KR20150097403A - 은행나무 암, 수 구별용 프라이머 및 이를 이용한 암, 수 구별 방법 - Google Patents

은행나무 암, 수 구별용 프라이머 및 이를 이용한 암, 수 구별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 은행나무에서 분리한 GB-C 및 GB-MS 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 GB-C 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 GB-MS 프라이머 쌍을 포함하는 은행나무 암, 수 구별용 프라이머 및 은행나무 암, 수 구별 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GB-C 및 GB-MS 프라이머쌍을 이용하면 은행나무의 암, 수 구별을 안정적이고 정확하게 할 수 있는 효과가 있다. 또한, 은행나무 묘목의 암수 구분이 가능함으로 가로수에 이용되는 암나무의 조기발견이 가능하게 되어 암나무의 교체와 관리비 등의 지출을 포함한 예산낭비를 줄일 수 있을 뿐 아니라 암나무의 조기 선별을 통하여 은행 생산 농가의 수익 증대에 기여할 수 있다.

Description

은행나무 암, 수 구별용 프라이머 및 이를 이용한 암, 수 구별 방법{Primer and method for diagnosting sex of ginkgo}
본 발명은 은행나무에서 분리한 GB-C 및 GB-MS 프라이머 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 GB-C 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 GB-MS 프라이머 쌍을 포함하는 은행나무 암, 수 구별용 프라이머 및 은행나무 암, 수 구별 방법에 관한 것이다.
은행나무는 살아 있는 화석으로 불릴 만큼 지구상에 나타난 역사가 길고 세계적으로 널리 퍼져 있는 수목으로서, 우리나라에서는 주로 가로수로 사용되며 은행을 수확하기 위한 용도로 주로 사용되고 있다. 은행나무는 결실을 위한 화분을 제공하는 수나무와 은행의 결실을 맺는 암나무가 각각의 다른 개체로 존재하는 암수 딴 그루(자웅이주) 식물이다. 그러나 은행나무가 가로수로 사용될 경우 가을철 은행 결실기에 은행의 독특한 악취와 낙과된 은행으로 인하여 도시 경관을 악화시키는 경우가 빈번하게 일어나고 있으며, 은행생산 농가에서는 암나무와 수나무의 식별이 어려워 은행생산용 암나무만을 구별하여 식재하는데 어려움이 있는 실정이다. 지금까지는 은행나무의 성을 식별하기 위해서 꽃의 형태나 열매의 결실 여부를 확인하여 왔으나, 어린묘목에서는 확인하기가 어렵고 성목이 되어 개화가 가능한 시기가 되었을 때 확인이 가능하므로 시간이 오래 걸리며 성목이 되는 시간동안의 노동력과 경제적 기회비용의 증가로 은행나무 생산과 이용에 있어 효율성이 떨어지는 문제점이 발생되어왔다.
상기한 문제를 해결하기 위한 기술은 Jiang et al (2003), Identification of a sex-associatied RAPD marker in Ginkgo biloba, Acta Botanica Sinica, 2003, 45:742-747 에서 은행나무의 암수나무가 식별되는 RAPD 유전양상을 보고하였으며, Liao et al(2009), Development and application of SCAR markers for sex identification in the dioecious species Ginkgo bilona L., Euphytica, 169: 49-55 에서는 은행나무의 암수나무 각각에 대한 SCAR 마커를 보고하였다.
그러나 상기 연구에서는 RAPD 기법상의 불안정성을 배제할 수 없으며, SCAR 마커의 우성 마커 성질을 보완할 수 없는 단점이 있었다. 또한, 상기 연구결과들은 본 발명의 분자표지자와 식별과정의 방법과는 상이하다.
따라서 은행나무의 암수구분을 안정적이고 정확하게 구분할 수 있는 새로운 방법이 필요한 실정이다.
한국등록특허 제1207424호 한국등록특허 제1133104호
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 GB-C 프라이머 쌍; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 GB-MS 프라이머 쌍을 포함하는, 은행나무 암, 수 구별용 프라이머를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 은행나무 암수 구별 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
나아가 본 발명은 상기 GB-C 및 GB-MS 프라이머쌍을 포함하는 은행나무 암수 구별용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 GB-C 프라이머 쌍; 또는
서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 GB-MS 프라이머 쌍을 포함하는, 은행나무 암, 수 구별용 프라이머를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GB-C 프라이머 쌍은 674bp의 은행나무 특이 PCR 산물을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GB-MS 프라이머 쌍은 405bp의 은행나무 특이 PCR 산물을 증폭할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 은행나무로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 GB-C 프라이머와 GB-MS 프라이머쌍을 동시에 이용하여 multiplex PCR을 수행하는 단계; (c) Multiplex PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및 (d) 상기 은행나무의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 은행나무 암수 구별 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 상기 GB-C 및 GB-MS 프라이머쌍을 포함하는 은행나무 암수 구별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 GB-C 및 GB-MS 프라이머쌍을 이용하면 은행나무의 암, 수 구별을 안정적이고 정확하게 할 수 있는 효과가 있다. 또한, 은행나무 묘목의 암수 구분이 가능함으로 가로수에 이용되는 암나무의 조기발견이 가능하게 되어 암나무의 교체와 관리비 등의 지출을 포함한 예산낭비를 줄일 수 있을 뿐 아니라 암나무의 조기 선별을 통하여 은행 생산 농가의 수익 증대에 기여할 수 있다.
도 1은 은행나무 암수 식별 GB-C 분자표지자를 이용한 PCR 분획양상을 나타낸 결과이다(♂: 수나무, ♀: 암나무).
도 2는 은행나무 암수 식별 GB-MS 분자표지자를 이용한 PCR 분획양상을 나타낸 결과이다(♂: 수나무, ♀: 암나무).
도 3은 은행나무 암수 식별 GB-C, GB-MS 분자표지자를 이용한 multiplex PCR 분석양상을 나타낸 결과이다(♂: 수나무, ♀: 암나무).
은행나무는 자웅이주로서 낙엽성 침엽교목으로서 수고 60m 이상, 직경 5m까지 자라는 수종으로 원산지는 중국이며, 한국 일본 등 3국에 분포하며, 한국의 분포는 전국적인 수평분포를 보이며 수직적으로는 대개 표고 500m 이하에 분포한다.
내화성과 내한성이 강하며 생장이 빠르고 대기오염에 대한 저항성도 강하여 공원수, 가로수, 방풍수, 방화수 등으로 식재되며, 또한 염분이 있는 토양이나 바닷바람에는 약하나 내륙에서는 토질을 가리지 않고, 특기할만한 병충해는 없다. 재질은 단단하여 건축재, 가구재, 조각재 등 고급재로 쓰인다.
가을에 열매가 익기 전에 움직이는 정자에 의하여 수정되며 종자는 식용 및 약용으로 쓰이며 최근에는 은행잎 속의 약용성분을 추출하여 고혈압, 심장병 등의 치료에 이용되고 있다.
한편, 은행나무가 가로수로 사용될 경우 가을철 은행 결실기에 은행의 독특한 악취와 낙과된 은행으로 인하여 도시 경관을 악화시키는 경우가 빈번하게 일어나고 있으며, 은행생산 농가에서는 암나무와 수나무의 식별이 어려워 은행생산용 암나무만을 생산하는데 어려움이 있는 실정이다. 지금까지는 은행나무의 성을 식별하기 위해서 꽃의 형태나 열매의 결실 여부를 확인하여 왓으나 어린묘목에서는 확인하기가 어렵고 성목이 되어 개화가 가능한 시기가 되었을 때 확인이 가능하므로 시간이 오래 걸리며 성목이 되는 시간동안의 노동력과 경제적 기회비용의 증가로 은행나무 생산과 이용에 있어 효율성이 떨어지는 문제점이 발생되어 왔다.
따라서 상기한 문제점을 해결하기 위하여 많은 연구가 진행되었으나 이와 관련된 연구들은 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisms)로 변이를 조사하기도 하는데 상당량의 DNA와 순수한 정제가 필요하고 시간, 경비, 노력이 들며 많은 수의 표본을 시료로 실험하기에는 부적절하다는 단점들이 있다.
따라서 본 발명자들은 비교적 짧은 단편의 프라이머를 이용하는 RAPD 기법의 불안정성과 낮은 재현성을 해결하고, 우리나라 은행나무에 적합한 마커를 개발하기 위하여 RAPD 기법에서 소개된 유전염기서열을 기반으로 수나무와 암나무 동시에 확인된 한쌍의 표지자 GB-001과 은행나무의 수나무에 특이적인 한쌍의 표지자 GB-002 총 두 쌍의 표지자를 이용하여 안정성과 재현성이 우수한 은행나무 성별을 판별하는 방법을 개발하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 GB-C와 GB-MS 유전자를 효과적으로 검출할 수 있는 프라이머를 고안하였고, 이를 통해 상기 GB-C 유전자는 수나무와 암나무를 동시에 확인할 수 있으며, GB-MS 유전자는 수나무에서 특이적으로 과다 발현됨을 PCR 및 multiplex PCR을 통해 확인하였다(실시예 2 참조).
따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 GB-C 및 GB-MS 유전자를 은행나무의 암, 수나무 구별용 마커로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
본 발명에서, 상기 암, 수 구별이라는 용어는 은행나무 개체의 암나무, 수나무 여부를 판가름하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 암, 수 구별은 암, 수 구별 마커의 역할을 하는 유전자의 발현 유무를 확인하여 결과에 따라 개체의 암,수를 구별하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 GB-C 및 GB-MS 유전자의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 은행나무 암, 수 구별용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 GB-C 또는 GB-MS 유전자의 수준은, 바람직하게 상기 각각의 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 GB-C 또는 GB-MS 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.
따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 GB-C 및 GB-MS 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 가장 바람직하게는 GB-C 유전자의 경우, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍일 수 있으며, GB-MS 유전자의 경우, 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍일 수 있다.
상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 GB-C 및 GB-MS 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 GB-C 및 GB-MS 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 항체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 GB-C 및 GB-MS 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 은행나무 암, 수 구별용 조성물을 은행나무 암, 수 구별용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 은행나무 암, 수 구별용 키트에 포함되는 은행나무 암, 수 구별용 조성물은 GB-C 및 GB-MS 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 은행나무 암, 수 구별용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 은행나무 암, 수 구별용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
은행나무의 암, 수 구별 프라이머 제작
은행나무에서 추출한 total DNA를 이용하여 10-mer 길이의 랜덤 프라이머(random primer)를 이용하여 RAPD(random amplified polymorphic DNA)분석을 실시하여 암나무와 수나무에서 공통으로 나타나는 염기서열과 수나무에서만 나타나는 염기서열을 발견하였고 이들을 클로닝하여 염기서열을 획득하였으며 이 염기서열을 바탕으로 암수에서 모두 나타나는 band를 증폭하는 프라이머(GB-C)와 수나무에서만 나타나는 band를 증폭하는 프라이머(GB-MS) 세트를 디자인 및 제작하였다(표 1 참조).
Figure pat00001

< 실시예 2>
Multiplex PCR 수행
상기 다형성을 관찰하기 위하여 수행한 PCR 반응 혼합물(20㎕)의 조성은 다음과 같다: 은행나무 게놈 DNA 10ng, 한쌍의 GB-C 프라이머 각 0.25μM, GB-MS 프라이머 각 0.25μM, 10 × PCR 완충용액 2㎕, dNTP 0.25mM, BSA 25㎍/ml, 1 unit DNA 중합효소 및 나머지 증류수. PCR 반응의 온도 조건은 94℃에서 5분간 주형 DNA를 변성시킨후, 94℃에서 1분간 변성; 63℃ 에서 1분간 어닐링; 및 72℃에서 2분간 연장을 총 35회 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 연장하였다. 증폭된 산물은 1.2% 아가로스겔에서 100 volt 로 30분 동안 전기영동 되었으며, UV 광선을 조사하여 밴드의 증폭양상을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제작된 GB-C 및 GB-MS 프라이머를 이용하여 은행나무 시료를 대상으로 multiplex PCR 을 실행한 후 아가로스 겔에서 전기영동하여 나타나는 유전적 다형성을 관찰한 결과, 수나무와 암나무에 공통적인 GB-C 마커에서는 약 674bp의 DNA 단편이 관찰되었으며, 수나무 특이적인 마커인 GB-MS 마커에서는 약 405bp의 DNA 단편이 관찰되었음 알 수 있었다(도 1 내지 3 참조).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (5)

  1. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 GB-C 프라이머 쌍; 또는
    서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 GB-MS 프라이머 쌍을 포함하는, 은행나무 암, 수 구별용 프라이머.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 GB-C 프라이머 쌍은 674bp의 은행나무 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 은행나무 암, 수 구별용 프라이머.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 GB-MS 프라이머 쌍은 405bp의 은행나무 특이 PCR 산물을 증폭하는 것을 특징으로 하는 은행나무 암, 수 구별용 프라이머.
  4. (a) 은행나무로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고 제1항의 GB-C 프라이머와 GB-MS 프라이머쌍을 동시에 이용하여 multiplex PCR을 수행하는 단계;
    (c) Multiplex PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계; 및
    (d) 상기 은행나무의 크기별 분리 결과를 비교하는 단계를 포함하는 은행나무 암수 구별 방법.
  5. 제1항의 GB-C 및 GB-MS 프라이머쌍을 포함하는 은행나무 암수 구별용 키트.
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