CN102260746A - 基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及其应用 - Google Patents
基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)的试剂盒及其应用。本发明提供了辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的专用引物，由序列表的序列1至14所示DNA组成。本发明提供的试剂盒含有所述专用引物。本发明设计特异性的引物并优化反应条件，提供了一种辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的试剂盒，应用该试剂盒可使检测达到种间和种下水平，解决常规分子检测成本高、效率低、速度慢，不能满足当前植物检疫和植物保护需要的难题。
Description
技术领域
本发明属于植物寄生线虫检测技术领域，具体涉及一种基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)的试剂盒及其应用。
背景技术
甘薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)，又称甘薯茎线虫或腐烂茎线虫，最早被发现于马铃薯上，导致马铃薯腐烂，因此也被称为马铃薯腐烂茎线虫(Potato rotnematode)。甘薯腐烂茎线虫是一种迁移性植物内寄生线虫，主要危害植物地下部，尤其是块茎和球茎等。甘薯腐烂茎线虫寄主范围非常广，已知的寄主有120多种，受害最重的是马铃薯、甘薯等块茎作物和一些球茎花卉。甘薯腐烂茎线虫是农业生产上重要的植物寄生线虫，也是我国和许多其他国家和地区的检疫性危险线虫。
我国是世界上甘薯的主产国，常年甘薯种植面积在600万hm2左右，占世界总面积的70％左右。甘薯我国许多省区农业产业结构调整中的优势作物，正逐步向效益型经济作物转变。目前，甘薯茎线虫病已成为制约我国甘薯生产的三大严重病害之一，近年来业已上升为北方薯区最严重的病害，一般发病田块减产20％-50％，重病田块基本上绝产无收。如何控制腐烂茎线虫的危害，提高甘薯种植效益，成为当前亟待解决的问题。
对甘薯腐烂茎线虫的快速检测技术是防治此病的重要方法。有效的预防和控制甘薯茎线虫病的传播和蔓延对于确保我国农业生态环境的安全，保证我国农产品出口符合进口国植物检疫要求，以及保证进境种苗和农产品的安全，有效抵御外来有害生物入侵都有着重要的作用。
近年来一些依据形态学特征所进行的多歧分类和数值分类法提高了对某些线虫类群鉴定的准确性。但是由于线虫许多表型特征的保守性，再加上寄主及环境条件的差异，因此线虫在种内也存在着一定的变异范围，而且有的线虫种间的形态测量值又存在重叠的现象，因此以传统的形态学和鉴别寄主反应为基础的分类法不仅主观、繁琐，而且难以可靠地分析和鉴别近似种间、种内生理小种或致病型间存在的差异。而且鉴定所需时间很长，甚至还要经过作物的一个生长季节才能得出结果，这对于现时的经济模式，尤其是检验检疫来说是难以接受的。
有鉴于此，近年来，植物线虫学家尝试发展了甘薯茎线虫的分子检测技术。如利用PCR-RFLPs技术对茎线虫属里三个重要的相似种腐烂茎线虫(Ditylenchusdestructor)、食菌茎线虫(D.myceliophagus)和鳞球茎线虫(D.dipsaci)7个不同寄主族进行了区分(Karen，1993)。如利用ITS-PCR区分甘薯腐烂茎线虫的A型和B型群体。这些方法和传统手段相比，更为迅速可靠，没有季节、虫态和数量的限制。然而，以常规PCR为基础的分子检测，需要相对高质量的线虫DNA模板，扩增和检测需要多个仪器设备，且整个过程需要数个小时，对于需要快速通关的植物检疫部门和条件简陋的基层农技部门来说，这些分子检测方法的实用性受到限制。因此，需要开发新型的、快速、简便、可靠且低成本的甘薯腐烂茎线虫检测手段。
已发现我国危害甘薯的马铃薯腐烂摹线虫rDNA-ITS基因片段长度存在A型(900bp)和B型(1100bp)2个类型，A型腐烂茎线虫群体的ITS片段比B型群体少200bp。这两种类群的划分，通过对28S rDNA-D2/D3区系统分析得到了证实(于海英，彭德良，胡先奇，黄文坤马铃薯腐烂茎线虫28S rD NA-D2/D3区序列分析。植物病理学报，2009，39(3)：254-261)。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)技术是日本荣研公司开发的一种新的恒温核酸扩增技术，利用能识别靶序列上6个位点的4个特殊设计的引物和一种具有链置换功能的DNA聚合酶，在60-65℃恒温条件下，对核酸进行等温扩增，且在1小时内扩增效率可达到109-1010个数量级。扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。和常规扩增方法相比，该技术主要优点体现在如下几个方面：1)该方法仅需水浴或金属浴等恒温装置，以提供实现核酸扩增的条件，不需要热循环仪；2)特异性高，采用4/6条特异引物识别目的基因上的6/8个区域；3)扩增速度快，效率高，1小时内扩增效率达到109-1010个数量级，可在30-60分钟内获得结果；4)结果判定简单，扩增产生大量产物和焦磷酸镁沉淀，无需电泳，结果可经肉眼直接判断，结合使用荧光染料或试纸条，检测结果更为灵敏可靠，结合专门开发的浊度仪，可实时观测扩增进程，可使检测时间缩短至15分钟。目前已经应用于食品安全、环境微生物、农业病害及医学诊断等领域。
目前尚未见采用环介导等温扩增方法检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫(Ditylenchusdestructor)的试剂盒及其应用。
本发明提供了辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的专用引物，由三组引物组成；第一组引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；第二组引物由序列表的序列5所示DNA、序列表的序列6所示DNA、序列表的序列7所示DNA、序列表的序列8所示DNA、序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA组成；第三组引物由序列表的序列11所示DNA、序列表的序列12所示DNA、序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA组成。
所述专用引物可用于制备试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫和/或检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫。
本发明还保护一种含有所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫和/或检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫。所述试剂盒还可含有Bst DNA聚合酶。所述试剂盒还可含有5倍LAMP反应液和/或样品预处理液。所述5倍LAMP反应液具体可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述5倍LAMP反应液中的浓度如下：5mM dNTP、100mM Tris-盐酸(pH8.8)、50mM氯化钾、50mM硫酸铵、20mM硫酸镁、10mM氯化镁、0.5mM氯化锰、25μM钙黄绿素、0.5％(体积比)曲拉通X-100和2M甜菜碱。所述样品预处理液具体可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、10mM Tris(pH8.2)、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20和0.01％(g/100mL)明胶。
所述试剂盒还可包括阳性对照质粒丙和/或阳性对照质粒甲和/或阳性对照质粒乙。所述阳性对照质粒丙具体可为将序列表的序列17所示的DNA插入PGEM-T easy质粒的NcoI和NotI酶切位点之间得到的重组质粒。所述阳性对照质粒甲具体可为将序列表的序列15所示的DNA插入PGEM-T easy质粒的NcoI和NotI酶切位点之间得到的重组质粒。所述阳性对照质粒乙具体可为将序列表的序列16所示的DNA插入PGEM-T easy质粒的NcoI和NotI酶切位点之间得到的重组质粒。
所述专用引物可用于辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫。
所述专用引物可用于检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫。
本发明还保护一种辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的方法，是分别用所述专用引物中的三组引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：
(1)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫；
(2)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫；
(3)采用所述第一组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫。
所述待测线虫具体可为象耳豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、A型甘薯腐烂茎线虫或B型甘薯腐烂茎线虫。
本发明还保护一种辅助鉴定待测植物样本中是否感染甘薯腐烂茎线虫的方法，是分别用所述专用引物中的三组引物对待测植物样本的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：
(1)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫；
(2)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫；
(3)采用所述第一组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫。
以上任一所述的方法中，所述环介导等温扩增的反应体系具体可为：所述基因组DNA 5μl，引物母液1μl，所述5倍LAMP反应液5μl，所述Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水13μl。所述引物母液为DdU-LAMP引物母液、DdA-LAMP引物母液或DdB-LAMP引物母液。所述DdU-LAMP引物母液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：DdU-F3 5μM、DdU-B3 5μM、DdU-FIP 40μM和DdU-BIP40μM。所述DdA-LAMP引物母液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：DdA-F3 5μM、DdA-B3 5μM、DdA-FIP 40μM、DdA-BIP 40μM、DdA-LP 20μM和DdA-BP 20μM。所述DdB-LAMP引物母液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：DdB-F3 5μM、DdB-B3 5μM、DdB-FIP 40μM和DdB-BIP 40μM。
以上任一所述的方法中，所述环介导等温扩增的条件具体可为：63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。
本发明与现有技术相比，优点如下：
(1)操作简单
LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要水浴锅或金属模块即可，产物检测用肉眼观察、琼脂糖凝胶电泳或浊度仪检测即可判断，不需要特殊的试剂及仪器。
(2)快速高效
因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。样品检测全程可在1.5小时内均可完成，本发明添加了环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30分钟均可检测到扩增产物，且产物可以扩增至109倍，达0.5mg/ml。应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。
(3)高特异性
由于本发明是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，引物的延伸端有着高度的序列选择性，与其他近缘线虫相应序列不匹配，不能进行核酸扩增。故其特异性极高。
(4)高灵敏度
扩增模板可达fg级，比PCR高出数量级的差异，加上本发明针对基因组中存在多拷贝的rDNA-ITS区，扩增灵敏度进一步提高。
(5)假阳性率低
LAMP反应常用的SYBR Green在有DNA双链存在的条件下即可染色，无法证明实验结果为LAMP扩增，本发明使用钙黄绿素取代SYBR Green荧光剂成分，只有在发生LAMP反应的前提下才会产生颜色变化，阳性率更高，且无需反应后加入，减少了检测操作环节。
(6)适用性强，成本低、技术依赖性小
本试剂盒可采用不同方法进行结果判读，各使用单位可以根据自身条件，灵活选择一种或结合使用，特别适合基层农技人员使用。
本发明设计特异性的引物并优化反应条件，提供了一种辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的试剂盒，应用该试剂盒可使检测达到种间和种下水平，解决常规分子检测成本高、效率低、速度慢，不能满足当前植物检疫和植物保护需要的难题。
附图说明
图1为实施例2的步骤二的反应液颜色观察图片。
图2为实施例2的步骤三的反应液颜色观察图片。
图3为实施例2的步骤四的琼脂糖凝胶电泳图。
图4为实施例3的琼脂糖凝胶电泳图；A：采用DdU-F3、DdU-B3、DdU-FIP和DdU-BIP组成的引物组合物；B：采用DdA-F3、DdA-B3、DdA-FIP、DdA-BIP、DdA-LP和DdA-BP组成的引物组合物；C：采用DdB-F3、DdB-B3、DdB-FIP和DdB-BIP组成的引物组合物。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实验样本为如下7种根结线虫：
象耳豆根结线虫(M.enterolobii，简称Me)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Tiganoa M，de Siqueiraa K，Castagnone-Serenob P，Muletb K，QueirozaP，dos Santosa M，Teixeiraa C，Almeidaa M，Silvaa J，Carneiroa R.Geneticdiversity of the root-knot nematode Meloidogyne enterolobii and developmentof a SCAR marker for this guava-damaging species.Plant Pathology，2010，59(6)：1054-1061。
南方根结线虫(Meloidogyne incognita，简称Mi)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Zijlstra C，Donkers-Venne DTHM，Fargette M，2000.Identificationof Meloidogyne incognita.M.javanica and M.arenaria using sequencecharacterised amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology 2，847-53.。
爪哇根结线虫(M.javanica简称Mj)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Zijlstra C，Donkers-Venne DTHM，Fargette M，2000.Identification ofMeloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria using sequencecharacterised amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology 2，847-53.。
花生根结线虫(M.arenaria，简称Ma)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Zijlstra C，Donkers-Venne DTHM，Fargette M，2000.Identification ofMeloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria using sequencecharacterised amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology 2，847-53.。
北方根结线虫(M.hapla，简称Mh)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：Zijlstra C，2000.Identification of Meloidogyne chitwoodi，M.fallax and M.hapla based on SCAR-PCR a powerful way of enabling reliable identification ofpopulations or individuals that share common traits.European Journal of PlantPathology 106，283-90.。
A型甘薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)和B型甘薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：黄健等，2009.腐烂茎线虫种内不同群体形态及遗传分析.39(2)：125-131.。
实施例1、试剂盒的组成
一、试剂盒各组分的制备
1、引物的制备
根据甘薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区，存在种间多态性的区段，设计特异性寡核苷酸引物。合成3组引物，第一组引物由通用外侧引物(DdU-F3和DdU-B3)和通用内侧引物(DdU-FIP和DdU-BIP)组成，第二组引物由A型甘薯茎线虫特异外侧引物(DdA-F3和DdA-B3)、A型甘薯茎线虫特异内侧引物(DdA-FIP和DdA-BIP)和A型甘薯茎线虫特异环引物(DdA-LP和DdA-BP)组成，第三组引物由B型甘薯茎线虫特异外侧引物(DdB-F3和DdB-B3)和B型甘薯茎线虫特异内侧引物(DdB-FIP和DdB-BIP)组成。
DdU-F3：5’-AGTTGTATGCTTCTTTGTCC-3’(序列表的序列1)；
DdU-B3：5’-CGTTCTTCATCGATCTACGAG-3’(序列表的序列2)；
DdU-FIP：5’-CAGTGCTCATTAACTCTCGCGGTGGCTGTGATGAAGGAA-3’(序列表的序列3)；
DdU-BIP：5’-CGCCAACACAAAACCCCAGTGATCCACCGATAAGACTAA-3’(序列表的序列4)；
DdA-F3：5’-CGGGTTGCTTTTTGGTGAGA-3’(序列表的序列5)；
DdA-B3：5’-AACAAAGCCGTTTTTCGCC-3’(序列表的序列6)；
DdA-FIP：5’-CGTTAATGATCCGGCAGCAGGTCTTGAACCGGGCAAAAGTCG-3’(序列表的序列7)；
DdA-BIP：5’-TCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTAATTAGCCAGGCACAGAGC-3’(序列表的序列8)；
DdA-LP：5’-TCACCTACAGCCACCTTGTT-3’(序列表的序列9)；
DdA-BP：5’-ATGCAGGCACAGGGTAGT-3’(序列表的序列10)；
DdB-F3：5’-TCTCTTTGGCCTAGCACGT-3’(序列表的序列11)；
DdB-B3：5’-TCAGGTCGAAAAATCGACTG-3’(序列表的序列12)；
DdB-FIP：5’-TTCTCGAGTGAGAGCGATGTCTGCAGCCTCTTGGCCAATG-3’(序列表的序列13)；
DdB-BIP：5’-CGCTGTCCAGTGTTTGGTGACTTCAAAGCCTTACGTCCATAG-3’(序列表的序列14)。
第一组引物的25倍母液(DdU-LAMP引物母液)由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：DdU-F3 5μM、DdU-B3 5μM、DdU-FIP 40μM和DdU-BIP 40μM。
第二组引物的25倍母液(DdA-LAMP引物母液)由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：DdA-F3 5μM、DdA-B3 5μM、DdA-FIP 40μM、DdA-BIP 40μM、DdA-LP 20μM和DdA-BP 20μM。
第三组引物的25倍母液(DdB-LAMP引物母液)由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：DdB-F3 5μM、DdB-B3 5μM、DdB-FIP 40μM和DdB-BIP 40μM。
2、5倍LAMP反应液的制备
5倍LAMP反应液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述5倍LAMP反应液中的浓度如下：5mM dNTP、100mM Tris-盐酸(pH8.8)、50mM氯化钾、50mM硫酸铵、20mM硫酸镁、10mM氯化镁、0.5mM氯化锰、25μM钙黄绿素、0.5％(体积比)曲拉通X-100和2M甜菜碱。
3、样品预处理液的制备
样品预处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、10mM Tris(pH8.2)、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20和0.01％(g/100mL)明胶。
4、阳性对照液的制备
将序列表的序列15所示的DNA插入PGEM-T easy质粒(Progema，Cat#：A1360)的NcoI和NotI酶切位点之间，得到阳性对照质粒甲。将阳性对照质粒甲用ddH2O稀释至10ng/μl，得到阳性对照液甲。
将序列表的序列16所示的DNA插入PGEM-T easy质粒(Progema，Cat#：A1360)的NcoI和NotI酶切位点之间，得到阳性对照质粒乙。将阳性对照质粒乙用ddH2O稀释至10ng/μl，得到阳性对照液乙。
将序列表的序列17所示的DNA插入PGEM-T easy质粒(Progema，Cat#：A1360)的NcoI和NotI酶切位点之间，得到阳性对照质粒丙。将阳性对照质粒丙用ddH2O稀释至10ng/μl，得到阳性对照液丙。
二、试剂盒的组成
试剂盒由步骤一制备的DdU-LAMP引物母液、DdA-LAMP引物母液、DdB-LAMP引物母液、5倍LAMP反应液、Bst DNA聚合酶(活性单位为8U/μl)、样品预处理液、阳性对照液甲、阳性对照液乙和阳性对照液丙组成。各组分均单独包装。
三、试剂盒使用方法
应用步骤二的试剂盒时，采用如下步骤对待测样本进行检测：
1、提取样本的基因组DNA
当待测样本为单个卵、幼虫或成虫时，采用如下方法提取基因组DNA：加20μl样品预处理液于盖玻片上，挑取待测样本于样品预处理液中，挤压盖玻片使虫体破裂，得到体液混合物；转移10μl体液混合物于预先装有10μl灭菌水的1.5ml离心管中，液氮中速冻至少1分钟，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min，12000rpm离心5分钟，取1-5μl上清用作反应模板(基因组DNA)。
当待测样本为疑似被线虫感染的薯块时，采用如下方法提取基因组DNA：取待测样本，在疑似感染部位切取数个薄片，浸没于无菌水中约20分钟；离心收集无菌水中的线虫于1.5ml离心管中，液氮中速冻至少1分钟，用锥子或尖头玻璃棒等锐器迅速研磨，加入50μl样品预处理液成匀浆，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min，12000rpm离心5分钟，取5μl上清用作反应模板(基因组DNA)。
2、配制反应体系
在200μl PCR管中配制LAMP反应体系(25μl)，见表1。
表1 LAMP反应体系
3、LAMP扩增
61-65℃水浴40-60分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。
4、结果判定
结果判定可采取如下方法之一或结合使用：
(1)反应结束后，肉眼直接观察反应液，绿色为阳性，橙色为阴性。
(2)10,000×g室温离心5分钟，管底出现白色沉淀(焦磷酸镁)为阳性，无白色沉淀为阴性。
(3)取3-5μl扩增产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，出现阶梯状条带的为阳性，无阶梯状条带的为阴性。
四、试剂盒的工作原理
1、通过反应液颜色进行结果判读。反应体系中钙黄绿素是一种离子螯合剂，最初与体系中Mn2+离子结合，保持荧光淬灭状态。如果待测样本中具有DNA靶序列，随着反应体系的扩增，产生大量的焦磷酸镁沉淀，而焦磷酸根离子竞争去螯合的Mn2+离子，使钙黄绿素成为游离状态而显现绿色。如果待测样本中不具有DNA靶序列，体系中缺少焦磷酸根离子，钙黄绿素仍与Mn2+离子结合，显现橙黄色。
2、通过观察白色沉淀进行结果判读。如果待测样本中具有DNA靶序列，在环介导等温扩增中，被不断添加入新合成的核苷酸链，同时大量脱下焦磷酸镁副产物，焦磷酸镁是一种白色沉淀物，在60-65℃的扩增温度条件下难溶解，因此伴随产物的大量扩增而积累，反应结束后，可以直接观察到白色沉淀。如果待测样本中不具有DNA靶序列，则反应体系中缺少焦磷酸镁副产物，不能观察到白色沉淀。应用本方法判读时，反应体系中可以不加入钙黄绿素。
3、通过琼脂糖凝胶电泳检测进行结果判读。环介导等温扩增利用特异引物依靠高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段：内部引物FIP的3’末端和下游引物BIP的3’末端与模板结合延伸，外部引物F3与B3与模板结合并延伸，启动链置换合成置换出完整的FIP连接的互补单链，自我碱基配对形成环状结构，以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。第2阶段是扩增循环阶段：以茎环状结构为模板，内侧引物与茎环结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。周而复始。如果待测样本中具有DNA靶序列，扩增产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，呈现梯状电泳条带。如果待测样本中不具有DNA靶序列，则不能得到扩增产物，无梯状电泳条带显示。应用本方法判读时，反应体系中可以不加入钙黄绿素。
实施例2、试剂盒的应用
一、提取基因组DNA
将7种线虫实验样本分别按如下方法提取单个线虫的基因组DNA：
1、加20μl样品预处理液于盖玻片上，挑取单条线虫于样品预处理液中，挤压盖玻片使虫体破裂，得到体液混合物；吸取10μl体液混合物，转移到预先装有10μl灭菌水的1.5ml离心管中。
2、液氮中速冻1分钟，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min。
3、12000rpm离心5分钟，取5μl上清用作反应模板(基因组DNA)。
二、鉴定待测样本是否为甘薯腐烂茎线虫
将7种线虫提取的基因组DNA分别进行LAMP反应。
在200μl PCR管中配制如下反应体系甲(25μl)：基因组DNA 5μl，DdU-LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水13μl。用等体积的阳性对照液丙作为基因组DNA的阳性对照，用等体积的双蒸水作为基因组DNA的阴性对照。63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。
结果见图1。图1中，1为阳性对照液丙、2为A型甘薯腐烂茎线虫样本，3为阳性对照液丙，4为B型甘薯腐烂茎线虫样本，5为阴性对照，6为南方根结线虫，7为爪哇根结线虫，8为花生根结线虫，9为北方根结线虫，10为象耳豆根结线虫。图1中，1-4号管均显示为绿色为阳性结果，5-10号管均显示为橙色为阴性结果。结果表明，阳性对照液丙、A型甘薯腐烂茎线虫和B型甘薯腐烂茎线虫的PCR管均显示为绿色。阴性对照、象耳豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫均显示为橙色。
三、鉴定待测样本为哪种甘薯腐烂茎线虫
分别将A型甘薯腐烂茎线虫和B型甘薯腐烂茎线虫提取的基因组DNA进行如下三种体系的LAMP反应。
在200μl PCR管中配制如下反应体系甲(25μl)：基因组DNA 5μl，DdU-LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水13μl。用等体积的阳性对照液丙作为基因组DNA的阳性对照。
在200μl PCR管中配制如下反应体系乙(25μl)：基因组DNA 5μl，DdA-LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水13μl。用等体积的阳性对照液甲作为基因组DNA的阳性对照。
在200μl PCR管中配制如下反应体系丙(25μl)：基因组DNA 5μl，DdB-LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水13μl。用等体积的阳性对照液乙作为基因组DNA的阳性对照。
反应体系甲、反应体系乙和反应体系丙的反应条件均为：63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。
阳性对照液丙、阳性对照液甲和阳性对照液乙均显示为绿色，为阳性结果。A型甘薯腐烂茎线虫和B型甘薯腐烂茎线虫的结果见图2，绿色表示结果为阳性，橙黄色为阴性。图2中，1、3、5为A型甘薯腐烂茎线虫，2、4、6为B型甘薯腐烂茎线虫；1和2为反应体系甲(采用DdU-LAMP引物母液)的检测结果，3和4为反应体系乙(采用DdA-LAMP引物母液)的检测结果，5和6为反应体系丙(采用DdB-LAMP引物母液)的检测结果。采用DdU-LAMP引物母液，A型甘薯腐烂茎线虫和B型甘薯腐烂茎线虫均电泳显示为绿色。采用DdA-LAMP引物母液，A型甘薯腐烂茎线虫显示为绿色，B型甘薯腐烂茎线虫显示为橙色。采用DdB-LAMP引物母液，B型甘薯腐烂茎线虫显示为绿色，A型甘薯腐烂茎线虫显示为橙色。
四、琼脂糖凝胶电泳
将步骤三的反应产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图3，有阶梯状条带出现为阳性结果，反之为阴性。图3中，M为分子量标准；1、3、5为A型甘薯腐烂茎线虫，2、4、6为B型甘薯腐烂茎线虫；1和2为反应体系甲(采用DdU-LAMP引物母液)的检测结果，3和4为反应体系乙(采用DdA-LAMP引物母液)的检测结果，5和6为反应体系丙(采用DdB-LAMP引物母液)的检测结果。采用DdU-LAMP引物母液，A型甘薯腐烂茎线虫和B型甘薯腐烂茎线虫均电泳显示阳性结果。采用DdA-LAMP引物母液，A型甘薯腐烂茎线虫显示阳性结果，B型甘薯腐烂茎线虫显示阴性结果。采用DdB-LAMP引物母液，B型甘薯腐烂茎线虫显示阳性结果，A型甘薯腐烂茎线虫显示阴性结果。
实施例3、试剂盒的灵敏度检测
一、少量提取基因组DNA
将A型甘薯腐烂茎线虫和B型甘薯腐烂茎线虫分别进行如下步骤：
1、收集新鲜分离的甘薯腐烂茎线虫，在1.5ml离心管中离心清洗后形成10-20μL线虫沉淀块。
2、用镊子将此管及尖头玻璃棒液氮中冷冻30s，用力研磨成粉末。
3、加入700μL DNA提取缓冲液(含50mM Tris-HCl、pH 7.5，50mmol/L NaCl，5mM EDTA，0.5％SDS)和7μL的20mg/mL蛋白酶K，轻轻混匀。
4、将管放入50℃水浴4-5h。
5、接着分别用等体积的Tris饱和酚和氯仿/异戊醇各抽提1次，12000rpm离心10min。
6、取上清入一新管，加入0.1倍体积的3M NaAc(pH5.2)水溶液和2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀20min。
7、12000rpm离心10min，弃上清。
8、风干沉淀，将DNA溶解于40μL ddH2O中，-20℃保存备用。
二、梯度稀释
将A型甘薯腐烂茎线虫的基因组DNA调整初始浓度为100ng/μl(溶液A1；稀释度为100)，然后进行10倍系列梯度稀释，依次为10ng/μl(溶液A2；稀释度为10-1)、1ng/μl(溶液A3；稀释度为10-2)、溶液100pg/μl(A4；稀释度为10-3)、10pg/μl(溶液A5；稀释度为10-4)、1pg/μl(溶液A6；稀释度为10-5)、100fg/μl(溶液A7；稀释度为10-6)、10fg/μl(溶液A8；稀释度为10-7)和1fg/μl(溶液A9；稀释度为10-8)。
将B型甘薯腐烂茎线虫的基因组DNA调整初始浓度为100ng/μl(溶液B1；稀释度为100)，然后进行10倍系列梯度稀释，依次为10ng/μl(溶液B2；稀释度为10-1)、1ng/μl(溶液B3；稀释度为10-2)、100pg/μl(溶液B4；稀释度为10-3)、10pg/μl(溶液B5；稀释度为10-4)、1pg/μl(溶液B6；稀释度为10-5)、100fg/μl(溶液B7；稀释度为10-6)、10fg/μl(溶液B8；稀释度为10-7)和溶液1fg/μl(溶液B9；稀释度为10-8)。
三、LAMP反应
在200μl PCR管中配制如下反应体系甲(25μl)：溶液(溶液A1至溶液A9和溶液B1至溶液B9中的任何一种)1μl，DdU-LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水17μl。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。
在200μl PCR管中配制如下反应体系乙(25μl)：溶液(溶液A1至溶液A9和溶液B1至溶液B9中的任何一种)1μl，DdA-LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水17μl。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。
在200μl PCR管中配制如下反应体系丙(25μl)：溶液(溶液A1至溶液A9和溶液B1至溶液B9中的任何一种)1μl，DdB-LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水17μl。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。
反应体系甲、反应体系乙和反应体系丙的反应条件均为：63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。
四、PCR反应
PCR扩增体系甲：溶液(溶液A1至溶液A9和溶液B1至溶液B9中的任何一种)1μl，10×Ex Taq buffer 2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，DdU-F3(10μM)0.5μl，DdU-R3(10μM)0.5μl，Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa Biotech Ltd.Cat#A1260)2μl(含2U)，16.5μl ddH2O。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。
PCR扩增体系乙：溶液(溶液A1至溶液A9和溶液B1至溶液B9中的任何一种)1μl，10×Ex Taq buffer 2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，DdA-F3(10μM)0.5μl，DdA-R3(10μM)0.5μl，Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa Biotech Ltd.Cat#A1260)2μl(含2U)，16.5μl ddH2O。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。
PCR扩增体系丙：溶液(溶液A1至溶液A9和溶液B1至溶液B9中的任何一种)1μl，10×Ex Taq buffer 2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，DdB-F3(10μM)0.5μl，DdB-R3(10μM)0.5μl，Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa Biotech Ltd.Cat#A1260)2μl(含2U)，16.5μl ddH2O。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。
PCR反应条件：95℃2min；95℃20s，60℃30s，扩增30循环；72℃，5min。
五、琼脂糖凝胶电泳
分别将步骤三和步骤四的各个反应产物(3μl)进行1.8％琼脂糖凝胶电泳。结果见图4。采用LAMP扩增：DdU-F3、DdU-B3、DdU-FIP和DdU-BIP组成的引物组合物的灵敏度为10fg；DdA-F3、DdA-B3、DdA-FIP、DdA-BIP、DdA-LP和DdA-BP组成的引物组合物的灵敏度为1fg；DdB-F3、DdB-B3、DdB-FIP和DdB-BIP组成的引物组合物的灵敏度为10fg。常规PCR扩增(引物DdU-F3/R3，DdA-F3/R3，DdB-F3/R3)在100ng-1pg范围内有清晰条带，结果为阳性。结果表明，采用本发明的试剂盒进行LAMP检测甘薯腐烂茎线虫，敏感度可达fg级，优于常规PCR。
Claims (10)
1.辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的专用引物，由三组引物组成；第一组引物由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成；第二组引物由序列表的序列5所示DNA、序列表的序列6所示DNA、序列表的序列7所示DNA、序列表的序列8所示DNA、序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA组成；第三组引物由序列表的序列11所示DNA、序列表的序列12所示DNA、序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA组成。
2.权利要求1所述专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫和/或检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫。
3.一种含有权利要求1所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫和/或检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有Bst DNA聚合酶。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有5倍LAMP反应液和/或样品预处理液；
所述5倍LAMP反应液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述5倍LAMP反应液中的浓度如下：5mM dNTP、pH8.8 100mM Tris-盐酸、50mM氯化钾、50mM硫酸铵、20mM硫酸镁、10mM氯化镁、0.5mM氯化锰、25μM钙黄绿素、0.5％(体积比)曲拉通X-100和2M甜菜碱；
所述样品预处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、pH8.2 10mM Tris、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20、0.01％明胶。
6.权利要求1所述专用引物在辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫中的应用。
7.权利要求1所述专用引物在检测待测样本是否含有甘薯腐烂茎线虫中的应用。
8.一种辅助鉴定甘薯腐烂茎线虫的方法，是分别用权利要求1所述专用引物中的三组引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：
(1)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫；
(2)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫；
(3)采用所述第一组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的A型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的B型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非B型甘薯腐烂茎线虫。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述待测线虫为象耳豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、A型甘薯腐烂茎线虫或B型甘薯腐烂茎线虫。
10.一种辅助鉴定待测植物样本中是否感染甘薯腐烂茎线虫的方法，是分别用权利要求1所述专用引物中的三组引物对待测植物样本的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：
(1)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫；
(2)采用所述第一组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫；
(3)采用所述第一组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有甘薯腐烂茎线虫；采用所述第二组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有A型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有A型甘薯腐烂茎线虫；采用所述第三组引物反应后，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测植物样本中疑似含有B型甘薯腐烂茎线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测植物样本中疑似不含有B型甘薯腐烂茎线虫。
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Granted publication date: 20130227 |
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