CN108118099B - 基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括膜分类基因芯片检测试纸条，膜分类基因芯片检测试纸条包括：Cm探针、Ha探针、Km探针、Ac探针、Kv探针、Pl探针、At探针、Aa探针、PC探针和NC探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.10所示。该试剂盒能同时对海洋环境中的几种常见产毒微藻，包括海洋卡盾藻、赤潮异湾藻、米氏凯伦藻、强壮前沟藻、剧毒卡尔藻、利玛原甲藻、塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻进行高特异性、高灵敏度和快速检测，该检测不需要特殊的仪器，可满足野外现场检测的要求。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法。
背景技术
海洋自然环境中存在着大量产毒微藻，根据文献报道，全球4000多种浮游植物中有70多种能产生毒素。我国海域也存在着相当数量的产毒藻类，现有资料显示，分布在我国沿海的产毒微藻至少有30种，且产毒藻种的数量还在不断增加。特别是近二十年来，我国海域有害藻类水华频发，规模之大，危害严重。有害藻类已成为影响海洋生态环境、渔业经济及水产食品健康安全的重要因素。因此，亟待对产毒藻类进行实时监控以减少经济损失并防止公共卫生事件的发生。
目前对海洋环境中的产毒微藻的检测技术主要是形态法及分子生物学方法。根据形态学特征通过光镜对自然水样中的微藻进行定性和计数仍是海洋生态调查及环境监测的主要方法。形态法主要依靠藻类的形态学特征，借助光镜或电镜对藻种进行鉴定，然而，形态鉴定法存在以下缺点：第一、有害微藻一般个体微小，结构精细复杂，其鉴定常需借助电镜且必须要具备丰富的分类学知识和经验才能最终鉴定，造成检测成本及经验依赖度高；第二、很多海洋产毒微藻在实验室培养困难，且形态结构易随自然环境而发生显著变化，更增加了其鉴定难度；第三、海洋环境监控常需处理大量样品，更突显形态检测法耗时费力的局限性；第四、当目标藻细胞在被检样品中含量较低时，传统形态学方法易于造成漏检，而产毒微藻在极低浓度时却可能有较大危害。综上，由于传统的形态鉴定法专业性强、检测成本高、耗时、费力且不适合低浓度样品检测，探讨新的有害微藻的检测方法成为海洋环境监测的热点。
分子生物学技术的发展为有害藻类的鉴定提供了新思路。近年来，出现了大量有关有害微藻的分子检测方法，如荧光原位杂交、“三明治”杂交、核酸酶保护分析结合“三明治”杂交、电致化学发光分子探针技术、荧光定量PCR等，但这些方法都只能对自然样品中的单种有害藻进行检测。然而，分子生物学方法虽较形态法有一定的优势，自然海域生物具有高度多样性，因此自然水样中常有多种有害微藻同时存在，这就要求在日常海洋环境监测时对各种微藻同时检测。因此，最近还出现了多种可对自然样品中的多种有害微藻进行并行检测的基因芯片检测技术，包括光纤、悬珠、传感器和玻片DNA阵列等。但当前的大多分子检测技术只能对自然水样中的单种有害藻种进行检测。虽然当前建立的基因芯片检测技术能对多种产毒藻同时进行检测，但其检测成本高，依赖特殊仪器，且技术要求高，并且由于一些产毒微藻与其近缘种的基因序列差易较小，很难设计出种特异性探针，因此容易出现交叉反应，特别是由于当前的基因芯片技术实用性较差，因此难以推广到基层单位。
总之，分子生物学检测技术存在以下缺点：1)现有的分子检测方法除基因芯片技术除外均只能对自然样品的单种有害藻类进行鉴定和检测，而不能满足多种有害微藻并行检测的实际需要；2)无法实现现场检测：现有分子检测方法必须借助特殊的实验仪器，如荧光原位杂交需要荧光显微镜，实时荧光定量PCR需要荧光定量PCR仪，三明治杂交需要酶标仪等，这就使得这些检测方法只能在实验室才能完成，难以实现对自然水体中有害藻类现场检测的需要。3)现有芯片检测技术的缺点：检测成本高、需要特殊仪器且技术要求高，易出现交叉反应，造成检测结果的假阳性。
可见，当前还没有一项以超分枝滚环扩增标记为基础的海洋产毒微藻的平行检测技术及其相应的试剂盒的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法，其能对海洋自然环境中的常见产毒微藻进行并行检测，其检测灵敏度高、特异性强，且整个检测过程不需要昂贵的仪器。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测的膜分类基因芯片检测试纸条，所述膜分类基因芯片检测试纸条包括：Cm探针、Ha探针、Km探针、Ac探针、Kv探针、Pl探针、At探针、Aa探针、PC探针和NC探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10所示。
本发明还公开了一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测的膜分类基因芯片检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
1)合成如权利要求1所述的Cm探针、Ha探针、Km探针、Ac探针、Kv探针、Pl探针、At探针、Aa探针、PC探针和NC探针；
2)将合成的探针溶于pH 7.5、0.1M的Tris-HCl中，配制成浓度为10μM的溶液，并按加尾反应体系及加尾反应程序对各个探针进行Pol y dT加尾；
3)隔着衬纸在尼龙膜上用软铅笔划格，每格大小为0.5×0.5cm2，总体大小2.5×2cm2，共20个格子，沿框线将所用的尼龙膜条剪下；
4)将尼龙膜飘浮于ddH2O表面，让其吸水后沉入水中，再捞出浸泡于20×SSC溶液中5min，再将膜放置于滤纸上晾干；
5)探针点膜及固定：将步骤2)制备的加尾探针溶液加入到离心管中，离心管共20个，分为4排5列，第一排，标记为1，从左向右依次为A-E，分别对应PC、Ha、Ac、Pl、NC，第二排，标记为2，从左向右依次为A-E，分别对应Cm、Ha、Ac、Pl、Aa，第三排，标记为3，从左向右依次为A-E，分别对应Cm、Km、Kv、At、Aa，第四排，标记为4，从左向右依次为A-E，分别对应NC、Km、Kv、At、PC，用毛细吸管或移液器点样0.5～1μL，自然晾干；将点样后的尼龙膜夹于两层滤纸中间，在80℃烘箱内处理2h，制备得到膜分类基因芯片检测试纸条。
可选地，加尾反应体系具体为：5×TdT buffer 5.0μL、100mM dTT P 0.5μL、10μM如权利要求1所述的探针10.0μL、80U Terminal Deox ynucleotidyl Transferase 0.5μL、余量为ddH2O，以上体积总量为20.0μL；加尾反应程序为：37℃2h，70℃10min；所述20×SSC溶液具体为：NaCl，175.32g；Na3C6H5O7·2H2O，88.23g；ddH2O，1000mL；pH＝7.0。
本发明还公开了一种上述的膜分类基因芯片检测试纸条在制备基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒方面的应用。
本发明还公开了一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒，包括上述的膜分类基因芯片检测试纸条；自然样品核酸粗提试剂；10×Taq DNA ligationbuffer 100μL；PLP Mix；浓度为40U/μL的Taq DNA ligase；dNTP Mix；10×Bst DNApolymerase buffer；10μM引物Biotin-P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；10μM引物Biotin-P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；8U/μL Bst DNA polyme rase；杂交液；Buffer II；碱性磷酸酶标记的生物素抗体；显色剂。
可选地，所述海洋产毒微藻检测试剂盒还包括20×SSC，10×Buff er I，10×Buffer III，10％SDS和ddH2O；所述20×SSC包括以下组分：3M NaCl，0.3M Na3C6H5O7·2H2O，pH 7.0；10×Buffer I包括以下组分：1.0M Tris,1.5M NaCl,pH 7.5；10×Buffer III包括以下组分：1.0M T ris,1.0M NaCl,0.5M MgCl2,pH 9.5。
可选地，所述的自然样品核酸粗提试剂包括以下组分：2％(m/v)C TAB，0.5％(v/v)β-mercaptoethanol，1.4M NaCl，20mM EDTA，100m M Tris-Cl；
dNTP Mix包括以下组分：10mM dATP，10mM dGTP，10mM d CTP和10mM dGTP；
10×Bst DNA polymerase buffer包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mMKCl，20mM Mg(SO4)2，1％(v/v)TritonX-100，pH 8.8；
杂交液包括1％(m/v)Blocking Reagent II，0.75M NaCl,0.075M N a3C6H5O7·2H2O，50μg/mL鲑精DNA,0.1％Sarkosyl,0.02％(m/v)SDS；
Buffer II包括1％(m/v)Blocking Reagent II,0.1M Tris,0.15NaCl，pH 7.5；
显色剂包括2.81％(m/v)NBT，2.19％(m/v)BCIP，70％(v/v)CH3C(O)N(CH3)2；
所述的PLP Mix包括Cm-PLP探针、Ha-PLP探针、Km-PLP探针、A c-PLP探针、Kv-PLP探针、Pl-PLP探针、At-PLP探针、Aa-PLP探针、P C-PLP探针和NC-PLP探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.22所示；以上每个探针的浓度均为20pM。
本发明还公开了一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)水样的采集及藻细胞的过滤：采集自然水样，用5mL一次性注射器针头吸取检测样品，将滤膜安置于过滤器上，手推过膜；其中，滤膜的孔径为0.45μm，直径为13mm；
2)洗膜及膜的剪切处理：用针头吸取ddH2O，将含有藻细胞的滤膜洗涤2次，将滤膜从过滤器取下，用灭菌的解剖剪将其剪成碎屑，并用镊子将膜碎屑放入1.5mL离心管中；
3)DNA粗提液的制备：用移液器吸取100～200μL自然样品核酸粗提试剂加入到离心管中，短暂离心后，于涡旋振荡器上剧烈振荡5min，并经短暂离心，上清液即为DNA粗提液；
4)环化连接反应：用步骤3)制备的DNA粗提液按环化连接反应体系进行加样，并按照环化连接反应程序进行反应；
5)多重核酸扩增反应：按多重核酸扩增反应体系进行加样，并按照多重核酸扩增反应程序进行反应；
6)核酸变性：将步骤5)制备的多重HRCA产物经沸水浴热变性5min，冰浴1～2min；
7)核酸杂交：将膜分类基因芯片检测试纸条放入杂交袋中，加入1mL杂交液，加入变性的多重HRCA产物，封口混匀，42℃水浴孵育1～2h；
8)洗膜：剪开杂交袋，按下列条件依次洗膜：
8.1)用2×SSC/0.1％SDS室温洗膜5min 2次；
8.2)用0.1×SSC/0.1％SDS 42℃洗膜15min 2次；
8.3)用Buffer I室温洗膜2min；d.用Buffer II室温洗膜30min，上述反应在袋中进行；
9)抗体反应：剪开含探针的杂交袋一角，加入0.2μL AP-抗生物素，室温振荡30min；在室温下分别用Buffer I洗膜15min 2次，Buffer III洗膜2min 1次；
10)显色反应：将膜放入杂交袋中，依次加入1mL Buffer III和8μL显色剂，封口混匀，置于暗处，显色15min～2h；在样品明显出现颜色而本底开始变色时，停止显色，取出膜，置于50mL ddH2O中15～30min，将膜置于滤纸上晾干，对光观察结果；
11)结果判读：参照阴性和阳性对照结果进行检测样品的判读，其中阳性对照PC有显色斑点、阴性对照NC无显色斑点；对于检测样品，如果对应区域有显色斑点，则表明水样中有该藻的存在，如果对应区域无显色斑点，则表明水样中不存在该藻。
可选地，环化连接反应体系如下：10×Taq DNA ligation buffer 1.0μL、PLP Mix0.2μL、DNA粗提液2.0μL、Taq DNA ligase 0.1μL、ddH2O 6.7μL；所述环化连接反应程序如下：94℃4min，61℃50min，95℃15min。
可选地，所述多重核酸扩增反应体系如下：ddH2O 15.25μL、10×Bst DNApolymerase buffer 2.50μL、环化连接反应产物4.00μL、10m M dNTPs 0.75μL、10μMBiotin-P1 1.00μL、10μM Biotin-P2 1.00μL、8U/μl Bst DNA polymerase 0.50μL。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明的试剂盒是一种便携式检测试剂盒，该试剂盒能同时对海洋环境中的几种常见产毒微藻，包括海洋卡盾藻、赤潮异湾藻、米氏凯伦藻、强壮前沟藻、剧毒卡尔藻、利玛原甲藻、塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻进行高特异性、高灵敏度和快速检测，该检测不需要特殊的仪器，可满足野外现场检测的要求。
2)本发明的试剂盒实用性强：现有的基因芯片检测法的整个检测流程需要特殊的仪器，包括基因芯片的制备需要芯片点样仪，芯片杂交需要芯片杂交仪，芯片结果判读需要荧光扫描仪，这就使得其只能在实验室才能完成，实用性较差；而本检测试剂盒直接提供膜分类基因芯片检测试纸条，采用等温核酸扩增方法(HRCA)进行靶核酸的标记，核酸杂交简单，分子杂交结果判读直接通过肉眼完成，整个过程只需简单的设备即可完成；现有基因芯片检测法属高新技术，操作复杂，对检测人员的技术要求高，本发明试剂盒只需按说明书操作即可，因此实用性较强，适宜推广应用。
3)本发明的检测灵敏度高：现有的基因芯片检测技术通过PCR标记核酸或直接以rRNA为靶分子，而本试剂盒采用HRCA(超分枝滚环扩增)进行靶核酸的扩增和标记，其灵敏度高于PCR，而rRNA分子易于降解，因此其检测灵敏度较高。
4)本发明的检测特异性高：HRCA具有区分单个核苷酸差异的能力，分类探针的主观性设计能保证其特异性，HRCA和分类探针的双重特异性保证了本试剂盒检测的特异性。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明分类探针在检测试纸条上的分布示意图；
图2是本发明本试剂盒的检测效果示意图；其中，注：斑点杂交信号，其中A1/E4和A4/E1分别为阳性和阴性对照结果；B1/B2、C1/C2、D1/D2、A2/A3、B3/B4、C3/C4、D3/D4、E2/E3呈阳性结果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒
该试剂盒是一种能并行检测海洋环境中几种常见产毒微藻，包括海洋卡盾藻、赤潮异湾藻、米氏凯伦藻、强壮前沟藻、剧毒卡尔藻、利玛原甲藻、塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻的便携式检测试剂盒，该试剂盒主要是基于滚环扩增及反向斑点杂交技术原理制成。
本试剂盒所使用到的器材和试剂如下：
水样采集器具、5mL一次性注射器、过滤器及微孔滤膜(如孔径0.45μm，直径13mm)、解剖剪和镊子、涡旋振荡器、低速离心机、移液器、各种规格的灭菌枪头、1.5mL和200μL离心管、恒温设备(如水浴锅等)。
本发明的基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒，包括以下组分：
(1)膜分类基因芯片检测试纸条，通过以下方法制备得到：
a)按下列序列信息(表1)交由相关生物公司合成分类探针；
表1分类探针信息
b)将合成的探针溶于0.1M Tris-HCl(pH 7.5)，配制成浓度为10μM的溶液，并按表2的反应体系对各个探针进行Poly dT加尾，反应程序为：37℃1.5～2h，70℃10min；
表2分类探针的加尾反应体系
| 成分 | 体积(μL) |
| 5×TdT buffer | 5.0 |
| dTTP(100mM) | 0.5 |
| 检测探针(10μM)(表1) | 10.0 |
| Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(80U) | 0.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | To 20.0 |
c)隔着衬纸在尼龙膜(NCM)上用软铅笔划格，每格大小为0.5×0.5cm2，总体大小2.5×2cm2，沿框线将所用的尼龙膜条剪下；
d)将NCM飘浮于ddH2O表面，让其吸水后沉入水中，再捞出浸泡于20×SSC(salinesodium citrate，柠檬酸钠盐溶液)(NaCl，175.32g；Na3C6H5O7·2H2O，88.23g；ddH2O，1000mL；pH＝7.0)中5min，再将膜放置于滤纸上晾干；
e)探针点膜及固定：将步骤(2)制备的加尾探针溶液按图1的布局，分别加入不同离心管中，共点样20个，分为4排5列，第一排，标记为1，从左向右依次为A-E，分别对应PC、Ha、Ac、Pl、NC，第二排，标记为2，从左向右依次为A-E，分别对应Cm、Ha、Ac、Pl、Aa，第三排，标记为3，从左向右依次为A-E，分别对应Cm、Km、Kv、At、Aa，第四排，标记为4，从左向右依次为A-E，分别对应NC、Km、Kv、At、PC，点样用毛细吸管或移液器进行，每个探针样品点样0.5–1μL，自然晾干；将点样后的NCM夹于两层滤纸中间，在80℃烘箱内处理1.5～2h。
(2)自然样品核酸粗提试剂，包括2％(m/v)CTAB，0.5％(v/v)β-mercaptoethanol，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-Cl；
(3)10×Taq DNA ligation buffer，包括100mM DTT，0.2M Tri s-HCl，250mMKCH3COO，100mM Mg(CH3COO)2，10mM NAD，1％(v/v)TritonX-100，pH 7.6；
(4)PLP Mix(各探针的浓度均为20pM)，序列信息见表3；
表3PLP序列信息
(5)Taq DNA ligase(40U/μL)；
(6)dNTP Mix，包括10mM dATP,10mM dGTP,10mM dCTP,10mM dGTP；
(7)10×Bst DNA polymerase buffer，包括200mM Tris-HCl，100mM(NH4)2SO4，100mM KCl，20mM Mg(SO4)2,1％(v/v)TritonX-100,pH 8.8；
(8)引物Biotin-P1(10μM)：5’-GTGATGAGGTCCAGAGCA-3’；
(9)引物Biotin-P2(10μM)：5’-GGTGGTGGTGAAAGAATAG-3’；
(10)Bst DNA polymerase(8U/μL)；
(11)杂交液，包括1％(m/v)Blocking Reagent II，0.75M NaCl,0.075MNa3C6H5O7·2H2O，50μg/mL鲑精DNA,0.1％Sarkosyl,0.02％(m/v)SDS；
(12)Buffer II，包括1％(m/v)Blocking Reagent II,0.1M Tris,0.15NaCl，pH7.5；
(13)碱性磷酸酶标记的生物素抗体(AP-抗生物素)；
(14)显色剂，包括2.81％(m/v)NBT，2.19％(m/v)BCIP，70％(v/v)CH3C(O)N(CH3)2；
以下为自备试剂：
(15)20×SSC，包括3M NaCl，0.3M Na3C6H5O7·2H2O，pH 7.0；
(16)10×Buffer I，包括1.0M Tris,1.5M NaCl,pH 7.5；
(17)10×Buffer III，包括1.0M Tris,1.0M NaCl,0.5M MgCl2,pH 9.5；
(18)10％SDS；
(19)ddH2O。
实施例2基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒的使用方法
该方法包括以下步骤：
(1)水样的采集及藻细胞的过滤：采集自然水样，用5mL一次性注射器针头吸取检测样品，将滤膜(孔径0.45μm，直径13mm)安置于过滤器上，手推过膜。
(2)洗膜及膜的剪切处理：用针头吸取ddH2O，将含有藻细胞的滤膜洗涤2次，将滤膜从过滤器取下，用灭菌的解剖剪将其剪成碎屑，并用镊子将膜碎屑放入1.5mL离心管中。
(3)DNA粗提液的制备：用移液器吸取100～200μL自然样品核酸粗提试剂加入到离心管中，短暂离心后，于涡旋振荡器上剧烈振荡5m in，并经短暂离心，上清液即为DNA粗提液。
(4)环化连接反应：用步骤(3)制备的DNA粗提液按表4的环化连接反应体系进行加样，连接反应程序：94℃4min，61℃50min，95℃15min。
表4环化连接反应体系
| 成分 | 体积(μL) |
| 10×Taq DNA ligation buffer | 1.0 |
| PLP Mix(各PLP的浓度均为20pM) | 0.2 |
| DNA粗提液 | 2.0 |
| Taq DNA ligase | 0.1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 6.7 |
(5)多重核酸扩增(HRCA)反应：按表5的反应体系进行加样，多重HRCA反应程序：94℃4min，61℃50min，95℃15min。
表5环化连接反应体系
| 成分 | 体积(μL) |
| ddH<sub>2</sub>O | 15.25 |
| 10×Bst DNA polymerase buffer | 2.50 |
| 环化连接反应产物 | 4.00 |
| dNTPs(10mM) | 0.75 |
| Biotin-P1(10μM) | 1.00 |
| Biotin-P2(10μM) | 1.00 |
| Bst DNA polymerase(8U/μl) | 0.50 |
(6)核酸变性：将步骤(5)制备的多重HRCA产物经沸水浴热变性5min，冰浴2min。
(7)核酸杂交：将膜分类基因芯片检测试纸条放入杂交袋中，加入1mL杂交液，加入步骤(6)制备得到的变性的多重HRCA产物，封口混匀，42℃水浴孵育1～2h。
(8)洗膜：剪开杂交袋，按下列条件依次洗膜：a.用2×SSC/0.1％SDS室温洗膜5min2次；b.用0.1×SSC/0.1％SDS 42℃洗膜15min 2次；c.用Buffer I室温洗膜2min；d.用Buffer II室温洗膜30min(袋中进行)。
(9)抗体反应：剪开含探针的杂交袋一角，加入0.2μL AP-抗生物素，室温振荡30min；在室温下分别用Buffer I洗膜15min 2次，Buffe r III洗膜2min 1次。
(10)显色反应：将膜放入杂交袋中，依次加入1mL Buffer III和8μL显色剂，封口混匀，置于暗处，显色15min～2h；在样品明显出现颜色而本底开始变色时，停止显色，取出膜，置于50mL ddH2O中15～30min，将膜置于滤纸上晾干，对光观察结果。
(11)结果判读(参照图1)(图2)：参照阴性和阳性对照结果进行检测样品的判读，其中阳性对照有显色斑点(PC)、阴性对照无显色斑点(NC)；对于检测样品，如果已知种特异性探针对应区域有显色斑点(同阳性对照)则表明水样中有相应藻种的存在，反之(同阴性对照)则表明水样中不存在该藻种。
由图2可知，A1/E4和A4/E1分别为阳性和阴性对照结果；B1/B2、C1/C2、D1/D2、A2/A3、B3/B4、C3/C4、D3/D4、E2/E3呈阳性结果，表明检测的样品中分别含有与其对应的8种目标藻，即赤潮异湾藻、强壮前沟藻、利玛原甲藻、海洋卡盾藻、米氏凯伦藻、剧毒卡尔藻、塔玛亚历山大藻和链状亚历山大藻。
实施例3灵敏度的测定
采集自然海水，取10mL加入实验室培养的目标藻细胞各104个(即细胞浓度为1000cells/mL)，混匀作为初始样品液，然后用自然海水将初始样品液作10倍梯度稀释(5个梯度)，制备的各测试样品中的藻细胞浓度分别为100cells/mL、10cells/mL、1cells/mL、0.1cell/mL和0.01cell/mL。用本试剂盒采用实施例2的操作步骤对上述样品分别进行检测，结果显示本试剂盒的检测灵敏度达0.01cell/mL。
实施例4特异性检验
提取目标藻种及自然海域常见的13种微藻，即三角褐指藻、小新月菱形藻、裸甲藻、湛江叉鞭金藻、威氏海链藻、金藻、扁藻、微绿球藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、小三毛金藻、小球藻、骨条藻的基因组DNA，以其作为模板分别对PLP(HRCA)和分类探针进行特异性测试：(1)PLP特异性测试：以基因组DNA作为模板，分别用各藻种的特异性PLP、阳性和阴性PLP进行HRCA，结果显示阳性探针能与所有藻种的基因组DNA产生HRCA阳性结果，阴性探针则不与任何藻种的基因组DNA产生HRCA阳性结果，而各特异性PLP只能与相应目标藻种的基因组DNA产生阳性HRCA结果；(2)分类探针特异性测试：用阳性PLP以各藻种的基因组DNA为模板及用特异性PLP以相应藻种的基因组DNA为模板分别进行HRCA扩增，将获得的所有HRCA产物进行热变性后分别用于阳性分类探针及特异性分类探针的斑点杂交测试，结果显示阳性探针能与所有藻种的阳性PLP扩增产物产生阳性杂交结果，而分类探针只与相应藻种的特异性PLP扩增产物有阳性杂交结果。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 哈尔滨工业大学（威海）
<120> 基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒及检测方法
<130> 2017
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<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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ggtgttgctt ctcagttctc 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
aaatgggcac agtatggga 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
gtctcgtctt cgtcgcaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
cgtaggtggt ctcgtgaatg 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
cgataaagga aggctggaa 19
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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acaaccaggg cggctacta 19
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<212> DNA
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caaggatagc aatgagcgaa 20
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catacgagtc cttctgtgcg 20
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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cgttgtggag ctgaatcca 19
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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aagcagcagt agccatttct 20
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gtgatgaggt ccagagca 18
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ggtggtggtg aaagaatag 19
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
ttaaccgatc atctcgctca aagagcatgc tctggacctc atcacggtgg tggtgaaaga 60
ataggagaac tgagaagcaa cacctgttat ctcgagtgc 99
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
ctttagacta caattcgcca gcaagctggt gctctggacc tcatcacggt ggtggtgaaa 60
gaatagtccc atactgtgcc catttgactg agcacgcac 99
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
tcatgcagag cagaagatcg caggcaagca catgaagcat tgctctggac ctcatcacgg 60
tggtggtgaa agaatagttg cgacgaagac gagacgctcc tggcaccaac aacct 115
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
gcgatgctcc acaagtgaag atcacagcct tgctctggac ctcatcacgg tggtggtgaa 60
agaatagcat tcacgagacc acctacgaag agacacaaga 100
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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ggaaatcagt ttagacatga gttctaccag tgctctggac ctcatcacgg tggtggtgaa 60
agaatagttc cagccttcct ttatcgctgc gaccagacat gc 102
<210> 18
<211> 97
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
actcggagga ggcatgccgt acacagctgc tctggacctc atcacggtgg tggtgaaaga 60
atagtagtag ccgccctggt tgtttccaag gaacgtg 97
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
ttgtcaagca agcactacaa tctcaccatg ctctggacct catcacggtg gtggtgaaag 60
aatagttcgc tcattgctat ccttgccaca gccaaaacct a 101
<210> 20
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
caaacaaata caccagacac atttaacatg ctctggacct catcacggtg gtggtgaaag 60
aatagcgcac agaaggactc gtatgtcaag gacaaggaca 100
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<211> 100
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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ggctgctggc accagacttg ccctccaatt gctctggacc tcatcacggt ggtggtgaaa 60
gaatagtgga ttcagctcca caacgagctg gaattaccgc 100
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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cggatatcca catcacactt catgatgtgc tctggacctc atcacggtgg tggtgaaaga 60
atagaagcag cagtagccat ttctcataca gatcctta 98
Claims (7)
1.一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测的膜分类基因芯片检测试纸条，其特征在于，所述膜分类基因芯片检测试纸条包括：Cm探针、Ha探针、Km探针、Ac探针、Kv探针、Pl探针、At探针、Aa探针、PC探针和NC探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.10所示。
2.一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测的膜分类基因芯片检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成如权利要求1所述的Cm探针、Ha探针、Km探针、Ac探针、Kv探针、Pl探针、At探针、Aa探针、PC探针和NC探针；
2)将合成的探针溶于pH 7.5、0.1M的Tris-HCl中，配制成浓度为10μM的溶液，并按加尾反应体系及加尾反应程序对各个探针进行Poly dT加尾；
3)隔着衬纸在尼龙膜上用软铅笔划格，每格大小为0.5×0.5cm2，总体大小2.5×2cm2，共20个格子，沿框线将所用的尼龙膜条剪下；
4)将尼龙膜飘浮于ddH2O表面，让其吸水后沉入水中，再捞出浸泡于20×SSC溶液中5min，再将膜放置于滤纸上晾干；
5)探针点膜及固定：将步骤2)制备的加尾探针溶液加入到离心管中，离心管共20个，共点样20个，分为4排5列，第一排，标记为1，从左向右依次为A-E，分别对应PC、Ha、Ac、Pl、NC，第二排，标记为2，从左向右依次为A-E，分别对应Cm、Ha、Ac、Pl、Aa，第三排，标记为3，从左向右依次为A-E，分别对应Cm、Km、Kv、At、Aa，第四排，标记为4，从左向右依次为A-E，分别对应NC、Km、Kv、At、PC，用毛细吸管或移液器点样，每个探针样品点样0.5～1μL，自然晾干；将点样后的尼龙膜夹于两层滤纸中间，在80℃烘箱内处理2h，制备得到膜分类基因芯片检测试纸条。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，加尾反应体系具体为：5×TdT缓冲液5.0μL、100mM dTTP 0.5μL、10μM如权利要求1所述的探针10.0μL、80U末端脱氧核苷酸转移酶0.5μL、余量为ddH2O，以上体积总量为20.0μL；加尾反应程序为：37℃2h，70℃10min；所述20×SSC溶液具体为：NaCl，175.32g；Na3C6H5O7·2H2O，88.23g；ddH2O，1000mL；pH＝7.0。
4.权利要求1所述的膜分类基因芯片检测试纸条在制备基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒方面的应用。
5.一种基于超分枝滚环扩增标记的海洋产毒微藻检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的膜分类基因芯片检测试纸条；自然样品核酸粗提试剂；10×Taq DNA连接缓冲液；PLP Mix；浓度为40U/μL的Taq DNA连接酶；dNTP Mix；10×Bst DNA聚合酶缓冲液；10μM引物Biotin-P1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；10μM引物Biotin-P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；8U/μL Bst DNA聚合酶；杂交液；缓冲液II；碱性磷酸酶标记的生物素抗体；显色剂；
所述的PLP Mix包括Cm-PLP探针、Ha-PLP探针、Km-PLP探针、Ac-PLP探针、Kv-PLP探针、Pl-PLP探针、At-PLP探针、Aa-PLP探针、PC-PLP探针和NC-PLP探针，其核苷酸序列分别如SEQID NO.13-SEQ ID NO.22所示；以上每个探针的浓度均为20pM。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述海洋产毒微藻检测试剂盒还包括20×SSC，10×缓冲液I，10×缓冲液III，10％SDS和ddH2O；所述20×SSC包括以下组分：3MNaCl，0.3M Na3C6H5O7·2H2O，pH 7.0；10×缓冲液I包括以下组分：1.0M Tris，1.5M NaCl，pH7.5；10×缓冲液III包括以下组分：1.0M Tris，1.0M NaCl，0.5M MgCl2，pH 9.5。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的自然样品核酸粗提试剂包括以下组分：2％(m/v)CTAB，0.5％(v/v)β-巯基乙醇，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-Cl；
dNTP Mix包括以下组分：10mM dATP，10mM dGTP，10mM dCTP和10mM dGTP；
10×Bst DNA聚合酶缓冲液包括200mM Tris-HCl，100mM (NH4)2SO4，100mM KCl，20mMMg(SO4)2，1％(v/v)TritonX-100，pH 8.8；
杂交液包括1％(m/v)阻断剂II，0.75M NaCl，0.075M Na3C6H5O7·2H2O，50μg/mL鲑精DNA，0.1％十二烷基肌氨酸钠，0.02％(m/v)SDS；
缓冲液II包括1％(m/v)阻断剂II，0.1M Tris，0.15NaCl，pH 7.5；
显色剂包括2.81％(m/v)NBT，2.19％(m/v)BCIP，70％(v/v)CH3C(O)N(CH3)2。
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