KR102026397B1 - 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 등온 증폭 방법 - Google Patents

은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 등온 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 등온 증폭 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 특정 서열로 구성된 등온 증폭용 프라이머 세트는 은행나무의 수나무에 특이적인 표적만을 등온 증폭 방법으로 검출함으로써, 경제적이고 손쉽게 은행나무의 암수나무를 구분하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 등온 증폭 방법{PRIMER SET FOR LOOP-MEDIATED ISOTHEMAL AMPLIFICATION FOR GENDER IDENTIFYING OF GINKGO BILOBA AND LOOP-MEDIATED ISOTHEMAL AMPLIFICATION USING THE SAME}
본 발명은 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 등온 증폭 방법에 관한 것이다.
은행나무는 고생대 페름기부터 자라기 시작하여 신생대 에오세에 번성하였던 식물로, 현존하는 종은 은행나무문 중에서 유일하게 남아있어 '살아있는 화석'으로도 불린다. 대체로 높이 5 내지 10 m이고, 최고 40 m에 이르는 것도 있다. 지름이 4 m에 달하는 낙엽교목으로 암수가 따로 자라는 자웅이주의 특성을 갖는다. 병충해가 거의 없고, 짙은 그늘을 제공한다는 점에서 국내에서는 주로 가로수로 사용된다. 그러나, 가을철 은행 결실기에 은행의 독한 악취뿐만 아니라, 길거리에 낙과된 은행으로 인하여 도시 경관을 약화시키고, 점액물질에 의해 염증을 유발할 수 있다는 점에서 문제가 있다.
은행나무의 열매인 은행은 '은빛 나는 살구'라는 뜻으로, 그 모양이 살구와 비슷하고 표면에 은색의 흰 가루가 덮여 있다. 은행에는 신경조직성분인 레시틴, 아스파라긴산, 비타민 D의 모체인 엘고스테린이 함유되어 있어 신경쇠약, 전신피로 등을 개선하는 효과가 있다. 또한, 은행은 글로불린을 비롯한 단백질, 지방, 칼슘, 단백질, 인, 철분, 펙틴, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2 등이 포함되어 있어 영양학적으로도 가치가 높다. 이에, 은행생산 농가에서는 은행을 생산하는 암나무만을 재배하기 위해, 이를 은행나무의 꽃 형태나 은행의 결실여부를 통해 구분하고 있다. 따라서, 은행나무가 성목이 되기 이전인 묘목단계에서 암수 구분을 할 수 있는 기술의 개발이 요구된다.
현재 은행나무의 암수구분는 암나무의 수나무의 핵형분석을 통해 세포내 존재하는 부수염색체(satellite chromosome)이 수나무에서는 3개, 암나무에서는 4개 존재하는 점에 기초한 핵형 분석 방법이다. 그러나, 이와 같은 분석 방법은 실험과정이 복잡하고 고도의 분석기술을 요한다. 또한, RAPD 방법을 이용하여 확보된 염기서열을 기반으로 은행나무의 수나무에 대한 특이적인 SCAR 표지자를 이용한 암수구분 방법이 있다. 그러나, RAPD 방법은 PCR 기반의 분자마커 기술로서 전문 인력과 고가의 장비를 요한다는 단점이 있다.
대한민국 등록특허 제10-1395343호
본 발명의 목적은 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트 및 상기 등온 증폭용 프라이머 세트를 이용한 등온 증폭 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 19 내지 22로 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 은행나무로부터 수득된 게놈 DNA 주형 및 본 발명에 따른 등온 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 등온 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 특정 서열로 구성된 등온 증폭용 프라이머 세트는 은행나무의 수나무에 특이적인 표적만을 등온 증폭 방법으로 검출함으로써, 경제적이고 손쉽게 은행나무의 암수나무를 구분하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 SCAR 프라이머를 이용해서 은행나무의 수나무에서만 특이적으로 확인되는 서열을 확인한 결과 도면이다.
도 2는 은행나무의 수나무에서만 특이적으로 확인되는 서열이 암나무에서는 증폭되지 않음을 확인한 결과 도면이다(M: 사이즈 마커, 1 및 2: 수나무의 게놈 DNA를 주형으로 사용, 3 및 4: 암나무의 게놈 DNA를 주형으로 사용).
도 3은 은행나무의 암수나무 구분을 위해 제작된 등온 증폭용 프라이머 후보군을 이용하여 등온 증폭 반응을 수행한 결과 도면이다(A: 후보군 1, B: 후보군 2, C: 후보군 3, D: 후보군 4, E: 후보군 5, ○: 주형 DNA 첨가, ×: 주형 DNA 미첨가).
도 4는 은행나무의 암수나무 구분을 위한 프라이머로 선별된 후보군 5 프라이머가 주형 DNA에 결합하는 위치를 나타낸 도면이다.
도 5는 은행나무의 암수나무 구분을 위한 등온 증폭 온도 조건을 확인하기 위한 결과 도면이다(M: 사이즈 마커, 1: 59℃, 2: 60℃, 3: 61℃, 4: 62℃, 5: 63℃, 6: 64℃, 7: 65℃, 8: 66℃).
도 6은 은행나무의 암수나무 구분을 위해 포함되는 MgSO4의 농도 조건을 확인하기 위한 결과 도면이다(M: 사이즈 마커, 1: 2 mM, 2: 4 mM, 3: 6 mM, 4: 8 mM).
도 7은 은행나무의 암수나무 구분을 위해 포함되는 외부 및 내부 프라이머의 비율 조건을 확인하기 위한 결과 도면이다(M: 사이즈 마커, 1: 1:2, 2: 1:4, 3: 1:6, 4: 1:8).
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 확립된 조건으로 은행나무의 암수나무 구분을 위해 수행된 등온 증폭의 결과 도면이다(M: 사이즈 마커, 1 내지 4: 수나무의 게놈 DNA를 주형으로 사용, 5 내지 8: 암나무의 게놈 DNA를 주형으로 사용, ○: 주형 DNA 첨가, ×: 주형 DNA 미첨가).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 19 내지 22로 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "등온 증폭 방법(isothemal amplification)"은 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)이 변성, 어닐링 및 연신 단계가 각각 다른 온도 조건하에서 수행되는 것과 달리, 한 온도 조건하에서 DNA 증폭반응을 수행하기 때문에 중합효소 연쇄반응(PCR)과 달리 별도의 특수한 기기가 필요하지 않은 증폭 방법을 의미한다. 일반적으로 등온 증폭 방법은 60 내지 65℃에서 1시간 내에 목표 핵산을 109개까지 증폭시킬 수 있으며, 60 내지 65℃의 온도를 유지할 수 있는 항온 유지 장치만 있으면 수행할 수 있다. 또한, 등온 증폭 방법은 수행 시간이 30 내지 60분 정도로 짧고 육안으로 관찰할 수 있다는 점에서 간편하게 DNA를 증폭 및 확인할 수 있는 방법이다.
상기 등온 증폭 방법은 고리매개 등온 증폭 방법일 수 있다. 상기 용어, "고리매개 등온 증폭 방법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 내부 프라이머(inner primer, FIB/BIF) 및 외부 프라이머(outer primer, B3/F3c)를 사용하여 수행되는 증폭 방법의 하나이다. 상기 고리매개 등온 증폭 방법은 내부 프라이머가 주형에 먼저 결합하여 신장된 후, 각 DNA 나선의 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장된다. 이때, 외부 프라이머의 신장으로 인해 가닥(strand) 변위가 발생하고, 그에 따라 먼저 합성된 가닥은 주형에서 떨어지는데, 떨어진 합성 가닥이 5' 말단에서부터 고리(loop) 구조를 형성하고, 이어서 3' 말단에도 동일한 과정으로 고리 구조가 형성되며, 이를 매개로 증폭 반응이 일어난다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 조성물 및 키트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 은행나무의 암수구분을 위한 조성물에 포함되는 프라이머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 본 발명에 따른 프라이머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 은행나무의 암수구분을 위한 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 프라이머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
나아가, 본 발명은 은행나무로부터 수득된 게놈 DNA 주형 및 본 발명에 따른 등온 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 등온 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭 방법을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있고, 상기 게놈 DNA는 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 방법으로 수득될 수 있다.
상기 등온 증폭은 고리매개 등온 증폭 방법일 수 있다. 상기 고리매개 등온 증폭 방법은 통상의 기술분야에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있고, 통상의 기술자에 의해 적절히 변행되어 수행될 수도 있다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 등온 증폭 방법은 59 내지 65℃, 59 내지 63℃, 59 내지 61℃, 59 내지 60.5℃, 59.5 내지 65℃, 59.5 내지 63℃, 59.5 내지 61℃ 또는 59.5 내지 60.5℃에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 등온 증폭은 통상적인 방법으로 제조된 반응물을 사용하여 수행될 수 있다. 일례로, 상기 반응물은 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 반응물은 1 내지 7 mM, 1 내지 5 mM, 1 내지 3 mM, 1.5 내지 7 mM, 1.5 내지 5 mM 또는 1.5 내지 3 mM 농도의 황산마그네슘(MgSO4)을 포함할 수 있다. 또한, 상기 반응물은 외부 및 내부 프라이머를 적절한 비율로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 외부 및 내부 프라이머는 1:2 내지 10, 1:2 내지 9, 1:2 내지 8, 1:2 내지 7, 1:2 내지 6, 1:2 내지 5, 1:3 내지 10, 1:3 내지 9, 1:3 내지 8, 1:3 내지 7, 1:3 내지 6, 1:3 내지 5의 몰비율로 포함될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 은행나무 수나무의 게놈 DNA(genome DNA)를 이용한 SCAR 프라이머 증폭 유전자 서열 확인
은행나무 수나무의 잎으로부터 확보한 게놈 DNA를 주형으로 SCAR 정방향 프라이머(서열번호 1: GCTGATTAAATATGGGAGTATGC) 및 SCAR 역방향 프라이머(서열번호 2: GGTGCTGAGAAGGAACTTTTAC)를 이용하여 표적 유전자를 하기 표 1에 기재된 조건으로 증폭하였다.
초기 변성 단계 95℃, 5분 1회
변성 단계 95℃, 30초 35회
어닐링(annealing) 단계 63.5℃, 30초
연신(elongation) 단계 72℃, 50초
후기 연신 단계 72℃, 7분 1회
증폭된 표적 유전자의 서열을 솔젠트 사(Solgent, 한국)에 의뢰하여 확인하고, 확인된 서열이 NCBI 웹페이지에서 GenBank No. FI136224의 서열과 일치함을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 은행나무 암수나무의 게놈 DNA를 이용한 SCAR 프라이머에 대한 유전자 증폭 확인
은행나무의 암나무 및 수나무 잎으로부터 확보한 게놈 DNA를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. PCR은 서열번호 1 및 2로 기재된 염기서열로 구성된 프라이머를 이용하여 상기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 수행되었다. 수득된 PCR 산물을 2% 아가로오스 겔에 전기영동하여 확인한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 수나무의 게놈 DNA를 주형으로 사용한 경우에만 PCR 산물이 증폭되었다. 따라서, 상기로부터 서열번호 1 및 2로 기재된 염기서열로 구성된 SCAR 프라이머는 은행나무의 수나무에서만 특이적임을 알 수 있었다.
실시예 3. 고리기반 등온 증폭을 위한 프라이머 세트 후보군의 선별
실시예 2에서 확인된 수나무 특이적인 PCR 증폭부위를 표적으로 하는 고리기반 등온 증폭을 위한 프라이머 세트를 다음과 같은 방법으로 선별하였다.
먼저, 하기 표 2에 기재된 바와 같은 프라이머 세트를 제작하였다.
세트 이름 서열(5'→3') 서열번호
후보군 1 F3 ACTCTATTGAAGGGTGTGAAG 서열번호 3
B3 CCCAACTTATAATAGCTCTTTCA 서열번호 4
FIP GGCATTTGGTTCAAACACCTTACTAGAATCAATCACACTATAGCTACA 서열번호 5
BIP ACTATTAGTAGGAAGTAACCCTCCATCTCACTCTTCTGTTGGTAG 서열번호 6
후보군 2 F3 CATAGTAAGGTGTTTGAACCAA 서열번호 7
B3 GGTGCTGAGAAGGAACTT 서열번호 8
FIP TGGAGGGTTACTTCCTACTAATAGTATGCCCTTCCTCATAAGAGA 서열번호 9
BIP CTAGATCCTATTGATACCCCTACCATCTTTAATGGCCCCAACT 서열번호 10
후보군 3 F3 AGGTGCTACTCTATTGAAGG 서열번호 11
B3 CCCAACTTATAATAGCTCTTTCAC 서열번호 12
FIP GGCATTTGGTTCAAACACCTTACTATGAAGAATAGGAATCAATCACACT 서열번호 13
BIP ACTATTAGTAGGAAGTAACCCTCCATCTCACTCTTCTGTTGGTAG 서열번호 14
후보군 4 F3 GGTGTTTGAACCAAATGCC 서열번호 15
B3 GGTGCTGAGAAGGAACTT 서열번호 16
FIP AGGATCTAGAATTTGGAGGGTTACTTCATAAGAGAGAATAAGAACATTCC 서열번호 17
BIP GATACCCCTACCAACAGAAGAGTACTTTCTTTAATGGCCCCAA 서열번호 18
후보군 5 F3 GTGTATAAGTTGAGAGGATTGG 서열번호 19
B3 CTTATTCTCTCTTATGAGGAAGG 서열번호 20
FIP GCTAGTAGCACCCTTTTTAATCAACGCACCACCACTAAATCAAGT 서열번호 21
BIP TTGAAGGGTGTGAAGAATAGGAATCCATTTGGTTCAAACACCTTAC 서열번호 22
제작된 고리기반 등온 증폭을 위한 프라이머 세트 후보군의 효율을 확인하기 위해, 상기 표 2에 기재된 후보군 1 내지 5를 이용하여 등온 증폭을 수행하였다. 먼저, 2.5 ㎕의 등온 증폭 반응 완충액, 5 μM의 외부 프라이머(outer primer), 20 μM의 내부 프라이머(inner primer), 2 ㎕의 10 mM dNTP, 2 mM MgSO4(등온 증폭 반응 완충액에 2 mM포함) 및 1 ㎕의 주형 DNA를 혼합하고, 총 24 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하여 PCR 반응물을 얻었다. 상기 PCR 반응물을 95℃에서 5분 동안 가열한 뒤, 상온에서 방치하여 온도를 낮췄다. 5분 후, 1 ㎕의 Bst 중합효소(8 unit)(NEB, 영국)를 첨가하고, 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤, Bst 중합효소의 활성 억제를 위해, 80℃에서 10분 동안 반응시켰다. 수득된 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 프라이머 후보군 1 내지 4를 이용하여 수행된 등온 증폭 결과와 달리, 프라이머 후보군 5를 이용하여 수행된 등온 증폭에 의해 표적 부위가 증폭된 것을 확인하였다. 따라서, 은행나무의 암수나무 구분을 위한 등온 증폭용 프라이머로 서열번호 19 내지 22로 기재된 염기서열로 구성된 프라이머를 선별하였다.
또한, 상기 선별된 프라이머가 주형 DNA에서 결합하는 위치를 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
실시예 4. 등온 증폭 반응 조건 확립
4-1. 온도조건 확립
실시예 3에서 선별된 프라이머를 이용한 고리기반 등온 증폭을 위한 온도조건을 다음과 같은 방법으로 확립하였다. 실험은, Bst 중합효소를 첨가하고 반응온도를 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 65℃로 수행한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3에 기재된 방법 및 조건으로 등온 증폭을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 60℃의 온도에서 등온 증폭 산물을 확인할 수 있었다.
4-2. 황산마그네슘의 첨가 농도 확립
실시예 3에서 선별된 프라이머를 이용한 고리기반 등온 증폭에 첨가되는 황산마그네슘(MgSO4)의 농도를 다음과 같은 방법으로 확립하였다. 실험은, 등온 증폭용 반응물에 2, 4, 6 또는 8 mM의 MgSO4(등온 증폭 반응 완충액에 포함된 MgSO4의 농도 포함)를 포함시키고, 60℃의 온도에서 등온 증폭한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3에 기재된 방법 및 조건으로 등온 증폭을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 2 mM의 MgSO4가 포함된 경우에 등온 증폭 산물이 가장 뚜렷하게 확인되었고, MgSO4의 농도가 증가함에 따라 등온 증폭 산물이 감소하였다.
4-3. 외부 프라이머 및 내부 프라이머의 비율 조건 확립
실시예 3에서 선별된 프라이머를 이용한 고리기반 등온 증폭에 첨가되는 외부 프라이머 및 내부 프라이머의 비율을 다음과 같은 방법으로 확립하였다. 실험은, 등온 증폭용 반응물에 내부 프라이머의 농도를 20 mM로 고정하고, 외부 프라이머 및 내부 프라이머의 비율을 1:2, 1:4, 1:6 또는 1:8이 되도록 첨가하며, 2 mM의 MgSO4를 첨가하여 60℃의 온도에서 등온 증폭한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3에 기재된 방법 및 조건으로 등온 증폭을 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 외부 및 내부 프라이머의 비율이 1:4인 경우에 등온 증폭 산물이 가장 뚜렷하게 확인되었고, 비율이 증가함에 따라 등온 증폭 산물이 감소하였다.
실험예 1. 확립된 조건을 이용한 은행나무의 암수나무 구분 확인
실시예 4에서 확립된 조건을 이용하여 은행나무의 암수나무를 고리기반 등온 증폭 방법으로 확인하였다. 먼저, 2 mM의 MgSO4를 첨가하고, 외부 및 내부 프라이머의 비율이 1:4가 되도록 첨가한 것을 제외하고는, 실시예 3과 동일하게 등온 증폭용 반응물을 제조하였다. 제조된 반응물을 이용하여 60℃의 온도에서 등온 증폭한 것을 제외하고는, 상기 실시예 3에 기재된 방법 및 조건으로 등온 증폭을 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 선별된 후보군 5의 프라이머 셋트를 이용하여 등온 증폭을 수행한 결과, 수나무의 게놈 DNA를 주형으로 사용한 경우에만 특이적으로 등온 증폭 산물이 확인되었다.
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 등온 증폭용 프라이머 셋트는 은행나무의 암수를 구분하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
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Claims (8)

  1. 서열번호 19 내지 22로 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭용 프라이머 세트.
  2. 제1항의 등온 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 조성물.
  3. 제1항의 등온 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 키트.
  4. 은행나무로부터 수득된 게놈 DNA 주형 및 제1항의 등온 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 등온 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 등온 증폭 방법은 고리매개 등온 증폭 방법인, 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 등온 증폭은 59 내지 65℃에서 수행되는, 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 등온 증폭은 1 내지 7 mM 농도의 황산마그네슘(MgSO4)을 포함하는 반응물로 수행되는, 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 등온 증폭은 외부 프라이머 및 내부 프라이머를 1:2 내지 10의 몰비율로 포함하는 반응물로 수행되는, 은행나무의 암수구분을 위한 등온 증폭 방법.
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