,其包括如下步骤:
S1、采用经典的高盐法提取待鉴定的至少一个(优选为6个)欧鳇和至少一个(优选为6个)闪光鲟的DNA样本,稀释至100ng/ul,备用;所述DNA样本来自粘液、鳍条、鱼肉、鱼子酱中的一项或几项;
S2、通过primer premier 5.0等软件设计出如实施例1所述的SSR引物对组,且其中正向引物P3-89F添加通用M13接头序列(TGTAAAACGACGGCCAGT),同时另外合成带T AMRA荧光基团的M13荧光接头引物;如实施例1所述的SSR引物对组、M13荧光接头引物合成后,以步骤S1中获取的DNA样本为模板,按照下述PCR反应体系和扩增程序进行P CR扩增:
A.PCR反应体系:
B.PCR扩增程序:
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳,根据电泳结果进行浓度鉴定;再使用DNA测序仪ABI 3730xl对所述PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测,以获得PCR扩增产物多态性原始数据;
以及S4、使用genemarker软件对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析,以得出测序峰图数据,并根据所述测序峰图数据对欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
同时,同样采用上述正向引物P3-89F和反向引物P3-89R对俄罗斯鲟
(Acipenser gueldenstaedti)和中华鲟(Acipenser sinensis),参照实施例4中的方法获得俄罗斯鲟和中华鲟PCR扩增产物多态性原始数据,并根据PCR扩增产物多态性原始数据得出测序峰图数据,表1示出通过所述正向引物P3-89F和反向引物P3-89R对欧鳇、闪光鲟、俄罗斯鲟和中华鲟样品进行PCR扩增后的扩增结果,图1-6示出了6个欧鳇个体的测序峰图,图7-12示出了6个闪光鲟个体的测序峰图。
表1正向引物P3-89F和反向引物P3-89R扩增结果
其中,H表示欧鳇个体;ASt表示闪光鲟个体;AG表示俄罗斯鲟个体;AS表示中华鲟个体,※表示该等位基因存在。
从表1,图1-12中可以看出,通过P3-89F、P3-89R扩增所获得的产物中,俄罗斯鲟和中华鲟均具有多个等位基因,而欧鳇为单态,只有一个等位基因,大小为265bp,闪光鲟为单态,只有一个等位基因,大小为262bp,二者之间相差一个微卫星核心序列TAG,由此,对于欧鳇和闪光鲟而言,其扩增结果简单易读,且结果精确,可利用上述P3-89F、P3-89R引物对组进行欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定或种质鉴定或家系管理。
实施例5:
本实施例提供了实施例1中所述SSR引物对组和/或实施例2中所述试剂盒和/或实施例3中所述鉴定方法在欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
实施例6:
本实施例还提供了一种分离的SSR标志物,其通过实施例1中的引物对组扩增获得,且所述SSR标志物包括1个微卫星核心序列TAG。
需要说明的是,上述实施例1至5中的技术特征可进行任意组合,且组合而成的技术方案均属于本发明的保护范围。
综上所述,本发明具有以下优点:
1)本发明提供的引物对组可用于欧鳇和闪光鲟的种间鉴定,从而在对外贸易、人工繁殖、野外监测等过程中对两个物种进行种质鉴定,保证遗传物质或副产品鱼子酱或鱼肉的纯度。
2)通过本发明提供的引物对组获得PCR扩增结果简单易读,从中可获知欧鳇等位基因片段长265bp,闪光鲟等位基因片段长262bp,且成本低,易操作,可实现欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定,可大大节约鉴定的时间和测序的成本,且鉴定结果准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组,其特征在于,包括正向引物P3-89F和反向引物P3-89R,其中正向引物P3-89F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列,反向引物P3-89R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列;
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为AGCCACCACTGCAAAACAG;
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为GCTTCCAGGAAACAGTGGAA。
2.如权利要求1所述的SSR引物对组,其特征在于,所述正向引物P3-89F可用荧光染料进行标记。
3.一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的SSR引物对组。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液中的一种或多种。
5.一种欧鳇和闪光鲟间的物种鉴定方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、提取待鉴定的欧鳇和闪光鲟的DNA样本;
S2、合成如权利要求1所述的SSR引物对组,且利用所述SSR引物对组、以步骤S1中获取的DNA样本为模板进行PCR扩增;
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行检测,以获得PCR扩增产物多态性原始数据;
以及S4、对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析,以得出测序峰图数据,并根据所述测序峰图数据对欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
6.如权利要求5所述的鉴定方法,其特征在于,在进行PCR扩增时,所述正向引物P3-89F的退火温度为50~60℃;所述反向引物P3-89R的退火温度为50~58℃。
7.如权利要求6所述的鉴定方法,其特征在于,在进行PCR扩增时,所述正向引物P3-89F与反向引物P3-89R的退火温度均为52℃。
8.如权利要求1所述的SSR引物对组和/或如权利要求3所述的试剂盒和/或如权利要求5中所述的鉴定方法在欧鳇和闪光鲟的种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
9.一种分离的SSR标志物,其特征在于,其通过权利要求1所述的SSR引物对组、以欧鳇的DNA样本为模板扩增获得。
10.如权利要求9所述的SSR标记物,其特征在于,所述SSR标志物包括1个微卫星核心序列TAG。
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董传举.四种鲟鱼线粒体PCR-RFLP 鉴定方法的研究.《生物技术通报》.2014,第78-85页. * |
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Publication number | Publication date |
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CN110846419A (zh) | 2020-02-28 |
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