KR101599427B1 - 대한민국 연안 미세조류인 니츠치아 임프로비사의 종 판별 방법과 이에 따른 니츠치아 임프로비사의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ｄｎａ 칩 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국 연안에 서식하는 미세조류의 종(species)을 판별하는 방법과, 이를 위한 미세조류의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 대한 것으로, 미세조류의 종 간에 구별되는 DNA 서열을 임의로 만들어서 미세조류의 종 판별을 간단하고 용이할 수 있는 것이며, 그 중에서도 니츠치아 임프로비사(Nitzschia improvisa) 종을 검출할 수 있는 것이다.

Description

대한민국 연안 미세조류인 니츠치아 임프로비사의 종 판별 방법과 이에 따른 니츠치아 임프로비사의 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, ＤＮＡ 칩 및 키트{Identifying Method of microalgae Nitzschia improvisa in Southern Sea of Korea, Polynucleotide Probe, DNA Chip and Kit for Identifying The Same}

본 발명은 대한민국 연안에 서식하는 다양한 미세조류(microalgae)의 종(species)을 판별하기 위한 것으로, 특히 다양한 미세조류의 종 간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로, 대한민국 연안에 서식하는 미세조류에 대한 유전자형을 분석하고, 간단하고 신속, 정확하게 그것의 종을 판별할 수 있는 미세조류의 종 판별 방법과 이에 따른 종 판별용 폴리뉴클레오티드 프로브, DNA 칩 및 키트에 대한 것이다.

해양 선진국에서는 자국의 해양영토 내에 서식하는 적조 원인종을 실시간 분석할 수 있는 시스템을 개발하여 관리하고 있다. 이러한 시스템은 연안에서 통합형 분자 탐침 시스템에 의해 실시간으로 DNA를 이용하여, 생물의 종 동정과 개체수 등을 실시간으로 분석하여 육상 기지국에서 모니터링 하는 기술 수준까지 이르고 있다.

이와 비교하여, 우리나라의 적조 생물 모니터링 기법은 아직까지 연구자가 직접 현미경으로 관찰하는 방법에 의한다. 현미경을 이용한 직접 관찰 방법은 미세조류의 변종이나 신종 등 새로운 생물상을 관찰할 수 있고, 정확히 분류할 수 있는 장점을 가지고 있으나, 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 전문 분류학자가 적조 생물 분류군에 따라 분류해야만 하는 문제점이 있어서, 미세조류의 미동정 및 오동정의 위험이 상시 내재되어 있다.

한편, 분자생물학적인 진단법은 현미경적 관찰법보다 표준화가 가능하고, 일반적인 정확도 측면에서 우수하다. 정량적인 분석이 가능한 Real-Time PCR법, 형광동소보합법 (fluorescence in situ hybridization, FISH), Sandwich hybridization (SH) assay법 등이 개발되어 보고된 바 있다. 그러나, 이러한 기술들은 비전문가에 의해서도 비교적 높은 신뢰성을 가진 결과를 얻을 수 있음에도 불구하고, 비용이 많이 소요되며, 높은 기술력이 요구되어 현장에서 빠른 결과 도출이 어려운 단점이 있다.

이에 따라, 현재까지는 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 이용하는 혈청학적 방법과 DNA 기반 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)법이 가장 보편적이고, 빠르며, 정확한 미세조류 종판별 결과를 얻을 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이지만, PCR 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다.

최근에는, 해양 미세조류의 종판별을 위하여 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법이 다양하게 연구되고 있고, 이를 위해서는 검출하고자 하는 유전자의 선정과 이에 따른 특이적인 프라이머(primer)의 개발이 매우 중요하며, 증폭된 반응산물을 전기영동(electrophoresis)으로 확인한 후, 최종적으로 염기서열 분석(DNA sequencing)을 해야 하는 일련의 과정을 거쳐야 한다.

하지만, 우리나라 생물다양성과 관련하여 중요 어장으로 꼽히는 대한민국 연안의 다양한 미세조류에 대하여, 생물다양성 조사를 위한 다양한 생물종을 신속 정화하게 그리고 한번에 판별할 수 있는 분자 생물학적인 연구는 국내외에서 그 사례를 찾기 어려운 실정이다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 대한민국 연안에 서식하는 미세조류의 유전자형에 따라, 미세조류의 종을 구별하여, 간단하고 신속, 정확하게 상기 미세조류의 종을 판별할 수 있는 방법을 제공하는 것이 목적이다.

미세조류의 종을 구분하는 데 있어서, 염기서열의 차이가 밝혀졌다고 하더라도 이를 신속 정확하게 분석할 수 있는 표준화된 방법이 있으면 많은 시간과 인적 자원, 비용이 줄어들 수 있다. 본 발명에서는 대한민국 연안에 서식하는 미세조류 주요 어종 14종 염기서열의 차이를 정확히 파악하고, 이를 근거로 하여 각 종마다 차이가 나도록 폴리뉴클레오티드 프로브를 제작하기 위한 것이며, 이를 포함하는 DNA칩 또는 키트를 이용하여 해당 종에 따른 염기서열 차이를 신속, 정확하게 분석할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 종간에 염기서열 차이가 있는 부위를 포함하는 15개 내지 30개의 연속적인 뉴클레오티드로 구성된 프로브와, 이것으로 구성된 DNA칩 그리고 이것들을 포함하는 키트를 제공하는 것이다. 이러한 본 발명에 의해, 하나의 슬라이드 위에서 다수의 해당 생물종에 대한 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 검사하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 미세조류의 종(species) 판별 방법은, 미세조류에서 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계; 상기 PCR 산물을 서열번호 3 내지 서열번호 4 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 미세조류의 종(species)을 판별하는 단계;를 포함한다.

그리고, 본 발명의 다른 실시형태는, 서열번호 3 내지 서열번호 4 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 미세조류의 종(species) 판별용 프로브일 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시형태는 서열번호 3 내지 서열번호 4 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 프로브를 포함하는 미세조류의 종(species) 판별용 DNA 칩인 것도 가능하다.

이와 함께, 본 발명의 또 다른 실시형태는 미세조류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와; 상기 미세조류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 종(species) 판별용 키트일 수도 있다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

이러한 본 발명은 대한민국 연안에 서식하는 다양한 미세조류의 종 간에 구별되는 임의의 DNA 서열을 기반으로, 대상 미세조류의 유전자형에 따라, 간단하고 신속, 정확하게 종을 판별할 수 있는 효과가 있다.

즉, 본 발명은 미세조류의 유전자형으로 구별하기에 가장 적합한 유전자군으로서, 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자를 선택하였고, 거기에 존재하는 특정한 단염기다형성(SNPs) 부위를 찾아내었으며, 이를 바탕으로 다양한 미세조류의 종 간에 구별되는 DNA 서열을 임의로 만들어서, 미세조류의 종 판별을 간단하고 용이하게 하였다.

또한, 본 발명은 미세조류 종 판별용 프로브, 또는 상기 프로브를 포함하는 DNA 칩이나 키트로 제작되어, 육안으로는 종을 분별하기 힘든 유생, 조미 가공물 또는 분말가루 등에 대해서도, 하나의 슬라이드 위에 시료를 올려놓는 것만으로도 그 종을 판별할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명에 따른 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 시간이 크게 단축되어, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 검사할 수 있다.

도 1 내지 도 12는 각각 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 대한민국 연안에 서식하는 주요 미세조류 14종의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I)유전자 부위의 염기서열과 그 위치를 연속적으로 나타내고 있는 모식도이고,
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세조류를 채집한 장소를 설명하기 위한 지도이고,
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세조류로부터 추출된 DNA의 증폭 산물의 크기를 나타내는 사진이고,
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 종특이적 프라이머 디자인을 하기 위하여, 14종의 미세조류 COI 유전자의 염기서열을 순서대로 배열한 것을 나타내는 모식도이고,
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 종특이적 프라이머 세트를 이용하여, 14종의 미세조류를 특이적으로 구분한 결과를 나타내는 사진이고,
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 종특이적 프라이머 세트를 이용하여, 통영해역에서 수집한 시료 속에 포함된 미세조류의 종을 판별한 사진이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 발명에 따른 미세조류의 종(species) 판별 방법은, 미세조류에서 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계(S100); 상기 PCR 산물을 서열번호 3 내지 서열번호 4 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계(S200); 및, 상기 결합 여부에 따라 상기 미세조류의 종(species)을 판별하는 단계(S300);를 포함하여 이루어지는 것이 특징이다.

본 발명자들은 우리나라 남애연안에 서식하고 있는 14종의 해양미세조류를 채집하고, 이것들의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위를 클로닝한 다음, 이들의 유전자 염기서열을 비교 분석하여 종특이적인 염기서열을 디자인한 것이며, 이를 이용한 PCR 프라이머로 각각의 해양 미세조류 종을 유효하게 판별할 수 있다는 것을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다.

상기 PCR 산물을 얻는 단계(S100)는 미세조류에 속하는 다양한 해양생물 시료에서 DNA를 추출하고, 이렇게 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 것이다.

상기 시료에서 DNA를 추출하는 것은 시료의 각 조직 혹은 다양한 가공물 등으로부터 다양한 방법에 의해 DNA를 추출할 수 있고, 이는 추출된 DNA를 분석하여 종을 판별하기 위한 것이기 때문에, 상기 시료의 어느 부위에서 DNA를 추출하는지 또는 어떠한 방법으로 추출하는지는 특별히 제한되지 않는다.

그리고, 이렇게 추출한 DNA를 PCR로 증폭하는 것 또한 검사 표본을 늘이기 위한 것으로, 증폭산물을 얻는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 다른 DNA 추출방법이나 증폭방법 또한 본 발명의 범주에 속한다는 것은 명백하다.

본 발명자들은 미세조류의 유전자형으로 구별하기에 가장 적합한 유전자군으로서, 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자를 선택하였고, 거기에 존재하는 특정한 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNPs) 부위를 찾아내었으며, 이를 바탕으로 다양한 미세조류에서 종에 따라 구별되는 DNA 서열을 임의로 만들어서, 종 판별을 간단하고 용이하게 하고자 하였다.

특히, 본 발명자들은 수많은 연구와 노력 끝에, 대한민국 연안에 서식하는 주요 해양생물 14종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자에서 서열번호 1 내지 서열번호 28에 해당하는 DNA서열이 각 생물종을 구별하기에 최적으로 적합하다는 것을 확인하였고, 그 중에서도 상기 서열번호 1 내지 서열번호 28의 DNA서열과 동일하거나 상보적인 염기서열을 가진 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하면, 종래의 다른 어떤 방법보다 현저히 우수하게 각 해당 생물종을 판별할 수 있음을 알 수 있었다.

이에 따라, 본 발명의 대상이 되는 미세조류는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 대한민국 연안에 서식하는 어종인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 대한민국의 남해 해역을 포함하는 것이 적합하다. 본 명세서에 있어서, "대한민국" 또는 "대한민국 연안"이라 함은 대한민국 국토에 인접한 바다로서, 대체로 수륙의 경계를 이루고 선(해안선이나 호안선 등)을 기준으로 일반적으로 여겨지는 정도의 근접한 바다를 포함한다. 또한, "남해" 또는 "남해 해역"이라 함은 한국 남쪽에 있는 바다로서, 대체로 동쪽은 쓰시마섬[對馬島], 서쪽은 흑산도, 남쪽은 제주도를 연결하는 해역을 뜻한다.

본 명세서에서 '다형성(polymorphism)'이란 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대립형질의 발생을 의미한다. 다형 마커 또는 부위는 발산이 일어나는 위치(locus)이다. 바람직한 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하기로는 10% 또는 20% 이상의 발생 빈도를 나타내는 두개 이상의 대립 형질을 가진다. 다형성 부위는 단일 염기쌍일 수도 있다.

도 1 내지 도 12는 각각 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 대한민국 연안에 서식하는 주요 미세조류 14종의 미토콘드리아 DNA 중 COI(Cytochrome oxidase subunit I)유전자 부위의 염기서열과 그 위치를 연속적으로 나타내고 있는 것이다. 이를 바탕으로 본 발명자들은 미세조류 14종 간에 서로 구별이 가능한 임의의 DNA 서열을 도출하였고(하기 표 1의 서열번호 1 내지 서열번호 28), 이러한 임의의 DNA 서열은 각각 다양한 종의 미세조류를 검출하기 위한 마커(marker)로 사용될 수 있다.

상기 마커는 미세조류의 종 판별을 위한 정방향 프라이머(forward primer) 및/또는 역방향 프라이머(reverse primer)로 이용될 수 있고, 도 1 내지 도 12에는 이러한 마커가 결합될 수 있는 COI 유전자 상의 위치를 표시하였다. 즉, 도 1 내지 도 12에서 굵은 볼드체로 표시된 것은 정방향 프라이머(forward primer)로 사용될 수 있는 염기서열 및 이것이 결합되는 위치를 나타내고 있고, 밑줄로 표시된 것은 역방향 프라이머(reverse primer)로 이용될 수 있는 염기서열 및 이것이 결합되는 위치를 나타내고 있다.

본 발명자들은 수많은 연구와 노력 끝에 미세조류 DNA의 COI 유전자 중에서 종간에 서로 구분되는 단염기다형성(SNPs) 부위를 찾아내었고, 이를 바탕으로 미세조류의 종을 구별하기에 가장 적합한 임의의 DNA 서열을 만들어 내었으며, 이러한 DNA 서열을 포함하는 프로브를 이용하여 미세조류의 종을 구별할 수 있다는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명은 후술하는 서열번호 1 내지 서열번호 28 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 프로브로 이용한 것이다. 이러한 프로브는 미세조류가 속하는 종에 따라 다른 DNA 서열을 근거로 제작되었기 때문에, 의도한 미세조류에 속하는 PCR 시료 산물과는 결합하지만 이외에 다른 종에 속하는 미세조류의 그것과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 28의 DNA 서열은 하기의 표 1에 나타낸 바와 같다.

[대한민국 연안에 서식하는 주요 미세조류의 종 판별을 위한 DNA 서열]

No.	Species	Primer		서열번호	Amplicon (bp)
1	Skeletonema marinoi	Forward	GCTGGAACCGCATTGTCTT	1	104
		Reverse	TGTCCTGTGACGATAACATTGT	2
2	Nitzschia improvisa	Forward	TGAGAATTAGCAGGTCCAGGTA	3	182
		Reverse	AAACGAGGGAAAGCCATATCAG	4
3	Chaetoceros brevis	Forward	AACTTAGCACAACCGAACAGTA	5	273
		Reverse	TACAGTCCAACCAGTACCTACA	6
4	Ditylum brightwellii	Forward	GCTATATCTGGTGTTGCTGGTA	7	306
		Reverse	ACCTCCTGAGTGTGCTGTAG	8
5	Asterionellopsis glacialis	Forward	AATCGCTTCGGTTCTAACTGAA	9	290
		Reverse	ACATTGTGATTGCTCCTGCTAA	10
6	Chaetoceros protuberans	Forward	GGGCTCCTGACATGGCTTT	11	111
		Reverse	CAGTACCTGCTCCAGACTCTAC	12
7	Navicula gregaria	Forward	GTCATTCAGGAGGTTCTGTTGA	13	121
		Reverse	GCCATTTCTGGACTTCGCATA	14
8	Heterosigma akashiwo	Forward	GGTAGAAGCAGGAGCAGGAA	15	219
		Reverse	ATAAACACAGCCCACACAAACA	16
9	Conticribra weissflogii	Forward	ATCAAGTGCAACAGCTCATTCT	17	233
		Reverse	ACAACATTGTGATCGCTCCAG	18
10	Chaetoceros diadema	Forward	TGGTGCTGTGTCTGGTGTT	19	315
		Reverse	CCTGTTCCTACTCCTGCTTCT	20
11	Stephanopyxis turris	Forward	CTTACCTTAGAATCGCCTGGAA	21	265
		Reverse	CTGTACCAACTCCTGCTTCTG	22
12	Prorocentrum minimum	Forward	GTCCTGGTATATCCGCCTTGA	23	250
		Reverse	CGACATCAGCAACAGCACAA	24
13	Akashiwo sanguinea	Forward	CTGACATGGCTTTCCTCGTTTA	25	105
		Reverse	CCAGTACCAGCTCCTCCTTC	26
14	Chaetoceros debilis	Forward	AGGACATGCGTTCGTTATGATT	27	192
		Reverse	CCCACACCTGCTTCTGCTA	28

본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 28 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하도록 다수의 프로브를 제작할 수 있고, 이러한 프로브 중 적어도 하나 이상을 상기에서 얻은 PCR 산물과 결합시킴으로서, 그 결합 여부에 따라 미세조류의 종을 판별할 수 있는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 미세조류는 스켈러토네마 마리노이(Skeletonema marinoi), 니츠치아 임프로비사(Nitzschia improvisa), 케토세로스 브레비스(Chaetoceros brevis), 디틸럼 브라이트웰리(Ditylum brightwellii), 아스테리오넬롭시스 글레이시알리스(Asterionellopsis glacialis), 케토세로스 프로튜발란스(Chaetoceros protubalans), 나비큘러 그레가리아(Navicula gregaria), 헤테로시그마 아카쉬요(Heterosigma akashiwo), 컨티크리브라 웨이스플로기(Conticribra weissflogii), 케토세로스 디아데마(Chaetoceros diadema), 스테마노파이시스 투리스(Stephanopyxis turris), 프로로센트럼 미니멈(Prorocentrum minimum), 아카쉬요 산구이니아(Akashiwo sanguinea), 케토세로스 데빌리스(Chaetoceros debilis) 로 이루어진 군에서 적어도 하나 이상이 선택된 것일 수 있다.

그래서, 상기 결합 여부에 따라 미세조류가 속하는 종을 판별하는 것은, 상기 결합되는 서열번호를 근거로 하여, 서열번호 1 내지 서열번호 2 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 스켈러토네마 마리노이(Skeletonema marinoi) 종, 서열번호 3 내지 서열번호 4 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 니츠치아 임프로비사(Nitzschia improvisa) 종, 서열번호 5 내지 서열번호 6 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 케토세로스 브레비스(Chaetoceros brevis) 종, 서열번호 7 내지 서열번호 8 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 디틸럼 브라이트웰리(Ditylum brightwellii) 종, 서열번호 9 내지 서열번호 10 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 아스테리오넬롭시스 글레이시알리스(Asterionellopsis glacialis) 종, 서열번호 11 내지 서열번호 12 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 케토세로스 프로튜발란스(Chaetoceros protubalans) 종, 서열번호 13 내지 서열번호 14 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 나비큘러 그레가리아(Navicula gregaria) 종, 서열번호 15 내지 서열번호 16 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 헤테로시그마 아카쉬요(Heterosigma akashiwo) 종, 서열번호 17 내지 서열번호 18 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 컨티크리브라 웨이스플로기(Conticribra weissflogii) 종, 서열번호 19 내지 서열번호 20 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 케토세로스 디아데마(Chaetoceros diadema) 종, 서열번호 21 내지 서열번호 22 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 스테마노파이시스 투리스(Stephanopyxis turris) 종, 서열번호 23 내지 서열번호 24 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 프로로센트럼 미니멈(Prorocentrum minimum) 종, 서열번호 25 내지 서열번호 26 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 아카쉬요 산구이니아(Akashiwo sanguinea) 종, 서열번호 27 내지 서열번호 28 중 하나 이상의 프로브와 결합하면 케토세로스 데빌리스(Chaetoceros debilis) 종인 것으로 판별할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 프로브는 미세조류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위에 존재하는 서열번호 1 내지 28의 각 DNA 서열과 결합하고, 상기 결합은 상기 미세조류의 종에 따라 다르게 이루어지는 것이 바람직하다.

예를 들어, 상기 결합이 상기 미세조류의 종에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프로브는 스켈러토네마 마리노이(Skeletonema marinoi) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 61~79번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 2의 프로브는 스켈러토네마 마리노이 종의 143~164번째 DNA 서열, 서열번호 3의 경우는 니츠치아 임프로비사(Nitzschia improvisa) 종의 94~115번째 DNA 서열, 서열번호 4의 경우는 니츠치아 임프로비사 종의 251-272번째 DNA 서열, 서열번호 5의 경우는 케토세로스 브레비스(Chaetoceros brevis) 종의 94~115번째 DNA 서열, 서열번호 6의 경우는 케토세로스 브레비스 종의 345~366번째 DNA 서열, 서열번호 7의 경우는 디틸럼 브라이트웰리(Ditylum brightwellii) 종의 46~67번째 DNA 서열, 서열번호 8의 경우는 디틸럼 브라이트웰리 종의 386-405번째 DNA 서열, 서열번호 9의 경우는 아스테리오넬롭시스 글레이시알리스(Asterionellopsis glacialis) 종의 318~339번째 DNA 서열, 서열번호 10의 경우는 아스테리오넬롭시스 글레이시알리스 종의 586~607번째 DNA 서열, 서열번호 11의 경우는 케토세로스 프로튜발란스(Chaetoceros protubalans) 종의 245~263번째 DNA 서열, 서열번호 12의 경우는 케토세로스 프로튜발란스 종의 334~355번째 DNA 서열, 서열번호 13의 경우는 나비큘러 그레가리아(Navicula gregaria) 종의 391~413번째 DNA 서열, 서열번호 14의 경우는 나비큘러 그레가리아 종의 492~512번째 DNA 서열, 서열번호 15의 경우는 헤테로시그마 아카쉬요(Heterosigma akashiwo) 종의 333~352번째 DNA 서열, 서열번호 16의 경우는 헤테로시그마 아카쉬요 종의 530~551번째 DNA 서열, 서열번호 17의 경우는 컨티크리브라 웨이스플로기(Conticribra weissflogii) 종의 378~399번째 DNA 서열, 서열번호 18의 경우는 컨티크리브라 웨이스플로기 종의 590~610번째 DNA 서열, 서열번호 19의 경우는 케토세로스 디아데마(Chaetoceros diadema) 종의 41~60번째 DNA 서열, 서열번호 20의 경우는 케토세로스 디아데마 종의 336~356번째 DNA 서열, 서열번호 21의 경우는 스테마노파이시스 투리스(Stephanopyxis turris) 종의 91~112번째 DNA 서열, 서열번호 22의 경우는 스테마노파이시스 투리스 종의 335~355번째 DNA 서열, 서열번호 23의 경우는 프로로센트럼 미니멈(Prorocentrum minimum) 종의 75~95번째 DNA 서열, 서열번호 24의 경우는 프로로센트럼 미니멈 종의 308~327번째 DNA 서열, 서열번호 25의 경우는 아카쉬요 산구이니아(Akashiwo sanguinea) 종의 251~273번째 DNA 서열, 서열번호 26의 경우는 아카쉬요 산구이니아 종의 337~356번째 DNA 서열, 서열번호 27의 경우는 케토세로스 데빌리스(Chaetoceros debilis) 종의 159~180번째 DNA 서열, 서열번호 28의 경우는 케토세로스 데빌리스 종의 332~350번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

나아가, 상술한 본 발명에서, 상기 PCR 산물을 프로브에 결합시키는 단계는 적어도 2회 이상 수행되는 것이 바람직한데, 이와 같이 상기 결합을 확인하는 단계 이전에, 추출된 DNA와 본 발명에 따른 프로브의 결합 과정을 반복적으로 수행한다면, 상기 결합을 더욱 확실히 하여 프로브와 대상 DNA 산물의 결합을 더욱 견고히 할 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명의 다른 실시형태는, 상술한 미세조류의 종 판별 방법에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 것은, 서열번호 29 및/또는 서열번호 30의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드를 정방향 프라이머 및/또는 역방향 프라이머로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 14종의 미세조류에서 DNA 시료를 채취하고, 이를 증폭시켜서 PCR 산물을 증폭시키는데 있어서, 상기 미세조류의 종에 적합한 특별한 염기서열을 상기 증폭을 위한 프라이머로 사용하는 것이다. 이러한 특정한 프라이머는 미세조류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자의, 종 간에 구별되는 DNA 서열에 부합하는 것으로써, 상기 추출한 DNA를 더욱 우수하게 증폭시킬 수 있다.

예를 들어, 상기 미세조류에 속하는 종에 대해서는, 하기 표 2에 기재된 서열번호 29과 서열번호 30의 염기서열을 포함하는 프라이머를 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이용하는 것이 바람직하다.

[미세조류의 판별을 위한 프라이머 서열]

프 라 이 머	염 기 서 열
전위 프라이머(서열번호29)	5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
역위 프라이머 (서열번호30)	5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

상기한 바와 같이, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 28 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브를 이용하는 것이 특징이고, 이에 따라 본 발명의 다른 실시형태는 상기한 프로브, 이러한 프로브를 포함하는 DNA 칩 및 키트일 수 있다. 상기 DNA 칩 및 키트에는 프로브와의 결합 및 검출의 정확성을 높이기 위하여, 특정한 염기서열로 표시되는 별도의 위치마커(position marker)가 추가로 고정되어 있는 것도 가능하다.

이러한 본 발명은 DNA 마이크로어레이 기술에 따라 하나의 슬라이드 위에서 다수 미세조류의 종을 동시에 판별할 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 칩 및 키트는 상기한 프로브를 포함하여, 종 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로서, 염기서열을 분석하기 않고도 분석하고자 하는 미세조류의 유전자형과 그 종을 신속히 판정할 수 있는 효용성을 가지고 있다. 또한 상기 미세조류에 속하는 종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 상기 미세조류의 유전자형과 종을 판별하는 방법을 표준화 및 자동화하는 것도 가능하다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 미세조류의 채집

14종의 미세조류 시료는 우리나라 남해 통영해역(N 34°46.185', E 128°22.988')에서 분리하였다(도 13 참조). 직경 20 um pore size를 가진 네트를 이용하였으며, 5 m 깊이에서 채집하였다. 광학현미경 하에서 micropipette을 사용하여 각 미세조류를 분리하였으며, 주사전자현미경(electron microscope, SEM)을 이용하여 형태학적으로 동정하였다. 분리된 미세조류는 F2 배지에서 20℃, 12/12 light/darkness 조건하에서 배양하였다. 분리된 미세조류는 DNA를 추출할 수 있을 만큼 충분히 계대배양하였다.

분리된 미세조류는 종 14종이었으며, 아래와 같다

Skeletonema marinoi, Nitzschia improvisa, Chaetoceros brevis, Ditylum brightwellii, Asterionellopsis glacialis, Chaetoceros protubalans, Navicula gregaria, Heterosigma akashiwo, Conticribra weissflogii, Chaetoceros diadema, Stephanopyxis turris, Prorocentrum minimum, Akashiwo sanguinea, Chaetoceros debilis.

실시예 2: 미세조류로부터 DNA 추출, COI 유전자 클로닝 및 염기서열 분석

모든 미세조류 시료의 DNA는 i-genomic plant DNA extraction kit (iNtRON biotechnology, Korea)를 사용하여 추출되었다. 추출된 gDNA로부터 COI 유전자를 클로닝하기 위하여 표 2의 COI primer set를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다.

COI 프라이머의 증폭 조건은 아래 표 3에 나타난 바와 같다.

반응조성		반응 조건
멸균증류수 10X PCR buffer 2.5 mM dNTP 10 uM forward 10 uM reverse 1 unit Hot start Taq 정제 DNA	9.5 ul 2 ul 2 ul 1 ul 1 ul 0.5 ul 4 ul	94℃, 5분	1 cycle
		94℃, 30초 49℃, 30초 72℃, 1분	40 cycle
		72, 7분	1 cycle

이렇게 얻어진 PCR 산물은 EtBr이 함유된 아가로스젤에 전기영동하고, UV transillunimator가 부착된 Image analyzer를 이용하여 확인하였다. 도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 미세조류로부터 추출된 DNA의 증폭 산물의 크기를 나타내는 사진이다. 여기에 나타난 바와 같이, 예시적으로 1번 라인에 나타난 스켈러토네마 마리노이(Skeletonema marinoi) 종의 증폭된 PCR 산물 길이는 약 710 bp 크기였다.

그리고, 상기 PCR 산물을 Zymoclean^TM gel DNA Recovery Kit (ZYMORESEARCH, USA)을 이용하여 정제하였고, pGEMT-easy vector로 클로닝한 후 Bioneer Inc. (Korea)에서 염기서열을 분석하였으며, 그 결과는 아래 표 4에 나타난 바와 같다.

No.	Species	Sequence
1	Skeletonema marinoi	TCAACAAATCATAAAGATATTGGAACTTTATATTTGATTTTTGGAGCAATATCAGGTGTTGCTGGAACCGCATTGTCTTTATATATCCGAATCACTCTAGCCCAGCCAAACAGCAGTTTTTTAGAATATAATCACCATTTATACAATGTTATCGTCACAGGACATGCCATACTTATGATTTTTTTCATGGTAATGCCAACATTAATTGGAGGATTTGGTAATTGATTTGTCCCTTTAATGATTGGTGCGCCAGATATGGCTTTCCCACGAATGAATAATATCAGTTTTTGATTATTGCCTCCTTCACTACTGTTATTATTTGCATCTATGTTAACCGAAGCGGGTGTAGGTACTGGATGAACCATTTACCCACCTTTATCAAGTGCAACAGCCCATTCTGGGGGTTCTGTAGATTTAGCAATATTCAGTTTACATTTATCAGGTGCGTCTTCTATTTTAGGTGCTATTAACTTCATTTGTACTATCTTTAATATGCGAGTAAAAAGTTTATCTTTTCATAATCTTCCTTTATTTGTATGGTCTGTTTTAATAACAGCATTTTTGTTATTATTATCTCTGCCTGTTTTAGCTGGAGCTATTACAATGTTATTAACCGATAGAAATTTTAACACTACCTTCTTCGACCCTGCTGGTGGAGGCGACCCTGCTTTGTTTCAGCATCTTTTCTGATTTTTTGG
2	Nitzschia improvisa	TCAACAAATCATAAAGATATTGGAATTTTATATTTATGATTTGGAGCATTATCTGGAGTTTTAGGTACTGCATTTTCTATGATTATTCGTTGAGAATTAGCAGGTCCAGGTAACCAATTCTTAAATGGTAATCACCAATTTTATAACGTAGCAGTTACTGCTCACGCTATTTTAATGATTTTTTTCATGGTGATGCCTATTTTAATTGGAGGTTTTGGTAATTTTTTTTTACCTATTTTAATCGGGGCTCCTGATATGGCTTTCCCTCGTTTAAATAACATTAGTTTTTGATTATTACCTCCTTCATTATTATTATTATTATCTTCAGCTTTAATTGAAGATGGTGTAGGTACAGGATGAACTGTATATCCTCCTTTAAGTGGATTTAAAGCACACTCAGGTCCTTCAGTAGATTTAGCTATTTTTAGTTTACACTTATCAGGTGCTGCTTCTATTTTAGGTTCTATTAATTTTATGGTAACCGTAATTAATATGAGAGCTCCAGGTATGTTTATGCACAAACTACCTTTATTTGTTTGAGCTGTATTCTTAACAGTTATTTTATTATTATTATCATTACCAGTATTAGCTGGAGGTATTACTATGTTATTAACTGATCGTAATTTTAATACTACCTTTTTTGATCCAGCAGGTGGTGGAGATCCAATTTTATTCCAACACTTATTCTGATTTTTTGG
3	Chaetoceros brevis	TCAACAAATCATAAAGATATTGGTACCTTATATTTAATTTTTGGTGCTATTTCAGGGGTAGCTGGTACCGCACTATCTTTGTACATTCGTATAAACTTAGCACAACCGAACAGTACCTTTTTAGAGCACAACCATCAAATGTATAATGTTATTGTGACAGGACATGCTTTTGTTATGATTTTTTTTATGGTAATGCCTACATTAATCGGCGGTTTCGGTAATTGGTTTGTTCCTTTAATGATAGGTGCACCTGATATGGCGTTTCCAAGAATGAACAATATCAGTTTTTGGTTATTACCACCTTCTTTATTACTTTTAGTAGCATCTATTTTATCAGAATCTGGTGTAGGTACTGGTTGGACTGTATATCCACCATTATCAAGTGGTACTTCGCATTCAGGAGGTGCTGTTGATTTAGCTATTTTCAGTTTACACCTTTCAGGAGCATCTTCTATTTTAGGTGCTATCAATTTTATTTGTACAATTTTTAATATGAGAGTAAAAAGTTTAGCTTTCCACAAATTACCTTTATTTGTATGGGCTGTTTTAATCACAGCATTTTTATTATTGTTATCTTTACCTGTTTTAGCAGGAGCAATTACTATGCTGTTAACTGATAGAAACTTCAACACAACCTTTTTTGACCCAGCAGGTGGTGGTGATCCTGTATTATACCAGCACCTGTTTTGATTTTTTGG
4	Ditylum brightwellii	TCAACAAATCATAAAGATATTGGTACTTTATATTTAATCTTTGGTGCTATATCTGGTGTTGCTGGTACAGCTCTATCATTATATATTAGATTAACTTTATATCAACCAAATAGTGGTTTTTTAGAAAATAACCATCATTTATATAATGTTATTGTTACTGGTCATGCTTTTGTTATGATTTTTTTTATGGTAATGCCCACTTTAATTGGTGGTTTTGGTAACTGGTTTGTTCCTTTAATGATAGGAGCTCCTGATATGGCATTTCCTAGAATGAATAATATAAGTTTTTGGTTATTACCTCCTTCTTTATTACTTTTATTTGCTTCTATTTTAGCTGAATCAGGGGCAGGTACTGGTTGGACTGTTTACCCACCATTATCAAGTGCTACAGCACACTCAGGAGGTGCTGTAGATTTAGCTATTTTCAGTTTACATCTTTCTGGTGCTTCTTCTATTTTAGGTGCTATTAATTTTATTTGTACTATTTTTAATATGCGTGTAAAAAGTTTATCTTTTCATAATTTACCTCTATTTGTATGGTCAGTTTTAATAACAGCATTTTTATTATTATTATCATTACCAGTATTAGCTGGTGCAATAACTATGCTTTTAACTGATAGAAATTTTAATACTACTTTTTTTGATCCTGCGGGTGGTGGTGACCCTGTTTTATATCAACATTTATTTTGATTTTTTGG
5	Asterionellopsis glacialis	TCAACAAATCATAAAGATATTGGAACTTTATATTTAATATTTGGAGCAATTTCTGGGGTAGCAGGCACTGCTTTATCACTATACATTCGTTTAACGTTGGCACATCCAAACGGCGATTTTTTAGCATATAATCATCACTTATATAACGTTATAGTTACAGGACACGCATTTGTAATGATTTTTTTCATGGTAATGCCAACACTAATAGGTGGTTTTGGTAACTGGTTCGTACCATTGATGATTGGAGCACCTGATATGTGTTTCCCACGTATGAACAATATTAGTTTTTGGTTATTACCACCATCTTTATTCTTGTTAATCGCTTCGGTTCTAACTGAAGCAGGTGCCGGTACCGGTTGGACTGTTTACCCACCTTTATCAAGTATTACAGCACACTCAGGTGGTTCTGTTGATTTAGCAATTTTTAGTTTACATTTATCTGGTGCTTCATCAATACTAGGTGCTATCAATTTTATTTGTACAATTTTCAATATGCGTGTAAAAAGTTTATCTTTTCATAAACTACCATTATTTGTTTGGTCAGTTTTAATTACCGCGTTTTTATTACTATTATCGTTACCAGTTTTAGCAGGAGCAATCACAATGTTATTAACAGATAGAAACTTTAATACAACTTTTTTTGACCCAGCAGGTGGAGGCGATCCTGTCTTATACCAGCATTTATTCTGATTTTTTGG
6	Chaetoceros protuberans	TCAACAAATCATAAAGATATTGGGATTTTATACTTAATTTTTGGAGCTTTTGCTGCAGTTATTGCAGTAGCACTTTCTTTATTAATCCGTATGGAATTAGCAGCACCTGGAGATCAAATTTTCCAAGGAAATTATCAATTATATAATGTAGCTATTACAGCACATGGATTAATTATGCTTTTTTTTGTAGTTTTTCCTATTTTAGGAGGAGGTTTTGGTAATTATTTTGTACCTTTAATGTTAGGGGCTCCTGACATGGCTTTTCCTCGTTCAAATAATATTAGTTTTTGACTTTTTCCTCCTGCTATTGCTTTTTTATTATTATCTTCATTAGTAGAGTCTGGAGCAGGTACTGGATGAACTGTATATCCTCCTTTATCTTCTATTCAAGGACATTCTGGACCTTCTGTAGATTTAGCAATTTTTAGTTTACATGTTTCTGGAGCTTCTTCTGTTATTGGATCTATTAACTTTATTGTTACTATTTTTAATATGAGAGCACCTGGAATGTTTATGCATAAAATTCCTTTATTTGCATGAGCTGTATTAATTACTGCATTTTTACTTGTAATTTCTTTACCTGTAGTTGCAGGAGCTATTACAATGCTTTTAACTGATCGTAATTTTAATACTACTTTCTTTGATCCAGCTGGAGGAGGAGATCCTATTTTATATCAACATTTATTTTGATTTTTTGG
7	Navicula gregaria	TCAACAAATCATAAAGATATTGGTACTTTATATCTAATTTTTGCAGCATTTGCTGGTATCATAGGTACTTTTTTTTCTGTTATTATAAGAATGGAATTATCTTTACCAGGAGATCAAATTTTAGGAAATAATTATCAATTATATAATGTTATTATAACAGCTCATGCTTTTATTATGATTTTTTTTATGGTAATGCCTGCACTTATTGGTGGTTTAGGTAATTGGTTTGTGCCTTTAATGATAGGTGCTCCAGATATGGCCTTTCCTAGGTTAAATAATATAAGTTTTTGGTTATTACCTCCTTCTTTTTTTTTATTATTATCTTCTTCTTTAGTGGAAGTAGGGGCAGGTACTGGATGGACTGTTTATCCACCTTTAGCAGGTATACAAAGTCATTCAGGAGGTTCTGTTGATTTAGCTATTTTTAGTTTACATTTAGCAGGAGTATCTTCTCTTTTAGGTGCTATTAATTTTATTACAACTGTAATAAATATGCGAAGTCCAGAAATGGCTTGGCATAAATTATCTTTATTTGTTTGGTCTGTTTTTATTACAGCTTTTTTATTATTATTATCTTTACCTGTTTTAGCAGGTGCAATAACTATGTTGTTAACAGATAGAAATTTTAATACTACTTTTTTTGATCCAGCAGGTGGTGGAGATCCTATTTTATATCAACATTTATTTTGATTTTTTGG
8	Heterosigma akashiwo	TCAACAAATCATAAAGATATTGGAACACTTTATTTAATTTTTGGTGGTATTGCCGGAGTTATGGGAACCACTATGTCAATTTTAATTCGAATGGAATTAGCTTATCCTGGAAGTCAAATTTTAGCAGGTAACCATCAACTTTATAACGTTCTAGTGACTGGGCACGCTTTTGTGATGATCTTCTTCATGGTAATGCCAGTTTTAATTGGTGGTTTTGGAAATTGGTTTGTTCCTTTAATGATTGGAGCACCAGACATGGCTTTCCCTCGAATGAACAATATTAGTTTTTGGTTATTACCGCCATCGTTATTATTGTTATTAGCGTCTACTCTGGTAGAAGCAGGAGCAGGAACCGGTTGGACTGTGTACCCACCGTTAAGTAGCGCTCAAGCTCACTCAGGACCGTCGGTAGATTTAGCTATTTTCAGTTTACACGTTTCAGGAGCAGCATCAATTTTAGGGGCAATTAATTTTATTACCACTATTTTAAACATGCGAGCACCTGGTATGACCATGCATCGACTACCGTTGTTTGTGTGGGCTGTGTTTATTACTGCAATTTTATTATTATTATCGTTACCAGTATTAGCAGGAGCAATTACTATGTTATTAACTGATCGAAATTTCAACACTACCTTTTACGATCCGGCAGGAGGAGGAGACCCAGTATTGTATCAACATTTATTTTGATTTTTTGG
9	Conticribra weissflogii	TCAACAAATCATAAAGATATTGGAACTTTATATTTAATATTTGGAGCAATATCAGGGGTTGCAGGTACTGCATTGTCTTTATATATTCGAATAACTTTAGCTCAACCAAATGGTAGTTTTTTAGAATATAATCATCATTTATACAATGTTATTGTAACTGGACACGCAATTTTAATGATTTTTTTCATGGTAATGCCTACCTTAATTGGAGGATTTGGTAATTGGTTTGTACCTTTAATGATTGGTGCACCTGACATGGCTTTTCCAAGAATGAATAATATTAGTTTTTGGTTATTACCACCTTCGTTACTATTATTATTTGCATCAATGTTAACTGAAGCAGGTGTTGGAACCGGTTGGACAGTATACCCACCCTTATCAAGTGCAACAGCTCATTCTGGTGGATCTGTAGATTTAGCTATCTTTAGTTTGCACGTGTCTGGAACTTCTTCTATTCTAGGGGCAATCAACTTTATCTGTACTATTTTTAATATGCGTGTAAAAAGTCTATCTTTCCATAATCTTCCTTTATTTGTATGGTCTGTACTAATTACAGCGTTTTTATTATTATTATCGTTACCTGTACTAGCTGGAGCGATCACAATGTTGTTAACTGATAGAAATTTTAATACTACGTTTTTTGATCCTGCTGGAGGAGGTGATCCTGTACTATTTCAACATCTTTTCTGATTTTTTGG
10	Chaetoceros diadema	TCAACAAATCATAAAGATATTGGAACTTTATATCTTATTTTTGGTGCTGTGTCTGGTGTTGCTGGAACAGCGTTATCATTATATATTCGTATAACATTATCTCAACCAGATGGTATGTTTTTAGAGCACAATTCACATTTATACAACGTAATTGTTACAGGTCATGCATTTGTAATGATTTTTTTCATGGTAATGCCTACTTTAATAGGAGGTTTTGGTAATTGGTTTGTTCCATTAATGATTGGAGCTCCTGATATGGCATTTCCACGAATGAATAATATTAGTTTTTGGTTATTACCTCCTTCATTATTATTATTAATTGCATCTATTTTTTCAGAAGCAGGAGTAGGAACAGGTTGGACTGTGTACCCACCTTTATCAAGTGGTACTGCACATTCAGGTGGAGCTGTTGATTTAGCAATTTTTAGTTTGCATTTATCAGGTGCTTCGTCAATTTTAGGAGCAATCAATTTTATTTGTACAATTTTTAATATGAGAGTTAAAAGTTTATCATTTCATAAATTACCTTTATTTGTTTGGTCTGTTTTAATAACAGCATTTTTACTTTTGTTATCTTTACCTGTTTTAGCTGGCGCTATTACTATGCTATTAACAGATAGAAATTTTAACACAACTTTTTTTGATCCAGCAGGTGGAGGTGATCCAGTTTTATACCAGCATTTATTTTGATTTTTTGG
11	Stephanopyxis turris	TCAACAAATCATAAAGATATTGGTACATTATATTTAATTTTTGGGGCGTTTTCTGGTATTGCCGGTACCACACTTTCATTATTTATACGCCTTACCTTAGAATCGCCTGGAAATGATATATTAAGTAACAATCATCAATTATATAATGTTATAGTAACAGGTCATGCTTTCATTATGATTTTTTTTATGGTAATGCCTACGTTAATCGGTGGATTTGGTAATTGGTTTGTACCTATAATGATTGGAGCTCCAGATATGGCTTTTCCTAGAATGAATAATATAAGTTTTTGGTTACTACCTCCGTCTTTATTGTTATTAGTTTCATCTGTATTATCAGAAGCAGGAGTTGGTACAGGTTGGACTGTATACCCTCCGTTGTCTAGTGGTAATTCTCATTCAGGCCCTGCTGTAGATTTAGCTATATTTAGTTTACACTTATCAGGAGCTTCTTCTATTTTAGGAGCAATTAATTTTATTTGTACCATTTTAAATATGAGAACTAAAGGGTTATTTATGCATAAATTACCTTTATTTGCCTGGTCAGTTTTAATAACAGCAGTTCTATTACTATTATCACTACCGGTATTGGCAGGAGCAATTACTATGTTAATTACTGACAGAAATTTTAATACAACCTTTTTTGATCCAGCAGGAGGAGGAGATCCTGTATTATATCAACATTTATTTTGATTTTTTGG
12	Prorocentrum minimum	TCAACAAATCATAAAGATATTGGGACGGTTTACCTGTTCGTCGCCATGTTCGCCGCCCTGATCGGCGGTGGCATGTCCTGGTATATCCGCCTTGAACTGGCAGAGCCGGGCATCCAGTACATTGACGATTTCCAGTGGTACAATGTGCTGCTGACTGCACACGGTTTCATCATGGTGTTCTTTGTTGTGATGCCTGCGATGATCGGTGGTTTCGGTAACTGGTTTGTGCCGCTGATGGTCGGCGCGCCGGACATGGCGTTCCCGCGCATGAACAACATCAGCCTCTGGCTTTTGATCGTTGCACTTGTGCTGTTGCTGATGTCGGCATTTGTCGGGTCTGGTGTCGGCACCGGTTGGACCGCGTATCCGCCGTTATCGAGCGGGATATATCATCCGGATGCCGCGGTCGACTTCGGGATATTATCGCTCCACCTTGCTGGTGCGTCGTCCATTCTGGGGGCGATCAACTTCATCGTGACAATCTTCAACATGCGTGCGCCAGGCATGACCCTGCACAAGATGCCACTGTTTGTCTGGTCGATCCTGGTAACGGCATTCCTGCTGTTGCTGGCATTGCCTGTTCTGGCTGGTGCCTTGACCATGCTGCTGACGGACCGGAACTTCGGTACGACATTCTTTGATCCGGCTGGTGGTGGCGACCCCATCCTGTGGCAGCATCTGTTCTGATTTTTTGG
13	Akashiwo sanguinea	TCAACAAATCATAAAGATATTGGAATGTTATATTTTATTTTTGCTGCTTTTGCTGGAATTATTGGAACTATGTTTTCCGTTTAATTCGTATAGAATTAAGTTTACCCGGAAATCAAATTTTAGAAGGAAATCATCAATTATATAACGTATTATTACTGCTCATGCTATTATTATGATTTTTTTTATGGTAATGCCAGCTATGATCGGAGTTTTGGTAATATTTTTGTTCCATTAATGATTGGAGCACCTGACATGGCTTTCCTCGTTTAAATAATATTAGTTTTTGGTTATTACCACCATCTTTTATTTTATTATTACTTTCGTCTTTTGTTGAAGGAGGAGCTGGTACTGGTTGGACTATTTATCCTCCATTATCTAGTATCCAGCTCATTCGGGAGGAGCTGTTGATTTAGCTATTTTTAGTTTACATTTGGCTGGAGTTTCATCATTATTAGGAGCAATCAATTTTATACTACAATTATTAATATGAGAACACCTCATATGACATGGAGTAGATTACCTTTATTTGTTTGGTCTATTTTATTACAGCATTTTTATTATTATTATCATTACCTGTTTTAGCTGGAGGAATAACAATGTTATTAACTGATCGTAATTTTAATACCACTTTTTTGATCCATTAGGTGGAGGAGATCCTATTTTATTTCAACACCTTTTTGATTTTTTGG
14	Chaetoceros debilis	TCAACAAATCATAAAGATATTGGTACTTTGTACCTTATTTTTGGTGCAATATCAGGTGTGGCCGGTACTGCGTTATCTTTATATATTAGAATTACTTTAGCACAGCCTAATAGTAGTTTTTTAGAGCATAATCACCAGATGTATAATGTTATTGTAACAGGACATGCGTTCGTTATGATTTTCTTCATGGTTATGCCAACTTTAATTGGTGGTTTTGGTAACTGGTTTGTTCCTTTAATGATTGGTGCACCAGATATGGCATTTCCACGAATGAACAATATTAGTTTTTGGTTATTACCACCTTCATTATTGTTATTAATTGCTTCTATTTTAGCAGAAGCAGGTGTGGGTACAGGTTGGACCGTATACCCTCCATTATCTAGTGGATCATCACATTCAGGTGGTGCTGTGGACTTAGCTATTTTTAGTTTACACTTATCTGGAGCTTCGTCAATTTTAGGAGCAATAAACTTTATTTGTACTATTTTCAATATGCGAGTAAAAAGTTTATCATTCCATAAATTACCTTTATTTGTTTGGGCTGTATTAATTACCGCGTTTCTATTATTGTTATCTTTACCTGTTTTAGCGGGTGCTATTACAATGTTATTAACAGACCGTAATTTTAATACAACTTTCTTTGACCCAGCGGGTGGTGGTGACCCTATTTTATACCAACATTTATTTTGATTTTTTGG

이를 바탕으로, 종특이적 프라이머 디자인을 하기 위하여, 14종의 미세조류 COI 유전자의 염기서열을 순서대로 배열하였고(도 15), AllelD 7 프로그램을 이용하여 종특이적 프라이머 서열을 도출하였다.

각 종의 염기서열로부터 각각 5개 이상의 프라이머세트를 얻었고, 이중에서도 가장 우수한 효과를 가지는 종 특이적인 프라이머세트를 얻기 위하여 실험실에서 PC 시험을 실시하였다. 3세트의 시험이 디자인되었고, 여기에는 각각 (P)대조구, (N)대조구 및 처리구(T)가 포함되도록 하였다((P)대조구: 각 미세조류 자신의 프라이머가 포함된 시험구, (N)대조구: 시험대상 미세조류 유전자만 빠지고 나머지 13종의 유전자가 모두 들어 있는 시험구, 처리구(T): 14종 미세조류의 유전자가 모두 들어 있는 시험구).

따라서 PCR 밴드는 (P)대조구와 처리구(T)에서 나타나고, (N)대조구에서는 밴드가 나타나지 않아야 한다. 14종에 대하여 하기 표 5에 나타난 PCR 조건으로 3세트를 시험한 결과(도 16), 14종의 미세조류를 특이적으로 구분할 수 있는 프라이머 세트를 얻었다(표 1). 즉, 도 16에 나타난 바와 같이, 상기 표 1에 나타난 바와 같은 본 발명에 따른 종 특이적 프라이머에 의한 경우, 14종의 미세조류 모두를 종 특이적으로 구분할 수 있었다. 이에 따르면, 본 발명은 1가지의 PCR 조건에서 14종의 미세조류를 한번으로 PCR 로 종 판별 할 수 있는 효과가 있다.

반응조성		반응 조건
멸균증류수 10X PCR buffer 2.5 mM dNTP 10 uM forward 10 uM reverse 1.5 unit exTaq Positive template (15 ng/) or negative (1.5 ng/) or total mixed template (1.5 ng/)	11.5 ul 2 ul 2 ul 1 ul 1 ul 0.5 ul 2 ul 2 ul 2 ul	94, 5분	1 cycle
		94, 30초 61, 30초 72, 1분	40 cycle
		72, 5분	1 cycle

실시예 3: 종특이적 프라이머를 사용한 현장시료 종 판별

상기 실시예 2를 통하여, 실험실 수준에서 확인된 종특이적 프라이머가 현장에서 적용가능한지 확인하기 위하여 통영 연안에서 10개월간 해수를 채취한 후 PCR을 실시하였다.

그 결과는 도 17 및 표 6에 나타난 바와 같다. 도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 종 특이적 프라이머 세트를 이용하여, 통영해역에서 수집한 시료 속에 포함된 미세조류의 종을 판별한 사진이다(a, 1월; b, 2월; c, 3월; d, 4월; e, 5월; f, 6월; g, 7월; h, 8월; i, 9월; j, 10월)

No.	Species	Jan	Feb	Mar	Apr	May	Jun	Jul	Aug	Sep	Oct
1	Skeletonema marinoi	*		*	*
2	Nitzschia improvisa	*		*	*	*
3	Chaetoceros brevis	*	*	*	*	*	*	*		*	*
4	Ditylum brightwellii	*		*	*
5	Asterionellopsis glacialis	*		*	*			*	*	*	*
6	Chaetoceros protuberans	*	*	*	*	*		*	*
7	Navicula gregaria
8	Heterosigma akashiwo	*			*	*		*
9	Conticribra weissflogii	*		*	*	*		*
10	Chaetoceros diadema	*		*	*	*
11	Stephanopyxis turris	*	*	*		*		*		*	*
12	Prorocentrum minimum								*
13	Akashiwo sanguinea	*	*	*	*	*	*	*
14	Chaetoceros debilis	*	*	*			*	*	*

구체적으로, 1월에는 S. marinoi, N. improvisa, C.brevis, D. brightwellii, A. glacialis, C. protuberans, H. akashiwo, Co. weissflogii, C. diadema, St. turris, Ak. Sanguinea, C. debilis 등 12종, 2월에는 C. brevis, C. protuberans, St. turris, Ak. sanguinea, C. debilis 등 5종, 3월에는 S. marinoi, N. improvisa, C. brevis, D. brightwellii, A. glacialis, C. protuberans, Co. weissflogii, C. diadema, St. turris, Ak. sanguinea, C. debilis 등 11종, 4월에는 S. marinoi, N. improvisa, C. brevis, D. brightwellii, A. glacialis, C. protuberans, H. akashiwo, Co. weissflogii, C. diadema, Ak. sanguinea 등 10종, 5월에는 N. improvisa, C. brevis, C. protuberans, H. akashiwo, Co. weissflogii, Co. diadema, St. turris, Ak. sanguinea 등 8종, 6월에는 C. brevis, Ak. sanguinea, C. debilis 등 3종, 7월에는 C. brevis, A. glacialis, C. protuberans, H. akashiwo, Co. weissflogii, St. turris, Ak. sanguinea, C debilis 등 8종, 8월에는 A. glacialis, C. protuberans, P. minimum, C. debilis 등 4종, 9월과 10월에는 C. brevis, A. glacialis, St. turris 등 3종이 존재하는 것으로 나타났다.

즉, 통영해역 해수시료에 대한 본 발명에 따른 종 특이적 프라이머의 적용 시험 결과, 1월 12종, 2월 5 종, 3월 11종, 4월 10종, 5월 8종, 6월 3종, 7월 8종, 8월 4종, 9월 3종 및 10월 3종이 검출된 것을 확인할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 의하는 경우 동일한 조건에서 이루어지는 1번의 PCR 수행에 의하여, 다수의 해양 생물 종에 대한 유전자형 분석을 간단하고 신속, 정확하게 판별할 수 있는 효과가 있다. 본 발명에 따라 해양 생물의 미토콘드리아 COI지역을 유전자 표지로 사용하면, 종래의 형태학적 구별법으로 해당 종을 판별하는 지금까지의 방법이 가졌던 낮은 분해능의 문제점을 해결 할 수 있다. 종래와 같이, 형태학적인 차이점을 기초로 판별하는 것 보다 본 발명에 따라 단염기다형성을 근거로한 DNA칩 방법을 이용하면, 종래기술보다 한 단계 진보된 형태의 유전자 분석법을 제공하여, 더욱 효과적으로 해양 생물종을 판별할 수 있고, 분해능도 현저히 증가시킬 수 있다.

그리고 본 발명에 따라 상기한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 마이크로어레이 방법을 활용하면, 종 특이적 단염기다형성을 DNA의 혼성화 가부에 따라 판별함으로써, 염기서열을 분석하지 않고도 각 생물종의 유전자형을 신속히 판정할 수 있는 적용성을 갖고 있다. 또한 다수의 생물종을 한 번의 실험으로 정확한 유전자형을 분석할 수 있어, 해당 생물종의 유전자형을 표준화, 자동화할 수 있도록 기술 개발의 적용성을 극대화시켰다. 즉, 본 발명은 종래의 방법에 비해 시료를 분석하는 데 걸리는 시간을 크게 단축시켰으며, 다량의 시료를 짧은 시간 내에 처리할 수 있는 효과가 있다.

상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

<110> Korea Institute of Ocean Science & Technology <120> Identifying Method of microalgae Nitzschia improvisa in Southern Sea of Korea, Polynucleotide Probe, DNA Chip and Kit for Identifying The Same <130> DS-14002 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Skeletonema marinoi <400> 1 gctggaaccg cattgtctt 19 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Skeletonema marinoi <400> 2 tgtcctgtga cgataacatt gt 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Nitzschia improvisa <400> 3 tgagaattag caggtccagg ta 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Nitzschia improvisa <400> 4 aaacgaggga aagccatatc ag 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Chaetoceros brevis <400> 5 aacttagcac aaccgaacag ta 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Chaetoceros brevis <400> 6 tacagtccaa ccagtaccta ca 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Ditylum brightwellii <400> 7 gctatatctg gtgttgctgg ta 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Ditylum brightwellii <400> 8 acctcctgag tgtgctgtag 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Asterionellopsis glacialis <400> 9 aatcgcttcg gttctaactg aa 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Asterionellopsis glacialis <400> 10 acattgtgat tgctcctgct aa 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Chaetoceros protuberans <400> 11 gggctcctga catggcttt 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Chaetoceros protuberans <400> 12 cagtacctgc tccagactct ac 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Navicula gregaria <400> 13 gtcattcagg aggttctgtt ga 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Navicula gregaria <400> 14 gccatttctg gacttcgcat a 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Heterosigma akashiwo <400> 15 ggtagaagca ggagcaggaa 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Heterosigma akashiwo <400> 16 ataaacacag cccacacaaa ca 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Conticribra weissflogii <400> 17 atcaagtgca acagctcatt ct 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Conticribra weissflogii <400> 18 acaacattgt gatcgctcca g 21 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Chaetoceros diadema <400> 19 tggtgctgtg tctggtgtt 19 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Chaetoceros diadema <400> 20 cctgttccta ctcctgcttc t 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Stephanopyxis turris <400> 21 cttaccttag aatcgcctgg aa 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Stephanopyxis turris <400> 22 ctgtaccaac tcctgcttct g 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Prorocentrum minimum <400> 23 gtcctggtat atccgccttg a 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Prorocentrum minimum <400> 24 cgacatcagc aacagcacaa 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Akashiwo sanguinea <400> 25 ctgacatggc tttcctcgtt ta 22 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Akashiwo sanguinea <400> 26 ccagtaccag ctcctccttc 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Chaetoceros debilis <400> 27 aggacatgcg ttcgttatga tt 22 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Chaetoceros debilis <400> 28 cccacacctg cttctgcta 19

Claims (12)

1. 미세조류(microalgae)에서 추출한 DNA에 대해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 PCR 산물을 얻는 단계;
   상기 PCR 산물을, 서열번호 3 내지 서열번호 4 중 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 프로브에 결합시키는 단계; 및,
   상기 결합 여부에 따라 상기 미세조류의 종(species)을 판별하는 단계;를 포함하는 미세조류의 종(species) 판별 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 미세조류는 대한민국 연안에 서식하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 종 판별 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 미세조류는 니츠치아 임프로비사(Nitzschia improvisa)인 것을 특징으로 하는 미세조류의 종 판별 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 상기 미세조류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위와 결합하고, 상기 결합은 상기 미세조류의 종에 따라 다르게 이루어지는 것을 특징으로 하는 미세조류의 종 판별 방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 결합이 상기 미세조류의 종에 따라 다르게 이루어진다는 것은, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브가 니츠치아 임프로비사(Nitzschia improvisa) 종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위의 94~115번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하고, 서열번호 4의 프로브는 니츠치아 임프로비사 종의 251-272번째 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 종 판별 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 PCR 산물을 프로브에 결합시키는 단계는 적어도 2회 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 미세조류의 종 판별 방법.
   
7. 삭제
8. 서열번호 3 내지 서열번호 4 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 미세조류의 종(species) 판별용 프로브.
   
9. 서열번호 3 내지 서열번호 4 중에서 선택된 적어도 하나 이상의 각 DNA 서열과 동일하거나 그에 상보적인(complementary) 염기서열을 각각 포함하는 적어도 하나 이상의 프로브를 포함하는 미세조류의 종(species) 판별용 DNA 칩.
   
10. 제9항에 있어서, 위치 마커(position marker)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 종(species) 판별용 DNA 칩.
    
11. 미세조류의 미토콘드리아 DNA 중 COI 유전자 부위 DNA 서열과 결합하는 것으로, 서열번호 3 내지 서열번호 4 중 어느 하나의 DNA 서열과 동일하거나 상보적인(complementary) 15-30개의 연속 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브와;
    상기 미세조류의 미토콘드리아 DNA를 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시키기 위한 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 종(species) 판별용 키트.
    
12. 삭제

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