CN104651525B - 一种用于毛蚶家系鉴定的多重pcr方法 - Google Patents
一种用于毛蚶家系鉴定的多重pcr方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于毛蚶家系鉴定的多重PCR方法，该方法包括如下步骤：提取亲本和子代DNA；使用11个微卫星位点及带荧光标记的M13（‑21）通用引物，对提取的DNA样本进行多重PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进行亲缘关系鉴定。本发明的方法适用于进行大范围增殖放流群体亲本与子代间遗传关系的确认，以及大规模的人工良种培育实验，具有快速、准确、高通量的特点。通过微卫星标记鉴定所获得的谱系记录，不仅可以为毛蚶的良种培育提供有利的辅助育种手段，而且可以为评估增殖放流效果提供有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产动物家系鉴定方法，特别是涉及了一种采用多重PCR进行毛蚶家系鉴定的方法。
背景技术
家系鉴定又称为系谱分析，是对个体间亲缘关系的一种判断分析。了解一个群体的系谱特征，不仅在群体遗传学，保护遗传学，生态学等领域内具有重要的理论意义，而且在良种培育、种质资源保护、人工放流苗种标记等领域具有重要的应用价值。
微卫星标记是一种共显性的分子标记，具有变异程度高，在基因组中分布广泛，符合孟德尔遗传，易于PCR扩增等特点，是家系鉴定中最常使用的分子标记。利用微卫星标记进行家系鉴定，传统的分析方法是对每个标记的PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，利用银染的方式对电泳结果进行显色，进而获得所需要的目的条带。这种方法一方面存在处理通量低的问题，不适合于大量样本的分析，另一方面，基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的微卫星基因型分型的精度，也满足不了家系鉴定对基因型分型的精确要求，尤其在样本量较大的情况下，为避免随机误差造成的影响，对分析方法的要求也更为严格。目前，利用多重PCR的方式，使用荧光标记引物，结合毛细管电泳技术，提高处理通量和分型精度，实现数据的自动判读，是目前微卫星标记应用的一个主流趋势。
相比于凝胶电泳，毛细管电泳使用液态基质，具有速度快，精读高，可实现自动上样的技术优点。毛细管电泳采用荧光标记的方式对位点进行区分，不同的荧光染料在被激光激发后，会释放出不同波长的荧光信号，利用虚拟滤镜技术，可使得不同荧光获得区分。这样，在同一根毛细管中可以同时混合多个位点，大大增加了处理通量。
多重PCR技术是通过一个PCR反应同时扩增两个或者两个以上标记位点的技术手段。相比于普通PCR，多重PCR的技术优势显而易见，不仅可以提高检测的速度和通量，而且能够有效节约时间和成本。在水产动物的常见经济种类中，如海鲈（Lateolabrax japonicus），大菱鲆（Scophthalmus maximus），斑点叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）等，均成功的开发出了多重PCR反应试剂盒，并在生产实践中获得了应用。
作为我国黄渤海的习见种，毛蚶（Scapharca subcrenata）长期以来都是北方沿海重要经济种类。近年来，由于资源过渡开发和利用，我国毛蚶的自然资源面临着巨大的压力，毛蚶目前已经被列为黄渤海人工增殖放流的品种之一，相关的良种培育工作也已经开始实施。基于上述情况，获得足够数目，满足育种及放流标记实际要求的毛蚶微卫星多重PCR体系具有现实紧迫性。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种高通量、准确率高的采用加尾引物进行毛蚶家系鉴定的多重PCR方法，可快速、准确的对未知亲缘关系的毛蚶亲本与子代间进行家系鉴定。
本发明具体的技术方案如下：
一种用于毛蚶家系鉴定的多重PCR方法，其特征在于包括如下步骤：提取亲本和子代DNA，按照下表中的序列合成正向引物，反向引物或反向加尾引物，以及带荧光标记的M13（-21）通用引物；
| 引物编号 | 正向引物序列 (5'-3') | 反向引物序列 (5'-3') | 片段大小(bp) |
| Sk01 | TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTTCATTGGGCAGTCCTTA | GGAACACACAAATACACATACG | 160-214 |
| Sk02 | TGTAAAACGACGGCCAGTATTGTCAGCGTTTCGGTA | ACCAACAACAAAAATACAGT | 378-448 |
| Sk03 | TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAATAAAGGGATAAACTC | GAGCGGATAACAATTTCAGATAATTTGGTAATGGTCTT | 258-360 |
| Sk04 | TGTAAAACGACGGCCAGTATAGTCACCATATTCCTACAA | TATACTCTCTATTTTACGCTC | 238-274 |
| Sk05 | TGTAAAACGACGGCCAGTTTTAACCACGTGTAAACGAAA | TTCAAATAGCTTAGATTCCGA | 443-523 |
| Sk06 | TGTAAAACGACGGCCAGTAACAACTTTGAACTATAACT | AAACAGTTCTAACCAGTC | 403-436 |
| Sk07 | TGTAAAACGACGGCCAGTTATTAGTGGAGTTGGTTTCGTC | ATTCACCGCTGGGTATTT | 300-388 |
| Sk08 | TGTAAAACGACGGCCAGTAGTCAGTAATTGTAGTCTTGT | GAGCGGATAACAATTTCACATAAATAGCTGGGACTC | 259-291 |
| Sk09 | TGTAAAACGACGGCCAGTGTAAGCAAATTGGACATC | GAGCGGATAACAATTTCTTATGCAACACTTCCAGTA | 430-536 |
| Sk14 | TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGTTTTGTTTAACCACG | TCAAATAGCTTAGATTCCGA | 348-444 |
| Sk15 | TGTAAAACGACGGCCAGTTGGCAAGATAGGTATGTGCAA | TAGGCAGACCAATCGTGAAGC | 238-314 |
使用合成的引物对及带荧光标记的M13（-21）通用引物，对提取的DNA样本进行多重PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进行亲缘关系鉴定。
所述正向引物的5’端添加M13（-21）通用引物序列。
所述反向加尾引物的5’端添加序列GAGCGGATAACAATTTC。由于正向引物添加M3（-21）通用引物序列后，正反向引物的Tm值可能会有较大的差异，因此，为保证位点扩增的效率，向部分位点的反向引物的5’端添加序列GAGCGGATAACAATTTC，以达到满意的扩增效果。
所述的荧光标记为FAM，VIC，NED，PET中的一种，荧光标记被添加在单独合成的M13（-21）通用引物序列的5’端。
所述多重PCR扩增按照下表中所述的引物体系和条件进行，每组多重PCR反应体系中，均加入带有一种荧光标记的M13（-21）通用引物序列，通用引物序列浓度为0.15 μM。
| 多元组合 | 引物编号 | 退火温度 | 上游引物浓度 | 下游引物浓度 |
| Panel A | Sk01 | 54 | 0.04μM | 0.15μM |
| Sk02 | 54 | 0.06μM | 0.15μM | |
| Sk03 | 54 | 0.08μM | 0.15μM | |
| M13（-21） | 53 | —— | 0.15μM | |
| Panel B | Sk04 | 54 | 0.04μM | 0.15μM |
| Sk05 | 54 | 0.06μM | 0.15μM | |
| Sk06 | 54 | 0.08μM | 0.15μM | |
| M13（-21） | 53 | —— | 0.15μM | |
| Panel C | Sk07 | 54 | 0.06μM | 0.15μM |
| Sk08 | 54 | 0.06μM | 0.15μM | |
| Sk09 | 54 | 0.06μM | 0.15μM | |
| M13（-21） | 53 | —— | 0.15μM | |
| Panel E | Sk14 | 54 | 0.06μM | 0.15μM |
| Sk15 | 54 | 0.08μM | 0.15μM | |
| M13（-21） | 53 | —— | 0.15μM |
所述多重PCR扩增的反应程序分为两步，前35个循环使用54℃的退火温度，后8个循环使用53℃的退火温度。
所述对亲本和子代进行亲缘关系鉴定的方法是对扩增结果进行毛细管荧光电泳，并对扩增产物的荧光信号进行检测，通过软件对电泳结果和亲缘关系进行分析。
所述的软件选自GeneMapper和Cervus。
本发明具有以下优点：
（1）通量高：本发明成功开发了8个加尾标记，利用添加M13（-21）尾巴的方法，并通过优化PCR反应条件，将11个微卫星位点组成了4组多重PCR体系，使微卫星标记基因分型的工作量降低了2/3，节省了大量的时间和费用。
（2）准确率高：经过已知遗传背景的家系实际验证，使用本发明5个以上的标记对毛蚶家系进行鉴定，其鉴定成功率可达97%。
本发明的方法适用于进行大范围增殖放流群体亲本与子代间遗传关系的确认，以及大规模的人工良种培育实验。通过微卫星标记鉴定所获得的谱系记录，不仅可以为毛蚶的良种培育提供有利的辅助育种手段，而且可以为评估增殖放流效果提供有力的技术支持。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述，但本发明不限于此。
实施例1：
（1）选取性腺成熟好的3龄毛蚶亲贝进行人工催产，通过人工受精的方式建立1个由30个亲本组成的混交家系，收集该家系的全部亲本个体（30个）和部分子代个体（300个）。
（2）使用苯酚氯仿法提取每个亲本的DNA样本，使用螯合树脂方法提取幼虫DNA。
（3）根据表1中所提供的引物序列信息合成引物。
（4）使用表2中的引物组合方式进行多重PCR扩增，多重PCR的反应体系如表3所示。
PCR的反应程序为：94℃ 3min；94℃变性45s，54℃退火75s，72℃延伸90s，35个循环；94℃变性45s，53℃退火75s，72℃延伸90s，8个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
表1 用于毛蚶家系鉴定的微卫星标记引物序列
表2 用于毛蚶家系鉴定的微卫星标记多重PCR引物体系
| 多元组合 | 引物编号 | 退火温度 | 上游引物浓度 | 下游引物浓度 |
| Panel A | Sk01 | 54 | 0.04μM | 0.15μM |
| Sk02 | 54 | 0.06μM | 0.15μM | |
| Sk03 | 54 | 0.08μM | 0.15μM | |
| M13（-21） | 53 | — | 0.15μM | |
| Panel B | Sk04 | 54 | 0.04μM | 0.15μM |
| Sk05 | 54 | 0.06μM | 0.15μM | |
| Sk06 | 54 | 0.08μM | 0.15μM | |
| M13（-21） | 53 | — | 0.15μM | |
| Panel C | Sk07 | 54 | 0.06μM | 0.15μM |
| Sk08 | 54 | 0.06μM | 0.15μM | |
| Sk09 | 54 | 0.06μM | 0.15μM | |
| M13（-21） | 53 | — | 0.15μM | |
| Panel E | Sk14 | 54 | 0.06μM | 0.15μM |
| Sk15 | 54 | 0.08μM | 0.15μM | |
| M13（-21） | 53 | — | 0.15μM |
表3 用于毛蚶家系鉴定的微卫星标记多重PCR反应体系
| 组分 | 体积（μL） |
| 10×PCR Buffer（Mg2+ Free） | 1 |
| dNTP Mixture（各2.5mM） | 0.8 |
| MgCl2（25mM） | 0.6 |
| 模板DNA（50~100ng） | 1 |
| 上游引物混合物a | 1 |
| 下游引物混合物a | 1 |
| 带荧光标记的M13（-21）引物（1.5μM） | 1 |
| 强化组分b | 2 |
| Hot Start DNA Polymerase（5U·μL-1） | 0.05 |
| ddH2O | up to 10 μL |
a：反应体系中引物混合物的浓度和组分见表2所示；
b：强化组分成分：PEG6000：30%（w/v），BSA：2.5μg/μl，Betaine：5M。
（5）PCR扩增产物经适当稀释后，与分子量内标混合，在ABI 3130测序仪上进行毛细管电泳分析。
（6）使用Genemapper软件分析电泳结果，得到每个个体微卫星标记的基因型数据；使用Cervus 3.0软件对亲本和子代个体进行亲缘关系分析，计算每个子代最可能的父母本个体；根据分析结果，将置信度最高的雄性和雌性个体确认为子代个体亲本。
结果显示，在全部的330个（30个亲本和300个子代）个体中，在95%置信度下，运用5个位点即能成功鉴定97%的子代个体，当运用6个位点后，子代的鉴定率可达到100%。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
<110> 中国海洋大学
<120> 一种用于毛蚶家系鉴定的多重PCR方法
<160> 22
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk01正向引物序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtct tttcattggg cagtcctta 39
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk01反向引物序列
<400> 2
ggaacacaca aatacacata cg 22
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk02正向引物序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtat tgtcagcgtt tcggta 36
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk02反向引物序列
<400> 4
accaacaaca aaaatacagt 20
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk03正向引物序列
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtgg gaataaaggg ataaactc 38
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk03反向引物序列
<400> 6
gagcggataa caatttcaga taatttggta atggtctt 38
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk04正向引物序列
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtat agtcaccata ttcctacaa 39
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk04反向引物序列
<400> 8
tatactctct attttacgct c 21
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk05正向引物序列
<400> 9
tgtaaaacga cggccagttt taaccacgtg taaacgaaa 39
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk05反向引物序列
<400> 10
ttcaaatagc ttagattccg a 21
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk06正向引物序列
<400> 11
tgtaaaacga cggccagtaa caactttgaa ctataact 38
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk06反向引物序列
<400> 12
aaacagttct aaccagtc 18
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk07正向引物序列
<400> 13
tgtaaaacga cggccagtta ttagtggagt tggtttcgtc 40
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk07反向引物序列
<400> 14
attcaccgct gggtattt 18
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk08正向引物序列
<400> 15
tgtaaaacga cggccagtag tcagtaattg tagtcttgt 39
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk08反向引物序列
<400> 16
gagcggataa caatttcaca taaatagctg ggactc 36
<210> 17
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk09正向引物序列
<400> 17
tgtaaaacga cggccagtgt aagcaaattg gacatc 36
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk09反向引物序列
<400> 18
gagcggataa caatttctta tgcaacactt ccagta 36
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk14正向引物序列
<400> 19
tgtaaaacga cggccagttt atgttttgtt taaccacg 38
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk14反向引物序列
<400> 20
tcaaatagct tagattccga 20
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk15正向引物序列
<400> 21
tgtaaaacga cggccagttg gcaagatagg tatgtgcaa 39
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sk15反向引物序列
<400> 22
taggcagacc aatcgtgaag c 21
Claims (8)
1.一种用于毛蚶家系鉴定的多重PCR方法，其特征在于包括如下步骤：提取亲本和子代DNA；按照下表中的序列合成正向引物，反向引物或反向加尾引物，以及带荧光标记的M13-21通用引物；
使用合成的引物对及带荧光标记的M13-21通用引物，对提取的DNA样本进行多重PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进行亲缘关系鉴定。
2.根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述正向引物的5’端添加M13-21通用引物序列。
3.根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述反向加尾引物的5’端添加序列GAGCGGATAACAATTTC。
4.根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述荧光标记为FAM，VIC，NED，PET中的一种；荧光标记被添加在单独合成的M13-21通用引物序列的5’端。
5.根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述多重PCR扩增按照下表所述的体系和条件进行，
每组多重PCR反应体系中，均加入带有一种荧光标记的M13-21序列0.15μM。
6.根据权利要求1或5所述的多重PCR方法，其特征在于所述多重PCR扩增的反应程序分为两步，前35个循环使用54℃的退火温度，后8个循环使用53℃的退火温度。
7.根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述对亲本和子代进行亲缘关系鉴定的方法是对扩增产物进行毛细管荧光电泳，并对扩增产物的荧光信号进行检测，通过软件对亲缘关系进行分析。
8.根据权利要求7所述的多重PCR方法，其特征在于所述的软件为Genemapper和Cervus。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |