CN107988383B - 一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的lamp引物组和方法 - Google Patents

一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的lamp引物组和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法。所述LAMP引物组包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF；序列依次如SEQ ID NO.1～5所示。本发明的LAMP引物组及其检测方法检测腐烂茎线虫的特异性、灵敏性非常好，不仅可以检测鉴定腐烂茎线虫不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）的个体，还可以从多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品中直接检测出腐烂茎线虫，检测灵敏度可达到1/1000单条虫DNA。本发明为腐烂茎线虫的快速检测鉴定和早期诊断提供了一个新的检测方法，其具有准确、灵敏、稳定和结果判定直观的优点，该发明操作简便、实用性强，对于口岸和调运检疫以及产地监测工作具有重要的意义和应用价值。

Description

一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法
技术领域
本发明属于病原检测技术领域。更具体地，涉及一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法。
背景技术
腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor Thorne，1945）是一种迁移性的内寄生线虫，已知寄主120多种，主要为害甘薯和马铃薯，是农业上的重要病原线虫。在美国由于该线虫危害造成马铃薯产量的损失每年平均达10%。在中国，腐烂茎线虫病是制约甘薯生产的三大重要病害之一，近年来业已上升为北方甘薯产区最严重的病害，一般发病田块减产20%～50%，重病田块基本上绝产无收；在中国该线虫还危害当归、人参和三七等多种药材植物，危害当归严重时发病率高达84.9%。为了控制腐烂茎线虫的传播扩散导致更大的危害和损失，中国及其他国家和地区将其列为植物检疫性线虫。腐烂茎线虫种类的鉴定目前主要是利用形态学方法，主要是依据雌成虫的形态特征，通过高倍显微镜和扫描电镜观察获得形态特征信息，并与文献对腐烂茎线虫的形态描述进行比对分析，做出判定，而且卵、幼虫和雄虫均不适于形态学方法鉴定。此外，茎属线虫种类多，种间形态差异小，并且腐烂茎线虫还经常与其他类群线虫混合发生，运用形态学方法鉴定相似的茎属线虫种类或从多种混合的线虫中鉴定腐烂茎线虫非常困难，并且需要几天时间和多条线虫。因此研究和使用分子生物学方法快速准确的检测鉴定腐烂茎线虫是非常有必要的。
目前，对于腐烂茎线虫的分子生物学鉴定，Wendt和宛菲均根据腐烂茎线虫rDNA-ITS区域设计了特异性引物，利用常规PCR技术进行分子鉴定（Wendt,1993;宛菲等,2008），该方法虽然具有准确、灵敏的特性，但是依然存在一定的局限性：（1）对于多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品等实物样品，已有PCR检测方法需要先从样品中分离出目标线虫，然后才能进行检测，过程繁琐、工作量大；（2）其所述检测方法需要数小时，而且检测灵敏度较低，当样品中腐烂茎线虫含量较低时，无法实现目的；（3）需要用精密而昂贵的RCR仪，检测过程复杂，结果需要琼脂糖凝胶电泳检测才可以判定，不能满足口岸和调运检疫以及田间监测的需求。另外，环介导恒温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplicationof DNA, LAMP）是本世纪初开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP扩增过程依赖识别靶序列的6个独立区域，特异性强，灵敏度高，而且扩增速度快、对实验设备要求低、检测结果可以通过肉眼直观判断，因此该方法高效、快速、经济、操作简单，应用前景极为广泛。发明专利201110228196.6公开了一种基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒，针对甘薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区设计了3组引物，可实现甘薯腐烂茎线虫的检测以及A型和B型的鉴定，解决常规分子检测成本高、效率低、速度慢，不能满足当前植物检疫和植物保护需要的难题。但是，该方案仍然没有解决多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品等实物样品无法直接检测的问题，还是需要分离出样本中的线虫后再进行检测。而在实际的基层检测以及大批量筛查工作中，由于实验仪器设备的限制、人员能力的限制以及工作量大等因素的限制，亟需一种可以直接以样本总DNA为模板进行检测的技术。
多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品等实物样品中都含有很多除目标DNA以外的其他杂质，尤其是土壤，是一个非常复杂的生态系统，包含有成千上亿种生物体，其中单就存在的线虫种类就非常之多，在一平方米土壤中的线虫种类多者可以达到一百多种；有时还可能会有组织细胞结构已被破坏的生物体残渣被作为有机肥料混入土壤中。这对实现直接特异检测出某一种线虫造成了非常大的困扰，另外，土壤中大量的微生物和环境之间存在着交互作用，在DNA提取过程中常伴随提取出一些腐殖性物质，将严重干扰检测过程。另外土壤中还存在很多未知的因素严重影响目标线虫检测的效果，这是本领域一直以来难以克服的难题。
综上所述，目前包括腐烂茎线虫在内的植物线虫的实际检测工作中，最大的问题和障碍就是无法实现直接检测多种线虫混合的样品、植物组织样品、尤其是土壤样品等实物样品中的目标线虫，需要先从样品中分离出目标线虫，然后才能进行检测，过程繁琐、工作量大，不适用基层检测以及大批量筛查工作。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种不仅可以检测鉴定腐烂茎线虫不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）的个体，还可以从多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品中直接快速检测出腐烂茎线虫的分子检测方法。且该方法准确、灵敏、高效、简便、快速。
本发明的目的是提供一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组。
本发明另一目的是提供一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组，包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF；序列依次如SEQ ID NO.1～5所示。
其中，优选地，所述复杂样本为多种线虫混合的样品、植物组织样品或土壤样品。
一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP方法，以待测样品DNA为模板，利用上述LAMP引物组进行LAMP扩增；根据扩增结果判断待测样品中是否含有腐烂茎线虫。
优选地，所述LAMP扩增的体系如下：
10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL
F3/B3(5 μM) 1 μL
FIP/BIP(5 μM) 7 μL
LF(10 μM) 1 μL
dNTPs (10 mmol/L) 2 μL
MgSO4 (100 mmol/L) 1.5 μL
Bst DNA聚合酶 2.0warmstart(8U/μl) 0.2 μL
模板 DNA 1 μL
ddH2O 补足 25 μL。
优选地，所述LAMP扩增的反应条件为：在65℃ 温育50min以上，85℃保温5min。
另外，所述根据扩增结果判断待测样品中是否含有腐烂茎线虫的具体方法为：利用电泳检测法或荧光染料目测检测法对LAMP扩增进行检测。
所述电泳检测法：使用2%琼脂糖凝胶在5～10 V / cm 电压下电泳 35 min 检测LAMP扩增产物，出现LAMP特征性阶梯状条带，判定为阳性，即为有腐烂茎线虫；若未出现梯状条带，则为阴性，判定待测样品不含有腐烂茎线虫。
所述荧光染料目测检测法：在LAMP扩增产物中加入2μL 100×SYBR Green I 染料，可观察到绿色荧光，判定为阳性，即为有腐烂茎线虫；若观察到橙色，则为阴性，判定待测样品不含有腐烂茎线虫。
另外，上述LAMP引物组或所述LAMP方法在检测和/或鉴定腐烂茎线虫中的应用，优选地是指在从复杂样品中检测和/或鉴定腐烂茎线虫中的应用，以及在制备腐烂茎线虫的检测鉴定试剂或试剂盒方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。
一种含有上述LAMP引物组的从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP试剂盒，也在本发明的保护范围之内。
所述复杂样品包括混合线虫样品、植物组织样品和/或土壤样品。
优选地，所述试剂盒还含有SYBR Green I染料。
优选地，所述试剂盒还含有LAMP扩增所需试剂。如10×IsothermalAmplification Buffer、10 mmol/L dNTPs、100 mmol/L MgSO4、8U/μL Bst DNA聚合酶2.0warmstart和/或ddH2O等。
优选地，所述试剂盒的LAMP扩增体系如下：
10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL
F3/B3(5 μM) 1 μL
FIP/BIP(5 μM) 7 μL
LF(10 μM) 1 μL
dNTPs (10 mmol/L) 2 μL
MgSO4 (100 mmol/L) 1.5 μL
Bst DNA聚合酶 2.0warmstart(8U/μl) 0.2 μL
模板 DNA 1 μL
ddH2O 补足 25 μL。
优选地，所述试剂盒的LAMP扩增反应条件为：在65℃ 温育50min以上，85℃保温5min。
本发明的LAMP引物组及其方法和试剂盒不仅可以检测腐烂茎线虫的成虫，对其幼虫和卵等发育时期也同样具有很好的检测效果，而且可以检测多种线虫混合样品、植物组织样品和/或土壤样品中的腐烂茎线虫。
因此优选地，腐烂茎线虫可以指腐烂茎线虫的卵、幼虫、雌虫和/或雄虫。
即上述LAMP引物组及其方法和试剂盒在检测和/或鉴定腐烂茎线虫的雌虫、雄虫、幼虫和卵中的应用以及在检测多种线虫混合样品、植物组织样品和/或土壤样品中的腐烂茎线虫中的应用均应在本发明保护范围内。
本发明在研究过程中发现，检测基因位点的选择对于腐烂茎线虫的检测效果具有很大的影响，直接关系到检测的特异性、灵敏性、以及对检测样本的要求。本发明研究团队针对腐烂茎线虫的包括ITS、核糖体DNA 28S等多个区域进行了分子检测的研究，设计了多组LAMP引物组，以检测的特异性、灵敏性以及是否能够直接检测混合样品、植物样品和土壤样品为筛选依据，最终得到本发明所述的LAMP引物组及检测体系。
该LAMP引物组及检测体系不仅可以检测鉴定腐烂茎线虫不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）的个体，还可以从多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品中直接检测出腐烂茎线虫，检测灵敏度可达到1/1000单条虫DNA。
对于不同样本的DNA提取方法：
（1）腐烂茎线虫和多种线虫混合样品的DNA提取方法参照常规植物线虫DNA提取方法。
（2）植物组织样品DNA提取采用Omega HP Plant DNA Kit试剂盒方法，具体操作方法如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
称取植物组织样品用剪刀剪碎，放入离心管中，液氮速冻，用研磨棒研磨约2min；
Figure 362214DEST_PATH_IMAGE002
离心管中加入500 μL Buffer CPL，加入10μL β-巯基乙醇，涡旋混匀后65 ℃水浴15 min，水浴期间颠倒混匀两次；
Figure DEST_PATH_IMAGE003
加入500 μL氯仿和异丙醇混合液（体积比24∶1），涡旋混匀，10000 rpm室温离心10 min；
Figure 658197DEST_PATH_IMAGE004
取上清液300 μL于新的1.5 mL离心管中，加入10 μLRNAse酶；
Figure DEST_PATH_IMAGE005
加入150 μL Buffer CXD和300 μL无水乙醇，混匀得到一均匀的混合液；
Figure 569915DEST_PATH_IMAGE006
将DNA样品纯化柱置于2 mL收集管中，将混合液转移到纯化柱，10000 rpm离心1min；
Figure DEST_PATH_IMAGE007
弃滤液和收集管，将纯化柱放入新的收集管中，加650 μL SPW Wash Buffer，10000 rpm离心1 min；
Figure 558730DEST_PATH_IMAGE008
倒弃滤液，加入650 μL SPW Wash Buffer，10000 rpm离心1 min；
Figure DEST_PATH_IMAGE009
倒弃滤液，10000 rpm空柱离心2 min，甩干柱子中残留的液体；
Figure 795546DEST_PATH_IMAGE010
把纯化柱置于新的1.5 mL离心管中，加30μL预热至55 ℃的无菌水至柱子的膜中央，静置2 min。10000 rpm离心1 min，得到植物组织样品总DNA。
（3）土壤样品的DNA提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒的方法，具体步骤如下：
Figure 82170DEST_PATH_IMAGE001
将土壤样品放入一个PowerBead Tubes 中，轻轻涡旋混匀。
②加入 60 μL Solution C1（若出现沉淀，60℃水浴至全溶解），上下颠倒数次混匀，把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速（3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5~10min）涡旋连续振荡 10min（若使用24头适配器同时处理 12 个样品，涡旋时间延长 5-10min）。
Figure 956717DEST_PATH_IMAGE003
室温下10000 rpm离心30s，转移上清至一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中，加入250 μL Solution C2 到上清中，涡旋混匀5s；4℃孵育 5min。
Figure 241068DEST_PATH_IMAGE004
室温下10000 rpm离心1min，避开沉淀小珠，转移上清≤600 μL到一个新的收集管中加入200 μL Solution C3 到上清中，涡旋混匀；4℃孵育 5min。
Figure 715911DEST_PATH_IMAGE005
室温下10000 rpm离心1min避开沉淀小珠，转移上清≤750 μL到一个新的收集管中Solution C4 使用前先摇匀；加入1200 μL Solution C4到上清中，涡旋混匀5s。
Figure 46705DEST_PATH_IMAGE006
加入约675 μL上清到Spin Filter中，室温10000 rpm离心1 min。弃去滤液，继续加载675 μL上清，室温 10000 rpm离心1min。重复直至过滤完所有上清。
Figure 228288DEST_PATH_IMAGE007
加入500 μL Solution C5到Spin Filter中，室温10000 rpm离心30s，弃去上清。
Figure 480278DEST_PATH_IMAGE008
室温10000 rpm离心1min，小心转移Spin filter到2ml Collection Tube（试剂盒提供）中，尽量避免Solution C5污染。
Figure 193150DEST_PATH_IMAGE009
加入100 μL Solution C6 到白色滤膜中心室温10000 rpm离心30s。弃去SpinFilter。此时收集管中的 DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化，建议DNA 冷冻保存（-20℃~-80℃）。
本发明具有以下有益效果：
（1）检测高效、简便易行：本发明的LAMP引物组及检测体系不仅可以检测鉴定腐烂茎线虫不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）的个体，克服了传统的形态学方法只能检测鉴定雌虫的缺陷。本方法还可以从多种不同种类的线虫混合样品、植物组织样品和土壤样品中直接检测出腐烂茎线虫；省去了传统形态学鉴定和已有分子检测方法所要求的从样品中分离目标线虫的步骤，从而节省了大量时间和工作量。
（2）检测速度更快、灵敏度更高：本发明建立的腐烂茎线虫LAMP检测方法仅需50min，并且检测灵敏度达到1/1000单条虫DNA。而传统的形态学检测鉴定需要几天时间，并且需要多条雌虫；已报道的腐烂茎线虫PCR检测方法则需要数小时，检测灵敏度较低。因此本发明的检测速度更快、灵敏度更高。
（3）特异性强、准确性高：本发明建立的腐烂茎线虫LAMP检测方法所设计引物组是针对腐烂茎线虫核糖体DNA-28S序列中的6个不同的区域进行识别扩增，相比常规PCR引物只对靶序列的2个不同区域进行识别扩增而言，LAMP检测的特异性大大提高，假阳性的概率随之大大降低，因此检测的准确性也大大提高。本发明利用所设计的特异性引物对形态和生物学特性相对近似的以及田间相对常见的10种其他植物线虫进行了测试验证，保证了该方法的特异性和准确性。
（4）稳定性强、可信度高：本发明设计的腐烂茎线虫LAMP引物对腐烂茎线虫的不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）、来源不同的16个腐烂茎线虫群体进行了测试验证，保证了该方法的检测结果具有充分的稳定性和可信度。
（5）检测方法操作方便高效：本发明建立的腐烂茎线虫LAMP检测方法仅需50min，而传统的形态学检测鉴定需要几天时间，并且需要多条雌虫；已报道的腐烂茎线虫PCR检测方法则需要数小时。本发明建立的LAMP SYBR Green I染色法，只需恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行，用肉眼观察颜色变化就可判定结果，省去了昂贵的仪器设备和繁琐的操作过程。因此本发明的检测效率大大提高，操作非常简单、易行。本发明在65℃等温条件下50min便能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到腐烂茎线虫，且不需要复杂仪器，为腐烂茎线虫的检测提供了新的技术平台，能较好满足对腐烂茎线虫的现场检测要求，适用于出入境植物和植物产品的检验检疫和病害的调查、快速诊断及监测等，对防止腐烂茎线虫的传播具有重要意义。
附图说明
图1本发明腐烂茎线虫LAMP检测反应温度优化电泳结果。其中M为Maker（DL2000），1~8分别是反应温度61、62、63、64、65、66、67、68℃。
图2 本发明腐烂茎线虫LAMP检测反应时间优化电泳结果。其中M为Maker（DL2000），1~9分别是反应时间10、20、30、40、50、60、70、80、90min。
图3 本发明腐烂茎线虫LAMP检测特异性结果。其中A为电泳检测结果，B为SYBRGreen I染色反应结果。其中M为Maker（DL2000）；1为空白对照；2为靶标线虫：腐烂茎线虫；3~12为对照线虫：鳞球茎线虫、拟禾本科根结线虫、香蕉穿孔线虫、菊花叶枯线虫、滑刃属新种、玉米短体线虫、水稻干尖线虫、水稻潜根线虫、丝尾垫刃线虫和小杆线虫。
图4 本发明腐烂茎线虫LAMP检测稳定性结果。其中A为电泳检测结果，B为SYBRGreen I染色反应结果。其中M为Maker（DL2000）；1为空白对照；2~17为腐烂茎线虫不同种群：GZ1、SD1、SD2、HN1、BJ1、LN1、SX2、HB1、AH2、XJ1、TJ1、JS1、SX3、GD1、SX1、YG1。
图5 本发明腐烂茎线虫LAMP检测不同虫态腐烂茎线虫结果。其中A为电泳检测结果，B为SYBR Green I染色反应结果。其中M为Maker（DL2000）；1为空白对照；2为腐烂茎线虫单条雌虫；3为腐烂茎线虫单条雄虫；4为腐烂茎线虫单条幼虫；5为腐烂茎线虫单个卵。
图6 本发明腐烂茎线虫LAMP检测灵敏度结果。其中A为电泳检测结果，B为SYBRGreen I染色反应结果。其中M为Maker（DL2000）；1~7分别为稀释10、50、100、200、1000、2000、10000倍单条腐烂茎线虫的DNA。
图7本发明腐烂茎线虫LAMP检测多种线虫混合样品结果。其中A为电泳检测结果，B为SYBR Green I染色反应结果。1为空白对照，2为腐烂茎线虫、鳞球茎线虫和玉米短体线虫混合样品；3为腐烂茎线虫、水稻干尖线虫和香蕉穿孔线虫混合样品；4为腐烂茎线虫、水稻潜根线虫和拟禾本科根结线虫混合样品；5为腐烂茎线虫、鳞球茎线虫、玉米短体线虫和水稻干尖线虫混合样品；6为腐烂茎线虫、香蕉穿孔线虫、水稻潜根线虫和拟禾本科根结线虫混合样品；7为腐烂茎线虫、玉米短体线虫、水稻干尖线虫、水稻潜根线虫和拟禾本科根结线虫混合样品。8为阴性对照：鳞球茎线虫、玉米短体线虫、水稻干尖线虫、香蕉穿孔线虫、水稻潜根线虫和拟禾本科根结线虫混合样品。
图8 本发明腐烂茎线虫LAMP检测甘薯薯块混合样品结果。其中A为电泳检测结果，B为SYBR Green I染色反应结果。1为空白对照，2为甘薯薯块混合样品，3为无腐烂茎线虫的甘薯薯块组织。
图9本发明腐烂茎线虫LAMP检测土壤混合样品结果。其中A为电泳检测结果，B为SYBR Green I染色反应结果。1为空白对照，2为土壤混合样品，3为无腐烂茎线虫的土壤样品。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 腐烂茎线虫LAMP体系的建立及优化
1、LAMP引物设计
（1）根据对腐烂茎线虫核糖体DNA-28S区域的测序结果，从NCBI GenBank数据库中下载多条相似的其他线虫核糖体DNA-28S基因序列，对序列进行多重比对分析，寻找28S序列片段中的特异序列片段，并选择合适的特异性序列区域设计LAMP引物组，然后进行合成。经过初步的特异性和灵敏性实验筛选得到一组最佳的引物组进行进一步验证试验。
该组引物包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF，序列如下：
一对外引物F3/B3：
SEQ ID NO.1（引物F3）：5’-GGCGCAATGAAAGTAAAGGC-3’
SEQ ID NO.2（引物B3）：5’-AGAACCGCTCCGGACTTC-3’
一对内引物FIP/BIP：
SEQ ID NO.3（引物FIP）：
5’-CACTGCAAGCAGTCGGGACG-CGAGCTTATATGCGACCTCG-3’
SEQ ID NO.4（引物BIP）：
5’-GCGGAGGAAGAGCATACTCGC-AGAGTTTCCTCTGGCTTCGT-3’
一条环引物LF：
SEQ ID NO.5（引物LF）：5’-AGATGGTGAACTATGCCTGAGC-3’
（2）同时根据现有的腐烂茎线虫rDNA-ITS区也设计了多组LAMP检测引物，经过初步的特异性和灵敏性实验筛选得到一组最佳的引物组进行进一步验证试验。
该组引物包括一对外引物F31/B31、一对内引物FIP1/BIP1，序列如下：
F31：5’-CCCCAAGCTAATGGTGGTG-3’
B31： 5’-AGCGGGTAATCACGTCAGAT-3’
FIP1：5’-TGTCAACATTGGCCAAGAGGCTC-GGACCGCTGTCTCTTT-3’
BIP1：5’-AACGCTGTCCAGTGTTTGGTGA-CTCTGCGTTTGGCTTCAAAG-3’
2、LAMP反应液组成及其检测验证
(1) 单条线虫DNA提取
在尼康倒置显微镜下随机挑取1条供试线虫，在单凹玻片上用无菌水洗涤一次，然后将单条腐烂茎线虫放入装有 10 μL裂解液（20 mg/mL 蛋白酶K:10 × PCR Buffer:超纯水=1: 1: 8.9）的PCR管壁上，再用经过酒精灯消毒的1号昆虫针将其刺破，将裂解液甩入管底，然后置于PCR仪上57 ℃加热处理45 min，85 ℃加热处理5 min，放置4 ℃，得到DNA 粗提取液可直接用于LAMP扩增，或放入超低温冰箱保存备用。
(2) LAMP反应液成分和条件的优化
为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可信度，分别对25μL反应体系中的Bst2.0聚合酶（8U/μL）（加入0.1-1μL）、Mg2+（100mM/μL）（加入0.4-2.2μL）、dNTPs（10mM/μL）（加入0.5-4.5μL）进行了优化，根据琼脂糖凝胶电泳条带的丰度，确定最佳反应液如下：
10×Isothermal Amplification Buffer 2.5 μL
F3/B3(5 μM) 1 μL
FIP/BIP(5 μM) 7 μL
LF(10 μM) 1 μL
dNTPs (10 mmol/L) 2 μL
MgSO4 (100 mmol/L) 1.5 μL
Bst DNA聚合酶 2.0warmstart(8U/μl) 0.2 μL
模板 DNA 1 μL
ddH2O 补足 25 μL。
(3) 检测结果
为保证该检测方法的高效性，对反应参数中的温度及时间进行了优化，在反应温度和时间分别为61-68℃和10-80min的条件下进行LAMP扩增，使用2%琼脂糖凝胶在5~10V/cm电压下30min检测LAMP扩增产物，结果显示其中在65℃（图1）和50min（图2）时梯状条带丰度较大，因此得出最佳反应温度和时间分别为65℃和50min。
3、同样地，用相同的体系和方法，以ITS区的引物组进行检测，结果显示，也能成功检测出目标DNA。
实施例2 腐烂茎线虫LAMP引物特异性和稳定性检测
1、样品制备
以实验室保存的腐烂茎线虫为测试的靶线虫，以实验室保存的鳞球茎线虫、拟禾本科根结线虫、香蕉穿孔线虫、菊花叶枯线虫、滑刃新种、玉米短体线虫、水稻干尖线虫、水稻潜根线虫、丝尾垫刃线虫和小杆线虫作为对照线虫，进行腐烂茎线虫LAMP引物的特异性的检测；用实验室保种的16个腐烂茎线虫种群（GZ1、SD1、SD2、HN1、BJ1、LN1、SX2、HB1、AH2、XJ1、TJ1、JS1、SX3、GD1、SX1、YG1）以及腐烂茎线虫单条（个）不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）的DNA来进行腐烂茎线虫LAMP引物稳定性的检测。
实验所需的供试线虫均采用实施例1的方法提取单条虫的DNA作为模板，并按照实施例1的反应体系和反应条件进行LAMP扩增，用电泳法检测法和荧光染料目测检测法检测结果，具体操作如下：
电泳检测法同实施例1。
荧光染料目测检测法：使用荧光染料为SYBR Green I。将10000 × SYBR Green I染料用二硝基亚砜稀释成100 × SYBR Green I。LAMP反应结束后，将2 μL SYBR Green I染料加入离心管扩增产物内，摇匀静止片刻，显现绿色荧光为阳性，显现橙色（与反应前颜色相同）为阴性。
2、检测结果
供试线虫的DNA用腐烂茎线虫LAMP特异性引物扩增后的产物分别进行电泳法和SYBR Green I染色目测法检测，结果显示（图3）：只有腐烂茎线虫的DNA样品出现特异条带（图3A），且加入SYBR Green I染料后颜色变为绿色荧光（图3B），9种对照线虫DNA样品未出现特异条带，加入SYBR Green I染料后也并未变色。因此本发明设计的腐烂茎线虫LAMP引物具有很好的特异性。
采用腐烂茎线虫特异LAMP引物对供试的16个腐烂茎线虫线虫种群的DNA 进行LAMP扩增后的产物分别经电泳法和荧光染料目测法检测，结果显示（图4）：16个腐烂茎线虫种群的DNA样品皆出现了阶梯状条带（图4A），SYBR Green I染料结果（图4B）与电泳图一致，16个腐烂茎线虫种群的DNA样品均变为绿色荧光，在种内表现出了很好的稳定性。
采用腐烂茎线虫特异LAMP引物对腐烂茎线虫单条（个）雌虫、雄虫、幼虫和卵的DNA进行LAMP扩增后的产物分别经电泳法和荧光染料染色目测法检测（图5），均分别出现梯状电泳条带（图5A）和荧光绿色（图5B），空白对照未出现特异条带和荧光绿色。因此本发明的腐烂茎线虫特异性LAMP引物和反应体系可以用来检测这腐烂茎线虫不同虫态的单条线虫。
3、同样地，用相同的体系和方法，以ITS区的引物组进行检测，结果显示，该组引物对腐烂茎线虫也有很好的特异性，也能检测不同虫态。
实施例3 腐烂茎线虫LAMP引物灵敏度检测
1、样品制备
采用实施例1的方法提取腐烂茎线虫的单条虫DNA作为模板，将单条虫的DNA按照10、50、100、200、1000、2000、10000倍稀释，按照实施例1的反应体系和反应条件进行LAMP扩增。用实施例1中的电泳检测法及实施例2中的荧光染料目测法检测LAMP扩增产物。
2、检测结果
以梯度稀释的腐烂茎线虫单条虫的DNA为模板进行LAMP扩增后的产物分别进行电泳和加入荧光染料，结果表明（图6）：腐烂茎线虫的单条虫DNA模板稀释1000倍后仍然可以扩增出清晰的电泳条带（图6A），加入SYBR Green I染料后则显现绿色SYBR Green I（图6B）。所以，本发明的腐烂茎线虫LAMP方法的灵敏度为单条虫DNA的10-3倍，即1/1000条线虫。
3、同样地，用相同的体系和方法，以ITS区的引物组进行检测，结果显示，该组引物对腐烂茎线虫的检测灵敏性也能达到1/1000条线虫。
实施例4 腐烂茎线虫混合样品的LAMP检测
1、混合样品的制备
包括腐烂茎线虫和多种对照线虫混合样品、腐烂茎线虫和植物组织（甘薯薯块组织）混合样品以及土壤和腐烂茎线虫混合样品的制备。
（1）腐烂茎线虫和多种对照线虫混合样品
将腐烂茎线虫和不同种类的对照线虫按以下方式混合（每种线虫一条虫）作为检测对象：
腐烂茎线虫、鳞球茎线虫和玉米短体线虫；
腐烂茎线虫、水稻干尖线虫和香蕉穿孔线虫；
腐烂茎线虫、水稻潜根线虫和拟禾本科根结线虫；
腐烂茎线虫、鳞球茎线虫、玉米短体线虫和水稻干尖线虫；
腐烂茎线虫、香蕉穿孔线虫、水稻潜根线虫和拟禾本科根结线虫；
腐烂茎线虫、玉米短体线虫、水稻干尖线虫、水稻潜根线虫和拟禾本科根结线虫。
阴性对照为鳞球茎线虫、玉米短体线虫、水稻干尖线虫、香蕉穿孔线虫、水稻潜根线虫和拟禾本科根结线虫。
（2）腐烂茎线虫和植物组织（甘薯薯块组织）混合样品制备
将30条腐烂茎线虫和20 mg甘薯薯块组织混合作为检测对象，阴性对照为不包含30条腐烂茎线虫的20 mg甘薯薯块组织。
（3）腐烂茎线虫和土壤混合样品的制备
将100条腐烂茎线虫和250 mg自然状态土壤混合作为检测样品，阴性对照为不包含100条腐烂茎线虫的250 mg自然状态土壤。
2、混合样品的DNA提取和LAMP扩增
（1）腐烂茎线虫和多种对照线虫混合样品的DNA提取按照实施例1的方法提取。
（2）腐烂茎线虫和植物组织（甘薯薯块组织）混合样品DNA提取采用Omega HPPlant DNA Kit试剂盒方法，具体操作方法如下：
Figure 759261DEST_PATH_IMAGE001
称取20 mg甘薯薯块组织，用剪刀剪碎，在体视显微镜下挑取30条腐烂茎线虫，一起放入离心管中，液氮速冻，用研磨棒研磨约2 min；
Figure 123246DEST_PATH_IMAGE002
离心管中加入500 μL Buffer CPL，加入10μL β-巯基乙醇，涡旋混匀后65 ℃水浴15 min，水浴期间颠倒混匀两次；
Figure 483820DEST_PATH_IMAGE003
加入500 μL氯仿和异丙醇混合液（24∶1），涡旋混匀，10000 rpm室温离心10min；
Figure 182524DEST_PATH_IMAGE004
取上清液300 μL于新的1.5 mL离心管中，加入10 μLRNAse酶；
Figure 552325DEST_PATH_IMAGE005
加入150 μL Buffer CXD和300 μL无水乙醇，混匀得到一均匀的混合液；
Figure 505238DEST_PATH_IMAGE006
将DNA样品纯化柱置于2 mL收集管中，将混合液转移到纯化柱，10000 rpm离心1min；
Figure 302292DEST_PATH_IMAGE007
弃滤液和收集管，将纯化柱放入新的收集管中，加650 μL SPW Wash Buffer，10000 rpm离心1 min；
Figure 724177DEST_PATH_IMAGE008
倒弃滤液，加入650 μL SPW Wash Buffer，10000 rpm离心1 min；
Figure 897670DEST_PATH_IMAGE009
倒弃滤液，10000 rpm空柱离心2 min，甩干柱子中残留的液体；
Figure 970668DEST_PATH_IMAGE010
把纯化柱置于新的1.5 mL离心管中，加30μL预热至55 ℃的无菌水至柱子的膜中央，静置2 min。10000 rpm离心1 min。得到混合样品DNA。
（3）腐烂茎线虫和土壤混合样品的DNA提取采用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒的方法，具体步骤如下：
Figure 938624DEST_PATH_IMAGE001
将250 mg土壤和100条腐烂茎线虫混合样品到一个PowerBead Tubes 中，轻轻涡旋混匀。
②加入 60 μL Solution C1（若出现沉淀，60℃水浴至全溶解），上下颠倒数次混匀，把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速（3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5~10min）涡旋连续振荡 10min（若使用24头适配器同时处理 12 个样品，涡旋时间延长 5-10min）。
Figure 349270DEST_PATH_IMAGE003
室温下10000 rpm离心30s，转移上清至一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中，加入250 μL Solution C2 到上清中，涡旋混匀5s。4℃孵育 5min。
Figure 60874DEST_PATH_IMAGE004
室温下10000 rpm离心1min，避开沉淀小珠，转移上清≤600 μL到一个新的收集管中加入200 μL Solution C3 到上清中，涡旋混匀。4℃孵育 5min。
Figure 926062DEST_PATH_IMAGE005
室温下10000 rpm离心1min避开沉淀小珠，转移上清≤750 μL到一个新的收集管中Solution C4 使用前先摇匀。加入1200 μL Solution C4到上清中，涡旋混匀5s。
Figure 127236DEST_PATH_IMAGE006
加入约675 μL上清到Spin Filter中，室温10000 rpm离心1 min。弃去滤液，继续加载675 μL上清，室温 10000 rpm离心1min。重复直至过滤完所有上清。
Figure 710664DEST_PATH_IMAGE007
加入500 μL Solution C5到Spin Filter中，室温10000 rpm离心30s，弃去上清。
Figure 773429DEST_PATH_IMAGE008
室温10000 rpm离心1min，小心转移Spin filter到2ml Collection Tube（试剂盒提供）中，尽量避免Solution C5污染。
Figure 758703DEST_PATH_IMAGE009
加入100 μL Solution C6 到白色滤膜中心室温10000 rpm离心30s。弃去SpinFilter。此时收集管中的 DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化，建议DNA 冷冻保存（-20℃~-80℃）。
最后，将所有提取好混合样品DNA按照实施例1的反应体系和反应条件进行LAMP扩增反应。
3、检测结果
用实施例1中的电泳检测法及实施例2中的荧光染料染色目测法对3种混合样品DNA的LAMP扩增产物进行检测，结果显示（图7、8和9）：含有腐烂茎线虫的混合线虫样品、甘薯薯块组织混合样品以及混合土壤样品均出现明显的特异条带（图7A、8A和9A），扩增产物SYBR Green I染色结果颜色变为绿色荧光（图7B、8B和9B）。
因此本发明设计的腐烂茎线虫LAMP引物组及检测方法可以直接检测鉴定多种线虫混合样品、植物组织样品以及土壤样品中的腐烂茎线虫，在腐烂茎线虫检测鉴定的实际应用中十分方便、快捷、高效，具有很好的应用前景，尤其适用于基层实验和检疫工作。
4、同样地，用相同的体系和方法，以ITS区的引物组进行检测，结果显示，该组引物对能够检测鉴定多种线虫混合样品，而对于植物组织样品以及土壤样品中的腐烂茎线虫，无法实现特异性检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物F3(Primer F3)
<400> 1
ggcgcaatga aagtaaaggc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物B3(Primer B3)
<400> 2
agaaccgctc cggacttc 18
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物FIP(Primer FIP)
<400> 3
cactgcaagc agtcgggacg cgagcttata tgcgacctcg 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 引物BIP(Primer BIP)
<400> 4
gcggaggaag agcatactcg cagagtttcc tctggcttcg t 41
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物LF(Primer LF)
<400> 5
agatggtgaa ctatgcctga gc 22

Claims (7)

1.一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组，其特征在于，包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF；序列依次如SEQ ID NO.1～5所示；
所述复杂样本为多种线虫混合的样品、植物组织样品或土壤样品。
2.一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP方法，其特征在于，以待测样品DNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物组进行LAMP扩增；根据扩增结果判断待测样品中是否含有腐烂茎线虫；
LAMP扩增的体系如下：
Figure FDA0002387759960000011
LAMP扩增的反应条件为：在65℃温育50min以上，85℃保温5min。
3.根据权利要求2所述的LAMP方法，其特征在于，所述根据扩增结果判断待测样品中是否含有腐烂茎线虫的具体方法为：利用电泳检测法或荧光染料目测检测法对LAMP扩增进行检测。
4.权利要求1所述LAMP引物组或权利要求2～3任一所述LAMP方法在检测和/或鉴定腐烂茎线虫中的应用。
5.权利要求1所述LAMP引物组或权利要求2～3任一所述LAMP方法在从复杂样品中检测和/或鉴定腐烂茎线虫中的应用，其特征在于，所述复杂样品包括混合线虫样品、植物组织样品和/或土壤样品。
6.一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述LAMP引物组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有SYBR Green I染料和LAMP扩增所需试剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110863058B (zh) * 2019-12-05 2021-04-16 河北省农林科学院植物保护研究所 用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的rpa引物及其应用
CN111057788B (zh) * 2020-02-21 2022-10-14 福建省农业科学院植物保护研究所 一种检测三七锈腐病菌的lamp引物组及检测方法
CN111206106B (zh) * 2020-03-05 2022-11-04 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心) 一种用于检测甘薯腐烂茎线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102260746A (zh) * 2011-08-10 2011-11-30 中国农业大学 基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及其应用
CN106520995A (zh) * 2016-12-13 2017-03-22 华南农业大学 一种快速检测鉴定菊花叶枯线虫的lamp引物组及其检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102260746A (zh) * 2011-08-10 2011-11-30 中国农业大学 基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及其应用
CN106520995A (zh) * 2016-12-13 2017-03-22 华南农业大学 一种快速检测鉴定菊花叶枯线虫的lamp引物组及其检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A fast and sensitive method for the simultaneous identification of three important nematode species of the genus Ditylenchus;Jeszke A等;《Pest Manaq Sci.》;20140508;第71卷(第2期);234-249 *

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