CN110951892B - 用于几种鲟鱼物种鉴定的ssr引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用 - Google Patents

用于几种鲟鱼物种鉴定的ssr引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于几种鲟鱼物种鉴定的SSR引物对组，其包括正向引物P4‑58F和反向引物P4‑58R，其中正向引物P4‑58F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物P4‑58R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。本发明可以实现俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟间的快速种间鉴定，且鉴定结果准确。

Description

用于几种鲟鱼物种鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及 应用
技术领域
本发明属于水产动物种质鉴定领域，具体涉及用于几种鲟鱼(俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟)种间鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用。
背景技术
鲟鱼，即鲟形目鱼类，是古老的软骨硬磷鱼类。起源于白垩纪时期，迄今已有2亿年的历史，素有“水中活化石”之称。其骨可成胶、肉质细腻、味道鲜美，营养价值高，尤其是鲟鱼子酱富含优质蛋白质、氨基酸和微量元素，被誉为“黑色黄金”，与鹅肝、松露并称为世界三大美食。随着鲟鱼养殖业的快速发展，我国已经成为世界鲟鱼养殖第一大国。我国目前养殖的主要品种有俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、施氏鲟、达乌尔鳇以及它们的杂交种，其次有小体鲟、闪光鲟、匙吻鲟等，此外中华鲟和长江鲟也有保护性养殖，但未商品化。随着养殖品种的增多和对外贸易的法制化，纯种鲟鱼及相关副产品的鉴定迫在眉睫。
俄罗斯鲟等外来鲟和杂交鲟的大范围养殖，其逃逸到自然水体中的个体不仅可以存活，还可以与我国特有的中华鲟、长江鲟、施氏鲟等进行杂交繁殖，造成遗传污染。因此对鲟鱼种间鉴定鉴定不仅具有商业价值还具有重要的生态环境保护意义。然而，目前尚未建立简便、快速和有效的鉴定方法对俄罗斯鲟与其它鲟鱼，如中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的种间和相关的副产品的种质鉴定。
发明内容
本发明针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于几种鲟鱼(俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟)种间鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用，其可以实现俄罗斯鲟与其他四种鲟鱼：中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定，且鉴定结果准确。
本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下：
一方面，提供了一种用于几种鲟鱼物种鉴定的SSR引物对组，其包括正向引物P4-58F和反向引物P4-58R，其中正向引物P4-58F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物P4-58R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
优选的，所述正向引物P4-58F可用荧光染料进行标记。
一方面，提供了一种用于几种鲟鱼物种鉴定的试剂盒，其包括上述SSR引物对组。
优选的，所述试剂盒还包括：水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液中的一种或多种。
一方面，提供了一种几种鲟鱼间的物种鉴定方法，其包括如下步骤：
S1、提取待鉴定的俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的DNA样本；
S2、合成如权利要求1所述的SSR引物对组，且利用所述SSR引物对组、以步骤S1中获取的DNA样本为模板进行PCR扩增；
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行检测，以获得PCR扩增产物多态性原始数据；
以及S4、对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析，以得出测序峰图数据，并根据所述测序峰图数据对俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
优选的，在进行PCR扩增时，所述正向引物P4-58F的退火温度为52～60℃；所述反向引物P4-58R的退火温度为50～59℃。
优选的，在进行PCR扩增时，所述正向引物P4-58F与反向引物P4-58R的退火温度均为52℃。
一方面，还提供了一种上述SSR引物对组和/或上述试剂盒和/或上述鉴定方法在俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
一方面，还提供了一种分离的SSR标志物，其通过上述SSR引物对组扩增获得。
优选的，所述SSR标志物包括长度分别为124bp、128bp和134bp的3种特异性基因片段。
本发明可实现俄罗斯鲟与其他四种鲟鱼：中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟间的快速种间鉴定，且鉴定结果准确。
附图说明
图1为俄罗斯鲟1号个体的扩增结果；
图2为俄罗斯鲟2号个体的扩增结果；
图3为俄罗斯鲟3号个体的扩增结果；
图4为俄罗斯鲟4号个体的扩增结果；
图5为俄罗斯鲟5号个体的扩增结果；
图6为俄罗斯鲟6号个体的扩增结果；
图7为闪光鲟1号个体的扩增结果；
图8为闪光鲟2号个体的扩增结果；
图9为闪光鲟3号个体的扩增结果；
图10为闪光鲟4号个体的扩增结果；
图11为闪光鲟5号个体的扩增结果；
图12为闪光鲟6号个体的扩增结果；
图13为欧鳇1号个体的扩增结果；
图14为欧鳇2号个体的扩增结果；
图15为欧鳇3号个体的扩增结果；
图16为欧鳇4号个体的扩增结果；
图17为欧鳇5号个体的扩增结果；
图18为欧鳇6号个体的扩增结果；
图19为中华鲟1号个体的扩增结果；
图20为中华鲟2号个体的扩增结果；
图21为中华鲟3号个体的扩增结果；
图22为中华鲟4号个体的扩增结果；
图23为中华鲟5号个体的扩增结果；
图24为中华鲟6号个体的扩增结果；
图25为长江鲟1号个体的扩增结果；
图26为长江鲟2号个体的扩增结果；
图27为长江鲟3号个体的扩增结果；
图28为长江鲟4号个体的扩增结果；
图29为长江鲟5号个体的扩增结果；
图30为长江鲟6号个体的扩增结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供了一种用于几种鲟鱼(即俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟)物种鉴定的SSR引物对组，其包括正向引物P4-58F和反向引物P4-58R，其中P4-58F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(即ACCCTGAAAAGAAAGGGGAA)，P4-58R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列(即TATGGGCCAAAAGGAACAAG)；进一步的，所述正向引物P4-58F可用荧光染料进行标记。
实施例2：
本实施例提供了一种用于几种鲟鱼(即俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟)物种鉴定的试剂盒，其包括实施例一所述的引物对组、水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液和分子量标记物中的一种或多种。
实施例3：
本实施例提供了一种几种鲟鱼(即俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟)间的物种鉴定方法，其包括如下步骤：
S1、采用经典的高盐法提取待鉴定的俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的DNA样本，每种鲟鱼的DNA样本均为6个，均稀释至100ng/ul，备用；所述DNA样本来自粘液、鳍条、鱼肉、鱼子酱中的一项或几项；
S2、通过primer premier 5.0等软件设计出如实施例1所述的SSR引物对组，且其中正向引物P4-58F添加通用M13接头序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)，同时另外合成带T AMRA荧光基团的M13荧光接头引物；如实施例1所述的SSR引物对组、M13荧光接头引物合成后，以步骤S1中获取的DNA样本为模板，按照下述PCR反应体系和扩增程序进行P CR扩增：
A.PCR反应体系：
试剂 体积(μl)
2×Taq PCR Master Mix 5
模板(基因组DNA) 1
正向引物P4-58F(浓度10μmol/μl) 0.1
反向引物P4-58R(浓度10μmol/μl) 0.4
带荧光的荧光接头引物(浓度10μmol/μl) 0.4
ddH2O 3.1
总体积 10
B.PCR扩增程序：
Figure SMS_1
Figure SMS_2
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，根据电泳结果进行浓度鉴定；再使用DNA测序仪ABI 3730xl对所述PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，以获得PCR扩增产物多态性原始数据；
以及S4、使用genemarker软件对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析，以得出测序峰图数据，并根据所述测序峰图数据对欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
同时，同样采用上述正向引物P4-58F和反向引物P4-58R对俄罗斯鲟
(Acipenser gueldenstaedti)、中华鲟(Acipenser sinensis)、长江鲟
(Acipenser dabryanus Dumeril)、鲟欧鳇(Huso huso)和闪光鲟(Acipenserstellatus)参照实施例4中的方法分别获得俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟PCR扩增产物多态性原始数据，并根据每种鲟鱼PCR扩增产物多态性原始数据得出对应的测序峰图数据，表1示出通过所述正向引物P4-58F和反向引物P4-58R对俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟样品进行PCR扩增后的扩增结果，图1-6示出了6个俄罗斯鲟个体的测序峰图，图7-12示出了6个闪光鲟个体的测序峰图，图13-18示出了6个欧鳇个体的测序峰图，图19-25示出了6个中华鲟个体的测序峰图，图26-30示出了6个长江鲟个体的测序峰图。
表1正向引物P4-58F和反向引物P4-58R扩增结果
Figure SMS_3
/>
Figure SMS_4
/>
Figure SMS_5
/>
Figure SMS_6
其中，AG表示俄罗斯鲟个体；H表示欧鳇个体；ASt表示闪光鲟个体；AS表示中华鲟；AD表示长江鲟，※表示该等位基因存在。
从表1，图1-30中可以看出，通过P4-58F、P4-58R扩增所获得的产物中，俄罗斯鲟具有长度分别为124bp、128bp和134bp的3个特异性基因片段，而其他四种鲟鱼均没有这3个特异性的基因片段，因此，对于俄罗斯鲟和其他四种鲟鱼而言，其扩增结果简单易读，且结果精确，可利用上述P4-58F、P4-58R引物对组进行俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定或种质鉴定或家系管理。
实施例5：
本实施例提供了实施例1中所述SSR引物对组和/或实施例2中所述试剂盒和/或实施例3中所述鉴定方法在俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
实施例6：
本实施例还提供了一种分离的SSR标志物，其通过实施例1中的引物对组扩增获得，且所述SSR标志物包括长度分别为124bp、128bp和134bp的3种特异性基因片段。
需要说明的是，上述实施例1至5中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本发明的保护范围。
综上所述，本发明具有以下优点：
1)本发明提供的引物对组可用于俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的种间鉴定，从而在对外贸易、人工繁殖、野外监测等过程中对俄罗斯鲟进行种质鉴定，保证遗传物质或副产品鱼子酱或鱼肉的纯度。
2)通过本发明提供的引物对组获得PCR扩增结果简单易读，从中可获知欧俄罗斯鲟具有长度分别为124bp、128bp和134bp的3个特异性基因片段，其他四种鲟鱼均没有这3个特异性的基因片段，且成本低，易操作，可实现俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定，可大大节约鉴定的时间和测序的成本，且鉴定结果准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure SMS_7
/>
序列表
<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所
<120>用于几种鲟鱼物种鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accct gaaaa gaaag gggaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tatgg gccaa aagga acaag 20

Claims (10)

1.一种用于几种鲟鱼物种鉴定的SSR引物对组，其特征在于，包括正向引物P4-58F和反向引物P4-58R，其中正向引物P4-58F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物P4-58R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；
SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为ACCCTGAAAAGAAAGGGGAA；
SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为TATGGGCCAAAAGGAACAAG；
所述鲟鱼包括俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟。
2.如权利要求1所述的SSR引物对组，其特征在于，所述正向引物P4-58F可用荧光染料进行标记。
3.一种用于几种鲟鱼物种鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的SSR引物对组，所述鲟鱼包括俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液中的一种或多种。
5.一种几种鲟鱼间的物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取待鉴定的俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的DNA样本；
S2、合成如权利要求1所述的SSR引物对组，且利用所述SSR引物对组、以步骤S1中获取的DNA样本为模板进行PCR扩增；
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行检测，以获得PCR扩增产物多态性原始数据；
以及S4、对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析，以得出测序峰图数据，并根据所述测序峰图数据对俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
6.如权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，所述正向引物P4-58F的退火温度为52～60℃；所述反向引物P4-58R的退火温度为50～59℃。
7.如权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，所述正向引物P4-58F与反向引物P4-58R的退火温度均为52℃。
8.如权利要求1所述的SSR引物对组和/或如权利要求3所述的试剂盒和/或如权利要求5中所述的鉴定方法在俄罗斯鲟、中华鲟、长江鲟、欧鳇和闪光鲟的种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
9.一种分离的SSR标志物，其特征在于，其通过权利要求1所述的SSR引物对组、以俄罗斯鲟的DNA样本为模板进行扩增获得。
10.如权利要求9所述的SSR标记物，其特征在于，所述SSR标志物包括长度分别为124bp、134bp和145bp的3种特异性基因片段。
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