KR20240005628A - 돌가자미와 강도다리 간 교잡종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

돌가자미와 강도다리 간 교잡종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 판별하고, 더 나아가 다양한 가자미 품종을 판별할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도에 대한 것이다.
본 발명에서 제작한 교잡종 판별 전용 특이프라이머는 현장에서 직접 수거한 돌가자미 및 강도다리 순종과 교잡종을 대상으로 미토콘드리아 DNA의 cox1(Cytochrome c oxidase subunit 1) 및 핵 DNA의 rag1(Recombination activating gene 1) 유전자 염기서열들을 활용하여 제조된 것으로, 우리나라에서 널리 유통되고 있는 가자미류 6종을 비교군으로 설정하여 검증 실험까지 완료하여 수산물 유통 및 검역 현장에서 신속·정확하고 간편하게 쓰일 수 있는 교잡종 판별 에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

돌가자미와 강도다리 간 교잡종 판별용 프라이머 세트 및 이의 용도 {Primer set for discriminating hybrids between Stone flounder and Starry flounder and uses therefrom}
본 발명은 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 판별하고, 더 나아가 다양한 가자미 품종을 판별할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도에 대한 것이다.
우리나라 통계청에서 발표한 어업생산동향조사에 따르면 가자미류 어업생산량과 양식생산량은 집계가 시작된 2017년부터 최근 2022년까지 꾸준한 증가세를 나타내고 있다. 가자미목(Pleuronectiformes) 가자미과(Pleuronectidae) 강도다리속(Platichthys)에 속하는 강도다리(Platichthys stellatus)와 돌가자미(Platichthys bicoloratus)는 넙치(Paralichthys olivaceus) 위주로 편중되어있는 우리나라 수산시장에서 뛰어난 맛과 식감으로 소비자들에게 각광 받고 있는 수산물로 알려져 있다. 특히, 강도다리는 내병성이 뛰어나고 광염성을 나타내기 때문에 양식대상종으로써 매우 우수한 경쟁력을 갖추고 있다. 그러나, 성장이 느리다는 단점을 가지고 있어 출하 단계에서 뼈째 썰기용(300~500 g)으로 대부분 소비되고 있는 실정이다. 또한, 돌가자미는 육질이 단단하고 담백한 맛으로 많은 미식가들에게 각광 받는 고급 어종으로 알려져 있어, 양식 어가에 활력을 불어 넣어줄 수 있는 고부가가치 양식대상종이다. 그러나, 각종 질병과 고수온에 취약하여 널리 양식되지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 국내에서는 강도다리와 돌가자미 간의 인공 교잡을 통해 우량 형질을 이끌어내어 양식산업에 이용될 수 있도록 연구하고 있다.
가자미과 일부 어류들은 성장 속도, 서식 수온 및 질병 내성 등 산업적으로 용이한 이점을 얻기 위하여 넙치(Paralichthys olivaceus)×강도다리(Platichthys stellatus), 넙치(Paralichthys olivaceus)×범가자미(Verasper variegatus) 등의 교잡종을 생산하여 양식산업에 이용하고 있다. 특히, 가자미과 어류들의 교잡종은 순종과 함께 대량으로 섞어서 판매하는 경우가 많기 때문에, 현장에서 형태분석만으로 정확히 순종과 교잡종을 판별해 내기란 어렵다. 따라서, 분자생물학적으로 미토콘드리아 DNA 및 핵 DNA의 유전자 시퀀싱을 통한 정밀 분석 방법과 RAPD (random amplification of polymorphic DNA) 분석 방법을 이용한 순종과 교잡종 판별 연구들이 진행되고 있으나, 가자미과 어류를 대상으로 한 연구들은 극소수에 불과한 실정이다.
KR 10-2022-007921 (2022-01-19)
본 발명자들은 실제 수산물 유통 및 검역 현장에서 돌가자미와 강도다리보다 비교적 저렴하게 유통되는 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 간편한 방법으로 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 마커를 제공하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 교잡종 판별 전용 특이프라이머를 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은, 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 판별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1 의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 를 포함하는 제 1 프라이머 세트; 및/또는
서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 4 의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 를 포함하는 제 2 프라이머 세트;
를 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는 cox1(Cytochrome c oxidase subunit 1) 유전자를 검출하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제2프라이머 세트는 rag1(Recombination activating gene 1) 유전자를 검출하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 돌가자미는 암컷이고, 강도다리는 수컷인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 돌가자미(Platichthys bicoloratus), 강도다리 (Platichthys stellatus), 첨치가자미(Pleuronectes herzensteini), 각시가자미(Limanda aspera), 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 참가자미(Atheresthes stomias) 및 검정가자미(Reinhardtius hippoglossoides) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 가자미 품종을 추가적으로 판별할 수 있는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물의 검출한계는 0.005 ng/μL ~ 50 ng/μL 인 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 i) 개체로부터 Genomic DNA 를 추출하는 단계;
ii) 상기 조성물을 이용하여 상기 추출된 Genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계;
를 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별방법을 제공한다.
본 발명에서 제작한 교잡종 판별 전용 특이프라이머는 현장에서 직접 수거한 돌가자미 및 강도다리 순종과 교잡종을 대상으로 미토콘드리아 DNA의 cox1(Cytochrome c oxidase subunit 1) 및 핵 DNA의 rag1(Recombination activating gene 1) 유전자 염기서열들을 활용하여 제조된 것으로, 우리나라에서 널리 유통되고 있는 가자미류 6종을 비교군으로 설정하여 검증 실험까지 완료하여 수산물 유통 및 검역 현장에서 신속·정확하고 간편하게 쓰일 수 있는 교잡종 판별 에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1a 는 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별을 위해 검출하고자 하는 cox1 유전자 염기서열 및 검출 부위를 나타낸다.
도 1b 는 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별을 위해 검출하고자 하는 rag1 유전자 염기서열 및 검출 부위를 나타낸다.
도 2a 는 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 간의 Real-time PCR 증폭 반응 시 cox1 유전자의 특이프라이머에 대한 표적 유전자가 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과, 특이적 결합에 의한 증폭 반응이 감지되지 않은 것을 나타낸다.
도 2b 는 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 간의 Real-time PCR 증폭 반응 시 rag1 유전자의 특이프라이머에 대한 표적 유전자가 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과, 특이적 결합에 의한 증폭 반응이 감지되지 않은 것을 나타낸다.
도 3a 는 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 간의 cox1 유전자에 대한 Real-time PCR 증폭 반응 시 특이적 결합에 의한 증폭 반응이 일어난 것을 나타낸다.
도 3b 는 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 간의 rag1 유전자에 대한 Real-time PCR 증폭 반응 시 특이적 결합에 의한 증폭 반응이 일어난 것을 나타낸다.
도 4a 는 본 발명의 cox1 유전자에 대한 프라이머의 올바른 증폭과 표적 종 간의 차이를 확인하기 위하여 Melt curve 분석 결과를 나타낸다.
도 4b 는 본 발명의 rag1 유전자에 대한 프라이머의 올바른 증폭과 표적 종 간의 차이를 확인하기 위하여 Melt curve 분석 결과를 나타낸다.
도 5a 는 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별하기 위한 cox1 유전자에 대한 특이프라이머 검출 한계를 평가한 결과를 나타낸다.
도 5b 는 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별하기 위한 rag1 유전자에 대한 특이프라이머 검출 한계를 평가한 결과를 나타낸다.
도 6 은 국내 유통 가자미류 6종에 대하여 본 발명의 특이프라이머 및 마커의 효용성을 평가한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미할 수 있다. 본 발명에서는 전술한 바이오마커 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 중간 전구체 세포를 판별할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 “중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)”는 최초의 주형 DNA를 반복과정(가열 및 냉각이 교대로 이루어짐)에 의하여 다량의 동일 DNA가 증폭되는 일련의 과정을 의미할 수 있다. 여기에는 (ⅰ증폭하고자하는 주형 DNA, (ⅱ복제의 시발점이 되는 프라이머, (ⅲDNA를 합성할 수 있는 효 소인 DNA polymerase 그리고 (ⅳDNA의 재료가 되는 dNTPs 등이 필요하다.
본 발명의 “time PCR” 은 증폭되는 유전자의 정량적인 정보를 실시간으로 확인할 수 있는 PCR 기법일 수 있다. 염기서열이 증폭되는 경우 형광물질이 방출되어 이를 측정하여 증폭된 염기 서열의 정량적인 정보를 획득할 수 있다
본 발명은 국내에 유통되는 주요 수산물로 알려진 돌가자미(Platichthys bicoloratus)와 강도다리(Platichthys stellatus) 간의 교잡종인 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀ × Platichthys stellatus♂)를 판별하기 위하여 모계유전을 하는 미토콘드리아 DNA의 cox1 유전자 영역 내에서 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism) 부위를 탐색하고, 핵융합을 통해 부계와 모계 유전자를 모두 반영하는 핵 DNA의 rag1 유전자 영역에서 ambiguous nucleotide 부위를 탐색하여 두쌍의 특이프라이머를 제작한 후, real-time PCR을 이용하여 SYBR green 시약 분석 방법을 통해 순종과 교잡종에서 나타나는 고유 melt curve 토대로 특이성과 재현성을 검증하고 종래기술보다 더욱 정확하고 간편하며 신속한 교잡종 판별 마커를 발명하고자 하였다. 해당 발명을 통하여 실제 수산물 유통 및 검역 현장에서 돌가자미와 강도다리보다 비교적 저렴하게 유통되는 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 간편한 방법으로 신속하고 정확하게 판별하여 비전공자 수준에서도 널리 이용될 수 있을 것으로 생각하며, 교잡종의 둔갑 부정 유통에 따른 산업적 및 학술적 피해를 최소화할 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 를 포함하는 제 1 프라이머 세트; 및/또는
서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 4 의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 를 포함하는 제 2 프라이머 세트;
를 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는 cox1(Cytochrome c oxidase subunit 1) 유전자를 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제2프라이머 세트는 rag1(Recombination activating gene 1) 유전자를 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 돌가자미는 암컷이고, 강도다리는 수컷인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 돌가자미(Platichthys bicoloratus), 강도다리 (Platichthys stellatus), 첨치가자미(Pleuronectes herzensteini), 각시가자미(Limanda aspera), 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 참가자미(Atheresthes stomias) 및 검정가자미(Reinhardtius hippoglossoides) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 가자미 품종을 추가적으로 판별할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물의 검출한계는 0.005 ng/μL ~ 50 ng/μL 인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 돌가자미는 암컷이고, 강도다리는 수컷인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 돌가자미(Platichthys bicoloratus), 강도다리 (Platichthys stellatus), 첨치가자미(Pleuronectes herzensteini), 각시가자미(Limanda aspera), 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 참가자미(Atheresthes stomias) 및 검정가자미(Reinhardtius hippoglossoides) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 가자미 품종을 추가적으로 판별할 수 있는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물의 검출한계는 0.005 ng/μL ~ 50 ng/μL 인 것일 수 있다.
본 발명의 키트는 통상적으로 사용되는 발현 수준 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 또는 PCR 증폭산물의 표지물질 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 평가 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 샘플 추출 수단을 포함할 수 있다. 샘플 추출 수단은 바늘 또는 시린지 등을 포함할 수 있다. 키트는 액체, 기체 또는 반고체일 수 있는, 추출된 샘플을 수용하기 위한 샘플 수집 용기를 포함할 수 있다. 키트는 사용 지침을 추가로 포함할 수 있다. 상기 샘플은 Genomic DNA가 존재하거나 분비될 수 있는 임의의 샘플일 수 있다. 샘플에서 Genomic DNA 의 측정은 전체 샘플 또는 가공된 샘플 상에서 수행될 수 있다. 본 발명의 키트는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 개체로부터 Genomic DNA 를 추출하는 단계;
ii) 상기 조성물을 이용하여 상기 추출된 Genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
iii) 상기 증폭된 Genomic DNA 산물을 분석하는 단계;
를 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 판별방법은 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 돌가자미는 암컷이고, 강도다리는 수컷인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 돌가자미(Platichthys bicoloratus), 강도다리 (Platichthys stellatus), 첨치가자미(Pleuronectes herzensteini), 각시가자미(Limanda aspera), 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 참가자미(Atheresthes stomias) 및 검정가자미(Reinhardtius hippoglossoides) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 가자미 품종을 추가적으로 판별할 수 있는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
시료 채취 및 Genomic DNA 추출
돌가자미(암컷, ♀)와 강도다리(수컷, ♂) 간 교잡종 판별에 대한 특이프라이머를 개발하기 위하여 사용된 돌가자미, 강도다리, 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종, 참가자미, 첨치가자미, 각시가자미, 검정가자미, 기름가자미 그리고 용가자미 등의 시료 정보는 하기 [표 1]에 제시하였다. Genomic DNA (gDNA)의 추출에 사용된 배지느러미 조직은 그 일부를 절단하여 통상적으로 알려진 페놀-클로로폼 추출법을 이용하여 추출하고, 실험에 사용할 수 있도록 모든 gDNA를 최대 50 ng/μL로 희석하여 정량하였다.
국명(학명) 원산지 수집 일자 시료수 비고
돌가자미(Platichthys bicoloratus) 국내산 2023-07-31 19 경상북도 포항시
강도다리(Platichthys stellatus) 국내산 2023-06-09 20 경상북도 포항시
돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 국내산 2022-10-19 18 충청남도 태안군
참가자미(Pleuronectes herzensteini) 국내산 2022-04-02 4 강원도 고성군
첨치가자미(Atheresthes stomias) 미국산 2022-05-15 4 -
각시가자미(Limanda aspera) 러시아산 2022-06-14 3 -
검정가자미(Reinhardtius hippoglossoides) 노르웨이산 2022-05-15 4 -
기름가자미(Glyptocephalus stelleri) 국내산 2023-08-05 4 경상북도 울릉군
용가자미(Hippoglossoides pinetorum) 국내산 2023-08-08 4 울산광역시 북구
미토콘드리아 DNA의 cox1 유전자 및 핵 DNA의 rag1 유전자 염기서열 증폭
돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별 특이프라이머를 제작하기에 앞서, 미토콘드리아 DNA의 cox1 유전자와 핵 DNA의 rag1 유전자 염기서열 정보를 확보하기 위하여, cox1 유전자의 universal primer (FishF1, 5'-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3' (서열번호 5); FishR1, 5'-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3' (서열번호 6); FishF2, 5'-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC-3' (서열번호 7); FishR2 5'-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3' (서열번호 8))와 본 발명에서 새로 개발된 rag1 유전자의 primer (DKKDrag1_F, 5'-ATGGAAGACAGCGCTTGCAC-3' (서열번호 9); DKKDrag1_R, 5'-TCGACTGACGTGCGTTCATC-3' (서열번호 10))를 사용하여 일반 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 실험을 수행하였다.
PCR 반응은 20 μL 용적의 AccuPower ® PCR Premix Kit (BIONEER Co., Daejeon, Republic of Korea)에 gDNA 100 ng과 상기된 cox1 및 rag1 유전자의 프라이머를 각각 10 pmole을 첨가하였으며, 95℃에서 30초의 초기 변성 반응을 유도한 후, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환 반응을 35회 실시하였고, 최종적으로 72℃에서 7분간 신장 반응을 수행하였다.
PCR 반응으로 얻은 증폭된 유전자의 염기서열 분석
증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 밴드 유무를 확인한 후, MG PCR Purification kit (Cancer Rop Co., Ltd, Seoul, Republic of Korea)로 정제하여 동일한 프라이머를 이용하여 염기서열분석기 Applied Biosystems™ ABI 3730xl DNA analyzer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 통해 direct sequencing 방법으로 염기서열을 결정하였다.
결정된 염기서열 Raw data는 BioEdit 7.2.5 소프트웨어의 ClustalW 를 이용하여 trimming 및 multiple sequence alignment를 수행하였으며, 최종적으로 cox1 (682 bp) 및 rag1 (1,161bp) 유전자 영역의 염기서열을 최종적으로 결정하였다.
돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별 특이프라이머 제작
본 발명에서는 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별 특이프라이머를 제작하기 위하여 직접 확보한 cox1 및 rag1 유전자 염기서열 이외에도 미국국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 등록된 염기서열도 함께 분석에 사용하였다. 확보된 염기서열 데이터는 미토콘드리아 전체 DNA 서열 유전자 영역 중에서 cox1 유전자 염기서열을 선택한 염기서열의 다중정렬에는 BioEdit ver. 7.2.5 소프트웨어의 clustalW 를 이용하여 다중염기서열정리를 수행하였다. 이를 통하여, 돌가자미, 강도다리 그리고 이들 간 교잡종의 cox1과 rag1 유전자 염기서열 내에서 아데닌(adenine, A), 티민(thymine, T), 구아닌(guanine, G) 및 시토신(cytosine, C) 등 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 부위와 pyrimidine (C and T; Y), purine (A and G; R), weak (A and T; W), strong (G and C; S), keto (T and G; K), amino (C and A; K) 등 ambiguous nucleotide를 잘나타내는 적합한 부위를 탐색한 후, cox1 유전자 염기서열 내에서 약 82 bp의 증폭 크기를 나타내고, rag1 유전자 염기서열 내에서 약 188 bp의 증폭 크기를 나타내는 19~25 mer 크기의 특이프라이머를 각각 제작하였다(도 1a, 도 1b 및 표 2) (1, Cytochrome c oxidase subunit 1 gene of mitochondrial genome; 2, Recombination activating gene 1 gene of nuclear genome).
이름 염기서열 (5'-3') 유전자 서열목록
Primers
Forward PBPS_co1_FQ3 F: CTTCCCTCGAATAAATAACATGAGC cox1 1 서열번호 1
Reverse PBPS_co1_RQ3 R: GGCTTCAACACCTGAAGAG 서열번호 2
Forward PBPS_rag1_FQ5 F: GCCACTGAGTTCTACAAAATCTTCC rag1 2 서열번호 3
Reverse PBPS_rag1_RQ5 R: ACAGCCTCCATGCTCATTAGC 서열번호 4
하기 [표 3] 은 강도다리(Platichthys stellatus) 순종, 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 순종 및 돌가자미(Platichthys bicoloratus) x 강도다리(Platichthys stellatus) 교잡종 에서 상기 서열번호 5 및 서열번호 6 (굵은 글씨)로 증폭시 생산되는 cox1 유전자 염기서열과, 해당 서열에서 상기 서열번호 1 및 서열번호 2 의 프라이머가 결합되는 위치(밑줄)를 나타낸다. 이는 예시적인 서열이며 다양한 가자미 품종 및 Haplotype 에 대하여 본 발명의 프라이머는 특이적으로 결합하여 유전자를 증폭 및 가자미 품종을 판별할 수 있었다.
가자미 품종 서열 서열번호
강도다리(Platichthys stellatus) 순종 TCGACCAATCAC AAAGATATCGGCACCCTCTATCTCGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGGACAGGCCTAAGTCTACTCATTCGAGCAGAGCTAAGCCAACCTGGGGCTCTCCTGGGGGACGACCAAATTTATAACGTAATCGTCACCGCACACGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATTGGAGGGTTTGGAAACTGACTTATCCCATTAATAATTGGGGCCCCCGATATGGCCTTCCCTCGAATAAATAACATGAGCTTCTGACTCCTACCCCCATCCTTCCTGCTTCTCCTGGCCTCTTCAGGTGTTGAAGCCGGGGCGGGAACAGGGTGAACTGTATATCCCCCACTAGCTGGAAACCTAGCACACGCCGGGGCATCCGTAGACCTCACAATCTTTTCCCTTCACCTTGCCGGAATTTCATCAATTCTAGGGGCAATCAACTTTATTACCACCATTATCAACATGAAACCAACAGCAGTCACTATGTACCAAATCCCACTGTTTGTTTGGGCCGTACTAATTACCGCCGTTCTTCTTCTCCTTTCCCTTCCGGTCTTAGCCGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGCAACCTGAACACAACCTTCTTTGATCCTGCTGGAGGAGGTGACCCCATCCTCTACCAGCACCTGTTCTGATTCTTCGGTC ACCCAGAGGTATA 11
돌가자미(Platichthys bicoloratus) 순종 TCGACCAATCAC AAAGACATTGGCACCCTCTATCTCGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGGACAGGCCTAAGTCTACTCATTCGAGCAGAGCTAAGCCAACCTGGGGCTCTCCTGGGAGACGACCAAATTTATAACGTAATCGTCACCGCACACGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATTGGAGGGTTCGGAAACTGGCTTATCCCATTGATAATTGGGGCCCCCGATATGGCCTTCCCTCGAATAAATAACATGAGCTTCTGGCTTCTACCCCCATCCTTTCTGCTTCTCCTAGCCTCTTCAGGTGTTGAAGCCGGGGCGGGAACAGGGTGAACGGTGTATCCCCCACTAGCTGGAAACCTAGCACACGCCGGGGCATCCGTAGACCTCACAATCTTTTCTCTTCACCTTGCTGGGATTTCATCAATTCTAGGAGCAATCAACTTTATTACTACCATCATCAACATGAAACCAACGGCAGTCACTATGTACCAAATCCCGCTATTTGTTTGGGCCGTACTAATTACCGCCGTCCTTCTTCTCCTCTCCCTTCCGGTCCTAGCCGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGCAACTTAAACACAACCTTCTTTGACCCTGCTGGAGGGGGTGACCCCATCCTCTACCAACACCTCTTCTGATTCTTTGGCC ACCCAGAGGTATA 12
돌가자미(Platichthys bicoloratus) x 강도다리(Platichthys stellatus) 교잡종 TCGACCAATCAC AAAGATATCGGCACCCTCTATCTCGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGGACAGGCCTAAGTCTACTCATTCGAGCAGAGCTAAGCCAACCTGGGGCTCTCCTGGGGGACGACCAAATTTATAACGTAATCGTCACCGCACACGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATTGGAGGGTTCGGAAACTGGCTTATCCCATTGATAATTGGGGCCCCCGATATGGCCTTCCCTCGAATAAATAACATGAGCTTCTGGCTTCTACCCCCATCCTTTCTGCTTCTCCTAGCCTCTTCAGGTGTTGAAGCCGGGGCGGGAACAGGGTGAACGGTGTATCCCCCACTAGCTGGAAACCTAGCACACGCCGGGGCATCCGTAGACCTCACAATCTTTTCTCTTCACCTTGCTGGGATTTCATCAATTCTAGGAGCAATCAACTTTATTACTACCATCATCAACATGAAACCAACGGCAGTCACTATGTACCAAATCCCGCTATTTGTTTGGGCCGTACTAATTACCGCCGTCCTTCTTCTCCTCTCCCTTCCGGTCCTAGCCGCTGGCATTACAATGCTACTAACAGACCGCAACTTAAACACAACCTTCTTTGACCCTGCTGGAGGGGGTGACCCCATCCTCTACCAACACCTATTCTGATTCTTCGGTC ACCCAGAGGTATA 13
하기 [표 4] 는 강도다리(Platichthys stellatus) 순종, 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 순종 및 돌가자미(Platichthys bicoloratus) x 강도다리(Platichthys stellatus) 교잡종 에서 상기 서열번호 9 및 서열번호 10 (굵은 글씨)로 증폭시 생산되는 rag1 유전자 염기서열과, 해당 서열에서 상기 서열번호 3 및 서열번호 4 의 프라이머가 결합되는 위치(밑줄)를 나타낸다. 이는 예시적인 서열이며 다양한 가자미 품종에 대하여 본 발명의 프라이머는 특이적으로 결합하여 유전자를 증폭 및 가자미 품종을 판별할 수 있었다.
가자미 품종 서열 서열번호
강도다리(Platichthys stellatus) 순종 ATGGAAGACAGCGCTTGCAC CTCAGGTTTTAGTGTCATGATCAAGGAATGCTGTGACGGCATGGGCGATGTCAGCGAGAAGCACGGCGGAGGACCGGCTGTTCCCGAGAAGGTTGTACGTTTCTCCTTCACTGTTATGTCTGTCTCTGTCCTGGCAGATGGTGAAGACAGGGAGGTCACCATCTTCACCGAGCCAAAGCCAAACTCAGAGCTGTCCTGTAAGCCCCTTTGCCTGATGTTTGTGGATGAGTCCGACCACGAGACACTCACGGCTGTCCTGAGGCCTATCGTCGCCGAGCGTAATGCAATGAAAGAGAGCAGGCTCATCCTATCCATCGGTGGTCTGCCTCGCTCTTTCCGCTTCCACTTCCGAGGCACGGGATACGATGAGAAGATGGTGCGAGAGATGGAGGGCCTGGATGCCTCGGGCTCCACCTACATCTGCACTTTGTGTGACTCAAGTCGAGCCGAGGCTTCTCAAAACATGGTGCTGCATTCCATCACCCGCTGTCATGAGGAGAACCTGGACCGTTACGAAATATGGAGAACGAACCCTTTCTCTGAGTCTGCAGACGAGCTGCGGGACAGAGTCAAAGGCGTCTCGGCCAAGCCCTTCTTGGAGACCCAGCCCACAATGGATGCGTTACACTGTGACATTGGCAATGCCACTGAGTTCTACAAAATCTTCCAGGACGAGATCGGGGAGGTGTACGACAAGGTCAAGCCCAGCCGGGAGGAGCGGCGCAGCTGGAGGGCAGCCCTGGATAAACAGCTGAGGAAGAAGATGAAGCTCAAACCAGTAATGAGGATGAATGGGAACTATGCCMGAAAGCTAATGAGCATGGAGGCTGTGGAGGTGGTGTGTGATCTGGTGCCCTCAGAGGAGAGGCGGGAGCMCCTGAGGGAGCTGATGAGGCTCTACCTCCAGATGAAGCCTGTGTGGCGCTCCACCTGTCCAGCCAAGGAATGCCCCGACCAGCTGTGCCGCTACAGCTTCAACTCCCAGCGCTTTGCCGACCTCCTGTCCTCTACTTTCAAATACAGGTACAACGGCAAGATAACCAACTACCTCCACAAGACCCTGGCCCACGTGCCTGAGATCATAGAGAGAGACGGATCCATCGGAGCGTGGGCCAGCGAGGGGAACGAGTCTGGAAACAAACTGTTCAGGCGTTTCCGGAA GATGAACGCACGTCAGTCGA 14
돌가자미(Platichthys bicoloratus) 순종 ATGGAAGACAGCGCTTGCAC CTCAGGTTTTAGTGTCATGATCAAGGAATGCTGTGACGGCATGGGCGATGTCARCGAGAAGCACGGCGGAGGACCGGCTGTTCCCGAGAAGGTTGTACGTTTCTCCTTCACTGTTATGTCTGTCTCTGTCCTGGCAGATGGTGAAGACAGGGAGGTCACCATCTTCACCGAGCCAAAGCCAAACTCAGAGCTGTCCTGTAAGCCCCTTTGCCTGATGTTTGTGGATGAGTCCGACCACGAGACACTCACGGCTGTCCTGAGGCCTATCGTCGCCGAGCGTAATGCAATGAAAGAGAGCAGGCTCATCCTATCCATCGGTGGTCTGCCTCGCTYTTTCCGCTTCCACTTCCGAGGCACGGGATACGATGAGAAGATGGTGCGAGAGATGGAGGGCCTGGATGCCTCGGGCTCCACCTACATCTGCACTTTGTGTGACTCAAGTCGAGCCGAGGCTTCTCAAAACATGGTGCTGCATTCCATCACCCGCTGTCATGAGGAGAACCTGGACCGTTACGAAATATGGAGAACGAACCCTTTCTCTGAGTCTGCAGAYGAGCTGCGGGAYAGAGTCAAAGGCGTCTCGGCCAAGCCCTTCTTGGAGACCCAGCCCACAATGGATGCGTTACACTGTGACATTGGCAATGCCACTGAGTTCTACAAAATCTTCCAGGAYGAGATCGGGGAGGTGTACGACAAGGTCAAGCCCAGCCGGGAGGAGCGGCGCAGCTGGAGGGCAGCCCTGGATAAACAGCTGAGGAAGAARATGAAGCTCAAACCAGTAATGAGGATGAATGGGAACTATGCCCGMAAGCTAATGAGCATGGAGGCTGTGGAGGTGGTGTGTGATCTGGTGCCCTCAGAGGAGAGGCGGGAGCMCCTGAGGGAGCTGATGAGGCTCTACCTCCAGATGAAGCCTGTGTGGCGCTCCACCTGTCCAGCCAAGGAATGCCCCGACCAGCTGTGCCGCTACAGCTTCAACTCCCAGCGCTTTGCCGAMCTCCTGTCCTCTACTTTCAAATACAGGTACAACGGCAAGATAACCAACTACCTCCACAAGACCCTGGCCCACGTGCCTGAGATCATAGAGAGAGACGGATCCATCGGAGCRTGGGCCAGCGAGGGGAACGAGTCWGGAAACAAACTGTTCAGGCGTTTCCGGAA GATGAACGCACGTCAGTCGA 15
돌가자미(Platichthys bicoloratus) x 강도다리(Platichthys stellatus) 교잡종 ATGGAAGACAGCGCTTGCAC CTCAGGTTTTAGTGTCATGATCAAGGAATGCTGTGACGGCATGGGCGATGTCAACGAGAAGCACGGCGGAGGACCGGCTGTTCCCGAGAAGGTTGTACGTTTCTCCTTCACTGTTATGTCTGTCTCTGTCCTGGCAGATGGTGAAGACAGGGAGGTCACCATCTTCACCGAGCCAAAGCCAAACTCAGAGCTGTCCTGTAAGCCCCTTTGCCTGATGTTTGTGGATGAGTCCGACCACGAGACACTCACGGCTGTCCTGAGGCCTATCGTCGCCGAGCGTAATGCAATGAAAGAGAGCAGGCTCATCCTATCCATCGGTGGTCTGCCTCGCTTTTTCCGCTTCCACTTCCGAGGCACGGGATAYGATGAGAAGATGGTGCGAGAGATGGAGGGCCTGGATGCCTCGGGCTCCACCTACATCTGCACTTTGTGTGACTCAAGTCGAGCCGAGGCTTCTCAAAACATGGTGCTGCATTCCATCACCCGCTGTCATGAGGAGAACCTGGACCGTTACGAAATATGGAGAACGAACCCTTTCTCTGAGTCTGCAGACGAGCTGCGGGACAGAGTCAAAGGCGTCTCGGCCAAGCCCTTCTTGGAGACCCAGCCCACAATGGATGCGTTACACTGTGACATTGGCAATGCCACTGAGTTCTACAAAATCTTCCAGGATGAGATCGGGGAGGTGTACGACAAGGTCAAGCCCAGCCGGGAGGAGCGGCGCAGCTGGAGGGCAGCCCTGGATAAACAGCTGAGGAAGAAAATGAAGCTCAAACCAGTAATGAGGATGAATGGGAACTATGCCCGCAAGCTAATGAGCATGGAGGCTGTGGAGGTGGTGTGTGATCTGGTGCCCTCAGAGGAGAGGCGGGAGCACCTGAGGGAGCTGATGAGGCTCTACCTCCAGATGAAGCCTGTGTGGCGCTCCACCTGTCCAGCCAAGGAATGCCCCGACCAGCTGTGCCGCTACAGCTTCAACTCCCAGCGCTTTGCCGACCTCCTGTCCTCTACTTTCAAATACAGGTACAACGGCAAGATAACCAACTACCTCCACAAGACCCTGGCCCACGTGCCTGAGATCATAGAGAGAGACGGATCCATCGGAGCATGGGCCAGCGAGGGGAACGAGTCAGGAAACAAACTGTTCAGGCGTTTCCGGAA GATGAACGCACGTCAGTCGA 16
돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별 특이프라이머 검출 성능 평가
발명된 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별 Real-time PCR 특이프라이머의 효과적인 식별 여부를 판단하기 위하여 0.2 ml PCR 8-tube strip의 각 well에 iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) 10 μL, 50 ng/μL의 gDNA 2 μL, 상기된 cox1와 rag1 유전자 정방향 및 프라이머를 각각 1 μL (5 pmole/μL)를 첨가하고, 나머지 볼륨은 Nuclease-free water (NFW)로 채워 총 볼륨이 20 μL가 되도록 혼합하였다(표 5 및 표 6). 또한, Real-time PCR 반응 조건은 95℃에서 3분간 초기변성 반응을 수행한 후, 95℃에서 15초간 변성 과정을 거치고 57℃에서 30초간 결합 및 신장 반응을 40회 반복 수행하였으며, 비주형대조군(non-template control, NTC)은 NFW를 사용하였다(표 7).
Reagent
iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix 10 μL
Genomic DNA (50 ng/μL) 2 μL
Forward primer (PBPS_co1_FQ3, 5 pmole/μL) 1 μL
Reverse primer (PBPS_co1_RQ3, 5 pmole/μL) 1 μL
Nuclease-free water 6 μL
Total volume 20 μL
Reagent
iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix 10 μL
Genomic DNA (50 ng/μL) 2 μL
Forward primer (PBPS_rag1_FQ5, 5 pmole/μL) 1 μL
Reverse primer (PBPS_rag1_RQ5, 5 pmole/μL) 1 μL
Nuclease-free water 6 μL
Total volume 20 μL
Temperature Time Cycles
Pre-denaturation 95℃ 3 min 1
Denaturation 95℃ 15 sec 40
Annealing/elongation 57℃ 30 sec
Melt curve 65~95℃ (increment 0.5℃) 5 sec -
돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 간의 Real-time PCR 증폭 반응 시 cox1과 rag1 유전자의 특이프라이머에 대한 표적 유전자가 없는 음성 대조군의 real-time PCR 결과, 특이적 결합에 의한 증폭 반응이 감지되지 않았다(도 2a, 도 2b).
돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 간의 cox1과 rag1 유전자 특이프라이머 표적 유전자에 대한 real-time PCR 증폭 반응 결과, cox1 유전자 특이프라이머 서열번호 1과 2에 대한 SYBR green의 excitation 파장대 497nm와 emission 파장대 520nm에서 검출되는 형광값(relative fluorescence units, RFU)에 따라 14.77~22.42의 cycle threshold (CT) 값에서 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종에 대한 증폭을 확인하였으며(도 3a), rag1 유전자 특이프라이머 서열번호 3과 4에 대한 SYBR green의 excitation 파장대 497nm와 emission 파장대 520nm에서 검출되는 형광값에 따라 19.05~25.60의 CT 값에서 증폭을 확인하였다(도 3b). 이후, 특이프라이머에 대한 올바른 증폭과 표적 종 간의 차이를 확인하기 위하여 Melt curve 분석을 수행한 결과, cox1 유전자 특이프라이머 서열번호 1과 2를 사용한 경우, 돌가자미 77.5℃, 강도다리 78.0℃ 그리고 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 77.0~77.5℃ 부근에서 특이적 증폭을 확인하였다(도 4a). 또한, rag1 유전자 특이프라이머 서열번호 3과 4를 사용한 경우, 돌가자미 83.0~83.5℃, 강도다리 84.0~84.5℃ 그리고 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 84.0℃ 부근에서 특이적 증폭을 확인하였다(도 4b).
따라서, 본 발명에서 개발된 특이프라이머 서열번호 1, 2, 3 및 4의 경우, 표 5, 표 6, 및 표 7의 반응물 조성 및 반응 조건에 따라, 위양성 또는 위음성 결과가 도출되지 않고, cox1과 rag1 유전자 특이프라이머의 특이적인 melt curve 조합으로 돌가자미(cox1, 77.5℃; rag1, 83.0~83.5℃), 강도다리(cox1, 78℃; rag1, 84.0~84.5℃), 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종(cox1, 77.0~77.5℃; rag1, 84.0℃)을 명확히 판별할 수 있었다(표 8) (1, Cytochrome c oxidase subunit 1 gene of mitochondrial genome; 2, Recombination activating gene 1 gene of nuclear genome)
번호 국명(학명) Melt curve (˚C)
1 돌가자미(Platichthys bicoloratus) cox1 rag1
2 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
3 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
4 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
5 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
6 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
7 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
8 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
9 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
10 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
11 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
12 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
13 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
14 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
15 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.0
16 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
17 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
18 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
19 돌가자미(Platichthys bicoloratus) 77.5 83.5
20 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
21 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
21 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
23 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
24 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
25 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
26 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
27 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
28 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
29 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
30 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
31 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
32 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
33 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
34 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
35 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
36 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.0 84.0
37 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
38 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀×Platichthys stellatus♂) 77.5 84.0
39 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.5
40 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
41 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.5
42 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
43 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
44 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
45 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
46 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
47 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.5
48 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
49 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
50 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
51 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
52 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
53 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.5
54 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
55 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
56 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.5
57 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.0
58 강도다리(Platichthys stellatus) 78.0 84.5
돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별 특이프라이머 검출 한계 평가
상기 <실시예 4> 에서 제조된 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종에 대한 Real-time PCR 종 판별 마커의 검출 한계를 확인하기 위하여 두 종의 gDNA 50 ng/μL의 농도를 10배씩 6번 희석한 후, 3회 반복하여 검량선(standard curve)을 작성하였다. 돌가자미, 강도다리 및 이들 간 교잡종 등으로부터 직접 추출한 gDNA를 멸균된 3차 증류수로 최대 50 ng/μL부터 최소 0.005 ng/μL까지 6개 구간을 설정하여 희석한 후, 상기된 동일한 방법으로 real-time PCR을 수행하였다.
그 결과, [도 5a] 및 [도 5b] 에서 나타나는 바와 같이, 돌가자미의 경우에는 최대 50 ng/μL부터 최소 0.005 ng/μL의 농도 구간까지 cox1과 rag1 유전자의 유효한 증폭이 가능하였고, 강도다리의 경우에도 최대 50 ng/μL부터 최소 0.05 ng/μL의 농도 구간까지 cox1과 rag1 유전자의 유효한 증폭이 가능하였다. 또한, 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종의 경우에는 최대 50 ng/μL부터 최소 0.005 ng/μL의 농도 구간까지 cox1과 rag1 유전자의 유효한 증폭이 가능하였다.
국내 유통 가자미류 6종을 포함한 마커 효용성 평가
본 발명에서 제작된 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 판별 특이프라이머의 효용성을 평가하기 위하여 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 교잡종 등 표적종을 포함한 비표적종 가자미류 6종을 대상으로 교잡종 판별 특이프라이머의 효용성 평가를 실시하였다(표 9) (1, Cytochrome c oxidase subunit 1 gene of mitochondrial genome; 2, Recombination activating gene 1 gene of nuclear genome).
국명(학명) 샘플수 cox1 1 rag1 2
min. max. average SD min. max. average SD
돌가자미(Platichthys bicoloratus, PB) 19 77.5 77.5 77.5 0.0 83.0 84.0 83.5 0.2
돌가자미(♀)×강도다리(♂) (PB×PS) 20 77.0 77.5 77.2 0.3 84.0 84.0 84.0 0.0
강도다리(Platichthys stellatus, PS) 18 78.0 78.0 78.0 0.0 84.0 84.5 84.1 0.2
참가자미(Pleuronectes herzensteini, PH) 4 76.0 76.0 76.0 0.0 83.5 83.5 83.5 0.0
첨치가자미(Atheresthes stomias, AS) 4 75.5 75.5 75.5 0.0 83.0 83.5 83.3 0.3
각시가자미(Limanda aspera, LA) 3 76.5 77.0 76.7 0.3 83.0 83.0 83.0 0.0
검정가자미(Reinhardtius hippoglossoides, RH) 4 76.0 76.0 76.0 0.0 83.5 84.0 83.8 0.3
기름가자미(Glyptocephalus stelleri, GS) 4 78.0 78.0 78.0 0.0 83.0 83.5 83.4 0.3
용가자미(Cleisthenes pinetorum, CP) 4 78.5 78.5 78.5 0.0 83.0 83.0 83.0 0.0
돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종 등 표적종에 대한 cox1 및 rag1 유전자 영역의 melt curve의 효용성을 평가하기 위하여 비표적종 가자미류 6종을 비교군으로 IBM® SPSS® Statistics 25 software (IBM Co., Armonk, NY, USA)를 활용한 정준판별분석을 실시하였다.
그 결과, 총 2개의 정준판별함수가 산출되었으며, 제1정준판별함수(CAN1)의 경우, 고유값과 기여율은 각각 36.3과 87.7%를 나타내었고, 제2정준판별함수(CAN2)의 경우에는 각각 5.1과 12.3%를 나타내었다. 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 포함한 9개 가자미류는 정준판별 산점도 내에서 제1 및 제2정준판별함수축으로 잘 분리되었으며, 제1정준판별함수에서는 cox1 유전자 영역이 가장 큰 영향을 나타내었고, 제2정준판별함수에서는 rag1 유전자 영역이 가장 큰 영향을 주는 요인으로 확인되었다. 이에 따라, 제1축으로는 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 비롯한 참가자미, 첨치가자미, 각시가자미 및 검정가자미가 음의 값을, 돌가자미, 강도다리, 기름가자미 및 용가자미가 양의 값을 나타내었고, 제2축으로는 돌가자미를 비롯한 검정가자미, 첨치가자미, 각시가자미, 기름가자미 및 용가자미가 음의 값을, 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 비롯한 강도다리, 검정가자미가 양의 값을 나타내었다(도 6). 따라서, 표적종인 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 비롯하여 비표적종인 첨치가자미, 각시가자미, 기름가자미, 용가자미까지 총 7종이 100%의 판별적중률을 나타내었다(표 10, 도 6). 그러나, 참가자미와 검정가자미는 일부 시료가 중복되는 양상을 나타내어 구분이 용이하지 않았다(표 10, 도 6)(1, 돌가자미(Platichthys bicoloratus, PB); 2, 돌가자미(♀)×강도다리(♂)(Platichthys bicoloratus♀ × Platichthys stellatus♂, PB×PS); 3, 강도다리(Platichthys stellatus, PS); 4, 참가자미(Pleuronectes herzensteini, PH); 5, 첨치가자미(Atheresthes stomias, AS); 6, 각시가자미(Limanda aspera, LA); 7, 검정가자미(Reinhardtius hippoglossoides, RH); 8, 기름가자미(Glyptocephalus stelleri, GS); 9, 용가자미(Cleisthenes pinetorum, CP)).
　 예측 소속집단 전체
PB1 PB×PS2 PS3 PH4 AS5 LA6 RH7 GS8 CP9
원래값 빈도 PB1 20 0 0 0 0 0 0 0 0 19
PB×PS2 0 20 0 0 0 0 0 0 0 20
PS3 0 0 18 0 0 0 0 0 0 18
PH4 0 0 0 4 0 0 0 0 0 4
AS5 0 0 0 0 4 0 0 0 0 4
LA6 0 0 0 0 0 3 0 0 0 3
RH7 0 0 0 4 0 0 0 0 0 4
GS8 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4
CP9 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4
% PB1 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
PB×PS2 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
PS3 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
PH4 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
AS5 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
LA6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 100.0
RH7 0.0 0.0 0.0 50.0 0.0 0.0 50.0 0.0 0.0 100.0
GS8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 100.0
CP9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 100.0
교차 검증값 빈도 PB1 20 0 0 0 0 0 0 0 0 19
PB×PS2 0 20 0 0 0 0 0 0 0 20
PS3 0 0 18 0 0 0 0 0 0 18
PH4 0 0 0 4 0 0 0 0 0 4
AS5 0 0 0 0 4 0 0 0 0 4
LA6 0 0 0 0 0 3 0 0 0 3
RH7 0 0 0 2 0 0 2 0 0 4
GS8 0 0 0 0 0 0 0 4 0 4
CP9 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4
% PB1 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
PB×PS2 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
PS3 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
PH4 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
AS5 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0
LA6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 100.0
RH7 0.0 0.0 0.0 50.0 0.0 0.0 50.0 0.0 0.0 100.0
GS8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 100.0
CP9 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 100.0
본 발명의 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 판별하기 위하여 개발된 Real-time PCR 특이프라이머는 국내 유통시장과 수입 활동에 따라 검역 및 유통 과정에서 정량화된 데이터를 기반으로 돌가자미, 강도다리 및 돌가자미(♀)와 강도다리(♂) 간 교잡종을 신속하고 정확하게 판별하여 부정 유통을 차단하고 투명성을 재고하여 소비자와 판매자를 모두 보호할 수 있는 방안을 마련할 수 있을 것으로 예상된다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1 의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 를 포함하는 제 1 프라이머 세트; 및/또는
    서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 4 의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머 를 포함하는 제 2 프라이머 세트;
    를 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1프라이머 세트는 cox1(Cytochrome c oxidase subunit 1) 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제2프라이머 세트는 rag1(Recombination activating gene 1) 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 돌가자미는 암컷이고, 강도다리는 수컷인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 돌가자미(Platichthys bicoloratus), 강도다리 (Platichthys stellatus), 첨치가자미(Pleuronectes herzensteini), 각시가자미(Limanda aspera), 기름가자미(Glyptocephalus stelleri), 용가자미(Cleisthenes pinetorum), 참가자미(Atheresthes stomias) 및 검정가자미(Reinhardtius hippoglossoides) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 가자미 품종을 추가적으로 판별할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 검출한계는 0.005 ng/μL ~ 50 ng/μL 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항의 조성물을 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별용 키트.
  10. i) 개체로부터 Genomic DNA 를 추출하는 단계;
    ii) 상기 제1항의 조성물을 이용하여 상기 추출된 Genomic DNA를 증폭하는 단계; 및
    iii) 상기 증폭된 DNA 산물을 분석하는 단계;
    를 포함하는 돌가자미 및 강도다리 교잡종 판별방법.
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