CN102321747B - 基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用。本发明提供了辅助鉴定南方根结线虫的专用引物，由序列表的序列1至5所示DNA组成。本发明提供的试剂盒含有所述专用引物。本发明设计特异性的引物并优化反应条件，提供了一种辅助鉴定南方根结线虫的试剂盒，应用该试剂盒可使检测达到种间水平，解决常规分子检测成本高、效率低、难以服务于基层农业生产的问题。

Description

基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用。

背景技术

南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是一种植物内寄生性的地下害虫，可危害3000多种植物，其危害约占全部根结线虫属的90％以上。准确鉴定根结线虫的种类，有助于监控其传播分布，研究其种群动态和遗传变异，并制定针对性的防治措施。

传统的根结线虫种的鉴定主要依靠接种鉴别寄主植物、形态显微观察等常规方法，以及差异蛋白及同功酶电泳为主的生化分析方法。近年来，基于核基因组、线粒体和核糖体DNA及其间隔区(Internal transcribed spacer，ITS)多态性的分子鉴定方法迅速发展，以Southern和点杂交为主的分子杂交技术，以PCR为基础的AFLP、PCR-RFLP、RAPD等技术以及特异性SCAR标记被分别应用于根结线虫多样性分析和种群鉴定，该类分子标记已部分应用于植物检疫和病害诊断中。但上述方法因为周期长、专业性强、成本高、灵敏度低等不同原因，难易直接服务于生产，尤其不能为基层植保工作者使用。因此，需要开发新型的实用型的根结线虫检测手段。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)技术是一种新的恒温核酸扩增技术，利用能识别靶序列上6个位点的4个特殊设计的引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下，该技术在1小时内扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个数量级，扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现出由不同大小区带组成的阶梯式图谱。该方法仅需恒温装置，且扩增产生大量产物和焦磷酸镁沉淀，结果可经肉眼直接判断，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点，已经应用于食品安全、环境微生物、农业病害及医学诊断等领域。

目前尚未见采用环介导等温扩增方法检测南方根结线虫的试剂盒及方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于环介导等温扩增检测南方根结线虫的试剂盒及其应用。

本发明提供的辅助鉴定南方根结线虫的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成。

所述专用引物可用于制备试剂盒中；所述试剂盒用于辅助鉴定南方根结线虫和/或检测待测样本是否含有南方根结线虫。

本发明还保护一种含有所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定南方根结线虫和/或检测待测样本是否含有南方根结线虫。所述试剂盒还可含有Bst DNA聚合酶。所述试剂盒还可含有10倍LAMP反应液和/或样品预处理液和/或荧光染料SYBRGreen I。所述10倍LAMP反应液具体可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述10倍LAMP反应液中的浓度如下：10mM dNTP、200mM Tris-盐酸(pH 8.8)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、40mM硫酸镁、1％(体积比)曲拉通X-100和4M甜菜碱。所述样品预处理液具体可由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、10mM Tris(pH8.2)、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20和0.01％(g/100mL)明胶。

所述试剂盒还可包括阳性对照质粒；所述性对照质粒为将序列表的序列6所示的DNA插入PGEM-T easy质粒的NcoI和NotI酶切位点之间得到的重组质粒。

所述专用引物可用于辅助鉴定南方根结线虫。

所述专用引物可用于检测待测样本是否含有南方根结线虫。

本发明还保护一种辅助鉴定南方根结线虫的方法，是用所述专用引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：

(1)加入SYBR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非南方根结线虫；

(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非南方根结线虫；

(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非南方根结线虫。

所述待测线虫具体可为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、大豆胞囊线虫、禾谷胞囊线虫、甘薯腐烂茎线虫、松材线虫、拟松材线虫或象耳豆跟结线虫。

本发明还保护一种辅助鉴定待测样本中是否感染南方根结线虫的方法，是用所述专用引物对待测样本的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下(1)和/或(2)和/或(3)：

(1)加入SYBR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测样本中疑似不含有南方根结线虫；

(2)如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测样本中疑似不含有南方根结线虫；

(3)如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测样本中疑似含有南方根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测样本中疑似不含有南方根结线虫。

以上任一所述的方法中，所述环介导等温扩增的反应体系具体可为：所述基因组DNA 5μl，LAMP引物母液1μl，10倍LAMP反应液2.5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水15.5μl。所述LAMP引物母液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：Mi-F3 10μM、Mi-B3 10μM、Mi-FIP 80μM、Mi-BIP 80μM和Mi-LP 40μM。

以上任一所述方法中，所述环介导等温扩增的条件具体可为：63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。

本发明与现有技术相比，优点如下：

(1)操作简单

LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，只需要水浴锅或金属模块即可，产物检测用肉眼观察、琼脂糖凝胶电泳或浊度仪检测即可判断，不需要特殊的试剂及仪器。

(2)快速高效

因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失。样品检测全程可在1.5小时内均可完成，本发明添加了环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30分钟均可检测到扩增产物，且产物可以扩增至10⁹倍，达0.5mg/ml。应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。

(3)高特异性

由于本发明是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物，引物的延伸端有着高度的序列选择性，与其他近缘线虫相应序列不匹配，不能进行核酸扩增。故其特异性极高。

(4)高灵敏度

扩增模板可达fg级，比PCR高出数量级的差异。

(5)适用性强，成本低、技术依赖性小

本试剂盒可采用不同方法进行结果判读，各使用单位可以根据自身条件，灵活选择一种或结合使用，特别适合基层农技人员使用。

本发明设计特异性的引物并优化反应条件，提供了一种辅助鉴定南方根结线虫的试剂盒，应用该试剂盒可使检测达到种间水平，解决常规分子检测成本高、效率低、难以服务于基层农业生产的问题。

附图说明

图1为电泳检测环介导的等温扩增结果。

图2为SYBR Green I染色后，分别在可见光与紫外光下观察结果(不同线虫)。

图3为SYBR Green I染色后，分别在可见光与紫外光下观察结果(南方根结线虫的不同地理种群)。

图4为实施例3的琼脂糖凝胶电泳图；A：LAMP反应产物；B：PCR反应产物。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实验样本见表1。

表1实验样本

实施例1、试剂盒的组成

一、试剂盒各组分的制备

1、引物的制备

根据南方根结线虫Minc08407基因存在种间多态性的区段，设计特异性寡核苷酸引物。合成1组专用引物，由外侧引物(Mi-F3和Mi-B3)、内侧引物(Mi-FIP和Mi-BIP)和环引物(Mi-LP)组成。

Mi-F3：5’-CTGCCCTTTGTACACACC-3’(序列表的序列1)；

Mi-B3：5’-GACACCAGCGACAGCCGTT-3’(序列表的序列2)；

Mi-FIP：5’-CTGCGATTAAATTGGTTTCCATCAACGGGACTGAGCCATTTCG-3’(序列表的序列3)；

Mi-BIP：5’-GCTTGAACCGGGCAAAAGTCCATAAAGTAATGATCCAGCAGC-3’(序列表的序列4)；

Mi-LP：5’-GTAACAAGGTAGCTGTAGGTGAAC-3’(序列表的序列5)。

专用引物的25倍母液(LAMP引物母液)由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在母液中的浓度如下：Mi-F3 10μM、Mi-B3 10μM、Mi-FIP 80μM、Mi-BIP80μM和Mi-LP 40μM。

2、10倍LAMP反应液的制备

10倍LAMP反应液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述10倍LAMP反应液中的浓度如下：10mM dNTP、200mM Tris-盐酸(pH 8.8)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、40mM硫酸镁、1％(体积比)曲拉通X-100和4M甜菜碱。

3、样品预处理液的制备

样品预处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、10mM Tris(pH8.2)、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45％(体积比)吐温20和0.01％(g/100mL)明胶。

4、阳性对照液的制备

将序列表的序列6所示的DNAPGEM-T easy质粒(Progema，Cat#：A1360)的NcoI和NotI酶切位点之间，得到阳性对照质粒。将阳性对照质粒用超纯水稀释至10ng/μl，得到阳性对照液。

二、试剂盒的组成

试剂盒由步骤一制备的LAMP引物母液、10倍LAMP反应液、Bst DNA聚合酶(活性单位为8U/μl)、样品预处理液、25×的荧光染料SYBR Green I(显色液)和阳性对照液组成。各组分均单独包装。

三、试剂盒使用方法

应用步骤二的试剂盒时，采用如下步骤对待测样本进行检测：

1、提取样本的基因组DNA

当待测样本为单个卵、幼虫或成虫时，采用如下方法提取基因组DNA：加20μl样品预处理液于盖玻片上，挑取待测样本于样品预处理液中，挤压盖玻片使虫体破裂，得到体液混合物；转移10μl体液混合物于预先装有10μl灭菌水的1.5ml离心管中，液氮中速冻至少1分钟，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min，12000rpm离心5分钟，取1-5μl上清用作反应模板(基因组DNA)。

当待测样本为疑似被根结线虫感染的单条根结时，采用如下方法提取基因组DNA：取待测样本，放入预先装有30μl灭菌水的1.5ml离心管中，用牙签、锥子或尖头玻璃棒等锐器迅速研磨成匀浆，液氮中速冻至少1分钟，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min，12000rpm离心5分钟，取5μl上清用作反应模板(基因组DNA)。

当待测样本为疑似含有根结线虫的土壤时，可采用PowerSoil^TM DNA isolated Kit试剂盒(需自行订购)按说明书进行基因组DNA的提取。

2、配制反应体系

在200μl PCR管中配制LAMP反应体系(25μl)，见表2。

表2 LAMP反应体系

组分	加样量
		DNA模板(100fg-1μg)	1-5μl
LAMP引物母液	1μl
		10倍LAMP反应液	2.5μl
Bst DNA聚合酶(8U/μl)	1μl
		双蒸水	19.5-15.5μl

3、LAMP扩增

60-65℃水浴40-60分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。

4、结果判定

结果判定可采取如下方法之一或结合使用：

(1)加入1μl 25×的荧光染料SYBR Green I，肉眼观察，绿色为阳性，橙色为阴性。

(2)10,000×g室温离心5分钟，管底出现白色沉淀(焦磷酸镁)为阳性，不出现白色沉淀为阴性。

(3)取3-5μl扩增产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，出现阶梯状条带的为阳性，不出现阶梯状条带的为阴性。

四、试剂盒的工作原理

1、通过反应液颜色进行结果判读。如果待测样本中具有DNA靶序列，随着反应体系的扩增产生大量核苷酸链，SYBR Green I能够嵌入链中产生绿色荧光。如果待测样本中不具有DNA靶序列，体系中不能产生大量核苷酸链，SYBR Green I分子只能处于游离状态，显现橙黄色。

2、通过观察白色沉淀进行结果判读。如果待测样本中具有DNA靶序列，在环介导等温扩增中，被不断添加入新合成的核苷酸链，同时大量脱下焦磷酸镁副产物，焦磷酸镁是一种白色沉淀物，在60-65℃的扩增温度条件下难溶解，因此伴随产物的大量扩增而积累，反应结束后，可以直接观察到白色沉淀。如果待测样本中不具有DNA靶序列，体系中缺少焦磷酸镁副产物，不能观察到白色沉淀。应用本方法判读时，反应体系中可以不加入SYBR Green I。

3、通过琼脂糖凝胶电泳检测进行结果判读。环介导等温扩增利用特异引物依靠高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。扩增分两个阶段。第1阶段为起始阶段：内部引物FIP的3’末端和下游引物BIP的3’末端与模板结合延伸，外部引物F3与B3与模板结合并延伸，启动链置换合成置换出完整的FIP连接的互补单链，自我碱基配对形成环状结构，以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。第2阶段是扩增循环阶段：以茎环状结构为模板，内侧引物与茎环结合，开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构，形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，启动新一轮扩增，且产物DNA长度增加一倍。周而复始。如果待测样本中具有DNA靶序列，扩增产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物，呈现梯状电泳条带。如果待测样本中不具有DNA靶序列，不能得到扩增产物，无梯状电泳条带显示。应用本方法判读时，反应体系中可以不加入SYBR Green I。

实施例2、试剂盒的应用

一、提取基因组DNA

将各个线虫实验样本分别按如下方法提取单个线虫的基因组DNA：

1、加20μl样品预处理液于盖玻片上，挑取单条线虫于样品预处理液中，挤压盖玻片使虫体破裂，得到体液混合物；吸取10μl体液混合物，转移到预先装有10μl灭菌水的1.5ml离心管中。

2、液氮中速冻1分钟，65℃水浴20分钟，95℃水浴5min。

3、12000rpm离心5分钟，取5μl上清用作反应模板(基因组DNA)

二、鉴定待测样本是否为南方根结线虫

1、反应体系和反应条件

将各个线虫提取的基因组DNA分别进行LAMP反应。

在200μl PCR管中配制如下反应体系(25μl)：基因组DNA 5μl，LAMP引物母液1μl，10倍LAMP反应液2.5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水15.5μl。用等体积的阳性对照液作为基因组DNA的阳性对照，用等体积的双蒸水作为基因DNA的阴性对照。63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。

2、结果判读

分别采用如下两种方法进行结果判读：

(1)取3μl反应产物进行1.8％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1，有阶梯状条带出现为阳性结果，反之为阴性。图1中，M为分子量标准，+为阳性对照，-为阴性对照，1-9为不同地理种群的南方根结线虫(依次记为Mi1至Mi9)，10-12为不同地理种群的爪哇根结线虫(依次记为Mj1至Mj3)，13-14为不同地理种群的花生根结线虫(依次记为Ma1和Ma2)，15-16为不同地理种群的北方根结线虫(依次记为Mh1和Mh2)，H.glycines为大豆胞囊线虫；H.avenae为禾谷胞囊线虫；D.destructor为甘薯腐烂茎线虫；B.xylophilus为松材线虫；B.mucronatus为拟松材线虫。

(2)在反应管中加入1μl 25×的荧光染料SYBR Green I，见图2和图3。

图2中，呈现绿色的为阳性，呈现橙色的为阴性。图2中，Mi代表南方根结线虫Mi1，Ma代表花生根结线虫Ma1，Mj代表爪哇根结线虫Mj1，Mh代表北方根结线虫Mh1，Me代表象耳豆跟结线虫Me1，ddH₂O为阴性对照。南方根结线虫显现绿色，表示结果为阳性。其它线虫和阴性对照显橙黄色为阴性结果。

图3中，显示荧光信号的为阳性，不显示荧光信号的为阴性。图3中，1至9代表不同地理种群的南方根结线虫(依次为Mi1至Mi9)，10为阳性对照，11为阴性对照。南方根结线虫的各个地理种群和阳性对照显示荧光信号，表示结果为阳性。阴性对照没有显示荧光信号为阴性结果。

实施例3、试剂盒的灵敏度检测

一、少量提取基因组DNA

1、收集新鲜孵化的2龄南方根结线虫(Mi1)幼虫，在1.5ml离心管中离心清洗后形成10-20μL线虫沉淀块。

2、用镊子将此管及尖头玻璃棒液氮中冷冻30s，用力研磨成粉末。

3、加入700μL DNA提取缓冲液(含50mM Tris-HCl、pH 7.5，50mmol/L NaCl，5mM EDTA，0.5％SDS)和7μL的20mg/mL蛋白酶K，轻轻混匀。

4、将管放入50℃水浴4-5h。

5、接着分别用等体积的Tris饱和酚和氯仿/异戊醇各抽提1次，12000rpm离心10min。

6、取上清入一新管，加入0.1倍体积的3M NaAc(pH5.2)水溶液和2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀20min。

7、12000rpm离心10min，弃上清。

8、风干沉淀，将DNA溶解于40μL ddH₂O中，-20℃保存备用。

二、梯度稀释

将南方根结线虫(Mi1)的基因组DNA调整初始浓度为100ng/μl(溶液1；稀释度为10⁰)，然后进行10倍系列梯度稀释，依次为10ng/μl(溶液2；稀释度为10^-1)、1ng/μl(溶液3；稀释度为10^-2)、100pg/μl(溶液4；稀释度为10^-3)、10pg/μl(溶液5；稀释度为10^-4)、1pg/μl(溶液6；稀释度为10^-5)、100fg/μl(溶液7；稀释度为10^-6)、10fg/μl(溶液8；稀释度为10^-7)和溶液9(1fg/μl；稀释度为10^-8)。

三、LAMP反应

在200μl PCR管中配制如下反应体系(25μl)：溶液(溶液1至溶液9中的任何一种)1μl，LAMP引物母液1μl，5倍LAMP反应液5μl，Bst DNA聚合酶(8U/μl)1μl，双蒸水17μl。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。

反应条件为：63℃水浴50分钟，然后80℃加热5分钟终止反应。

四、PCR反应

PCR扩增体系：溶液(溶液1至溶液9中的任何一种)1μl，10×Ex Taq buffer2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，Mi-F3(10μM)0.5μl，Mi-R3(10μM)0.5μl，Ex Taq DNA polymerase(TaKaRa Biotech Ltd.Cat#A1260)2μl(含2U)，16.5μlddH₂O。用等体积的双蒸水作为溶液的阴性对照(NC)。

PCR反应条件：95℃2min；95℃20s，60℃30s，扩增30循环；72℃，5min。

五、琼脂糖凝胶电泳

分别将步骤三和步骤四的各个反应产物(3μl)进行1.8％琼脂糖凝胶电泳。结果见图4。采用本发明的引物组合物进行LAMP检测南方根结线虫在100ng-1pg模板浓度范围内，有阶梯状条带出现，为阳性结果。采用PCR检测南方根结线虫在100ng-1pg范围内有清晰条带，结果为阳性。结果表明，采用本发明的引物组合物基于LAMP方法检测南方根结线虫，敏感度可达pg级，和常规PCR相当。

Claims (7)

1.辅助鉴定南方根结线虫的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA、序列表的序列4所示DNA和序列表的序列5所示DNA组成。

2.权利要求1所述专用引物在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒用于辅助鉴定南方根结线虫和/或检测待测样本是否含有南方根结线虫。

3.一种含有权利要求1所述专用引物的试剂盒；所述试剂盒用于辅助鉴定南方根结线虫和/或检测待测样本是否含有南方根结线虫；

所述试剂盒含有Bst DNA聚合酶；

所述试剂盒还含有10倍LAMP反应液和/或样品预处理液和/或荧光染料SYBRGreen I；

所述10倍LAMP反应液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述10倍LAMP反应液中的浓度如下：10mM dNTP、pH8.8200mM Tris-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、40mM硫酸镁、1%体积比的曲拉通X-100和4M甜菜碱；

所述样品预处理液由溶质和溶剂组成；所述溶剂为水；所述溶质及其在所述样品预处理液中的浓度如下：50mM氯化钾、pH8.210mM Tris、2.5mM氯化镁、60μg/mL蛋白酶K、0.45%体积比的吐温20和0.01%明胶。

4.权利要求1所述专用引物在辅助鉴定南方根结线虫中的应用。

5.权利要求1所述专用引物在检测待测样本是否含有南方根结线虫中的应用。

6.一种辅助鉴定南方根结线虫的方法，是用权利要求1所述专用引物对待测线虫的基因组DNA进行环介导等温扩增，然后进行如下（1）和/或（2）和/或（3）：

（1）加入SYBR Green I，如果环介导等温扩增体系显示为绿色，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系显示为橙色，待测线虫为候选的非南方根结线虫；

（2）如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果环介导等温扩增体系中没有生成白色沉淀，待测线虫为候选的非南方根结线虫；

（3）如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯状条带，待测线虫为候选的南方根结线虫，如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳不显示梯状条带，待测线虫为候选的非南方根结线虫。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述待测线虫为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、大豆胞囊线虫、禾谷胞囊线虫、甘薯腐烂茎线虫、松材线虫、拟松材线虫或象耳豆跟结线虫。

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