CN102766687B - 直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法，属于分子生物学检测技术领域。该直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物包括SEQIDNO:1~6所示核苷酸序列。本发明还公开了一种直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，具体是直接提取土壤中DNA，纯化后作为模板使用线虫的通用引物D2A和D3B进行第一轮PCR，再以该产物为模板，SEQIDNO:3~6所示引物进行第二轮PCR，通过PCR产物片段大小判定样品中是否含有根结线虫和肾形肾状线虫。本发明的引物灵敏、特异性强，检测方法可以大大节省检测时间且结果准确可靠，在根结线虫和肾形肾状线虫快速检测方面具有很高的实际应用价值。

Description

直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法

技术领域

本发明涉及利用分子生物学方法对植物有害线虫进行检测的技术领域，具体涉及直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法。

背景技术

根结线虫（Meloidogyne）是植物根系专性内寄生物，分布遍及世界大部分地区。因其适应性强、传播途径多样、可侵染多种植物，而成为世界性威胁农业生产的主要病原物，给农业生产者造成极大的经济损失。肾形肾状线虫（Rotylenchulus reniformis），作为肾状线虫属的模式种，对农业生产危害严重，主要发生在热带和亚热带地区，寄主范围广，在葫芦科（Cucurbitaceae）、茄科（Solanaceae）和豆科（Leguminosae）等各种蔬菜作物以及其它多种经济作物上侵染寄生。瓜类作物由于肾形肾状线虫侵染与寄生，引起根皮层组织坏死、根变褐，植株矮化、叶片发黄、变小，进而导致产量下降。根据我们2009-2011年对我国8个省市26个地区57份黄瓜根围土壤植物寄生线虫的调查鉴定，根结线虫和肾形肾状线虫检出率分别为59.6%和63.2%，为黄瓜根围主要植物寄生线虫。

土壤是植物寄生线虫主要生存场所。目前常规的线虫鉴定方法，无论是形态鉴定还是分子鉴定，都需要先将土壤中的线虫分离出来，费时费力。因此，探索直接从土壤中提取DNA方法，进而直接对根结线虫和肾形肾状线虫进行快速分子检测，对作物线虫病害的有效防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中不能从土壤中直接同时检测根结线虫和肾形肾状线虫的不足，提供一组能直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物。

本发明的另一目的是提供一种直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一组直接检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物，核苷酸序列如下：

D2A：SEQ ID NO:1（5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'）；

D3B：SEQ ID NO:2（5'-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3'）；

NF3：SEQ ID NO:3（5’- GTGAGGGAAAGTTGCAAAGCACT -3’）；

NR0：SEQ ID NO:4（5’- GTTCACCATCTTTCGGGTCTCAC -3’）；

MF0：SEQ ID NO:5（5’- GGGGATGTTTGAGGCAGATTTG -3’）；

和RF4：SEQ ID NO:6（5’- GGTCTGGCTCCCATGTTTTCCA -3’）。

一种直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，步骤如下：

（1）提取待测土壤DNA、纯化；

（2）巢式PCR扩增：进行两轮PCR扩增反应，第一轮以待测土壤DNA为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2（D2A和D3B）所示的线虫通用引物进行PCR扩增；第二轮以第一轮PCR产物为模板，SEQ ID NO:3～6所示的引物进行PCR扩增；

（3）结果分析：

① 第二轮PCR扩增产物含有617~624bp和424~431bp的序列，表明待测土壤中含有根结线虫（如果使用电泳检测，判断标准为在600bp和400bp左右出现扩增片段条带）；

② 第二轮PCR扩增产物含有644bp和265bp的序列，表明待测土壤中含有肾形肾状线虫（电泳检测标准为在600bp和250bp左右出现扩增片段条带）；

③ 第二轮PCR扩增产物含有617~644bp、424~431bp和265bp的序列，表明待测土壤中同时含有根结线虫和肾形肾状线虫（电泳检测标准为在600bp、400bp和250bp左右出现3条扩增片段）。

作为一种优选方案，上述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法中，步骤（3）结果分析中①第二轮PCR扩增产物含有617bp和424bp的序列时，表明待测土壤中含有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、纳西根结线虫和/或象耳豆根结线虫；扩增产物中含有620bp和427bp的序列时，表明待测土壤中含有北方根结线虫；扩增产物中含有624bp和431bp的序列时，表明待检测土壤中含有拟禾本科根结线虫和/或禾本科根结线虫。

作为一种优选方案，上述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法中，步骤（1）中提取待测土壤DNA使用的抽提缓冲液为：20mM EDTA（乙二胺四乙酸），1.5M NaCl，500mM Tris-HCl，10%的SDS（十二烷基硫酸钠）水溶液（质量体积比，w/v，如10g SDS加入到100mL水中混合制备），1% PVP（聚乙烯基吡咯烷酮）水溶液（质量体积比，w/v，如1g PVP加入到100mL水中混合制备）；其中Tris-HCl的pH值为8.0，本发明中简称为Buffer H。

作为一种优选方案，上述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法中，步骤（1）中的纯化是使用试剂盒PowerClean® DNA Clean-Up Kit（MoBio, Carlsbad, CA）。

作为一种优选方案，上述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，步骤（1）提取待测土壤DNA具体为：

①待检测土壤与预热的抽提缓冲液混匀；

②加入蛋白酶K，混匀后在65℃下消化1小时后震荡10min；

③12000g室温离心5min，取上清加入Tris-饱和苯酚，颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；

④将上清转入干净的离心管，加入氯仿体和异戊醇积比为24：1的混合液，颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；

⑤将上清转入干净的离心管，加入3M，pH 5.2的冰醋酸，加入量为上清体积的1/10，再加入上清体积2倍的冷无水乙醇，混匀后–20℃静置20min，4℃ 12,000g离心10min，弃尽上清；

⑥分别用体积百分含量为70%的乙醇和无水乙醇各洗沉淀一次，室温晾干；

⑦加灭菌双蒸水复溶，可得到粗提的土壤DNA。

作为一种优选方案，上述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，步骤（2）第一轮PCR的反应体系为：2×PCR buffer 12.5 µL，2mmol/L dNTPs 5 µL，10μmol/L 引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.5µL， KOD Fx（高效率PCR酶） 0.5 µL，DNA模板1.0 µL和余量的ddH₂O，共 25.0µL；

PCR扩增条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃后延伸5 min。

作为一种优选方案，上述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，步骤（2）第二轮PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5 µL，2.5mmol/L dNTPs 2 µL，10μmol/L SEQ ID NO:3所示引物 0.3µL，10μmol/L SEQ ID NO:4所示引物 1µL，10μmol/L SEQ ID NO:5 所示引物0.7µL，10μmol/L SEQ ID NO:6 所示引物0.5µL，rTaq 0.25µL，第一轮PCR产物1.0 µL和余量的ddH₂O，共 25.0µL；

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃后延伸5 min。

作为一种优选方案，上述的直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法中，PCR扩增产物可以直接用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带有无和大小进行结果判定。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一组直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物，该组引物灵敏、准确，能够特异地检测出土壤中的根结线虫和肾形肾状线虫。本发明还提供了一种直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，使用该方法操作人员无需先分离线虫后再提取线虫DNA（线虫核酸的提取时间约为2h），而直接提取包含线虫的土壤DNA即可，能够大大缩减样品检测时间。在提取土壤中DNA并进行纯化后，采用SEQ ID NO:1～6所示的引物进行巢式多重PCR，可以提高分子检测灵敏度且快速准确，在根结线虫和肾形肾状线虫快速检测方面具有很高的实际应用价值。

附图说明

图1. 引物NF3、NR0、MF0和RF4特异性检测巢式多重PCR结果，其中1为南方根结线虫，2为爪哇根结线虫，3为花生根结线虫不同种群，4为象耳豆根结线虫不同种群，5为纳西根结线虫，6为北方根结线虫种群，7为拟禾本科根结线虫，8为禾本科根结线虫，9～13为肾形肾状线虫不同种群，14为南方根结线虫和肾形肾状线虫的混合DNA，15～23分别为矮化线虫、螺旋线虫、咖啡短体线虫、相似穿孔线虫、水稻潜根线虫、腐烂茎线虫、滑刃线虫、真滑刃线虫和秀丽小杆线虫，24为清水对照。

图2. 不同方法提取土壤DNA巢式多重PCR结果，I为裂解液Buffer H提取的DNA粗提物，II为土壤强力试剂盒（MOBIO）提取的DNA，III为普通土壤提取试剂盒（MOBIO）提取的DNA，IV为裂解液Buffer D提取的DNA粗提物；1、2、3分别代表1g灭菌土中加入1条南方根结线虫；1条肾形肾状线虫；1条南方根结线虫和1条肾形肾状线虫。4为灭菌土不加虫阴性对照，5为根结线虫和肾形肾状线虫单条虫的DNA混合物阳性对照，6为清水对照。

图3不同方法纯化土壤DNA后巢式PCR检测灵敏度结果，A为PowerClean® DNA Clean-Up Kit纯化结果，B为天根生物公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化结果，C为北京天泽基因公司的腐殖酸去除剂纯化结果；1,2,3,4,5,6,7,8分别为1g，2g，5g，10g，15g，20g，25g，30g灭菌土中加入1条根结线虫和1条肾形肾状线虫的总DNA扩增结果；9为单条根结线虫和肾形肾状线虫的DNA混合物扩增阳性对照；10为灭菌土不加虫阴性对照；11为清水空白对照；M1为DS2000分子量Marker；M2为100bp分子量Marker。

图4田间黄瓜根围土壤巢式多重PCR检测结果，1～46为田间黄瓜根围不同土壤样品，47为单条根结线虫和单条肾形肾状线虫DNA扩增结果，48为清水对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。为了方便理解本发明，以下实施例中使用的线虫来源如下，但本发明方法不受线虫来源的限制，本领域技术人员可以采用其他来源的所属种类线虫实现本发明的目的：

爪哇根结线虫、 花生根结线虫、象耳豆根结线虫、北方根结线虫、拟禾本科根结线虫、禾本科根结线虫、肾形肾状线虫、矮化线虫、咖啡短体线虫、相似穿孔线虫、水稻潜根线虫、腐烂茎线虫、滑刃线虫和真滑刃线虫 ：自行采集，参考文献： Hu M, X., Zhuo, K. , Liao, J, L. Multiplex PCR for the simultaneous identification and detection of Meloidogyne incognita, M. enterolobii and M. javanica using DNA extracted directly from individual galls. Phytopathology, 2011, 101(11): 1270-1277 。

螺旋线虫： 自行采集，参考文献：陈英 . 广州市经济作物线虫的调查与鉴定 . 华南农业大学（硕士论文）， 2008 ， pp84。

以下生物材料为发明人获赠得到：

秀丽小杆线虫： Dr. Zhang Lianhui ( Institute of Molecular and Cell Biology, 61 Biopolis Drive, Singapore) 赠送；

纳西根结线虫： Dr. Ye Weimin ( Nematode Assay Section, Agronomic Division, North Carolina Department of Agriculture & Consumer Services, USA) 赠送。

实施例 1

（1）引物设计与合成

根据植物线虫大亚基核糖体DNA（GenBank 登录号：JF461074-JF461078，AF435797-AF435800，EU364889，AF435803，AF435794，GQ130139，DQ145641，DQ328685，HQ420904，HQ420905，AF435793，AF435801，DQ328713，GU120091，HM131853- HM131884）的D2D3区序列特征设计。所述引物的核苷酸序列为：

NF3：5’- GTGAGGGAAAGTTGCAAAGCACT -3’；

NR0：5’- GTTCACCATCTTTCGGGTCTCAC -3’；

MF0：5’- GGGGATGTTTGAGGCAGATTTG -3’；

RF4：5’- GGTCTGGCTCCCATGTTTTCCA -3’；

D2A：5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'；

D3B：5'-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3'。

引物的特异性检测：先进行BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网上比对，发现引物对NF3/NR0和根结线虫、肾形肾状线虫等植物寄生线虫以及自由生活的小杆线虫都有100%的相似性。根结线虫特异引物MF0和根结线虫属内象耳豆根结线虫M. enterolobii（JN005866、JN005864）、南方根结线虫M. incognita（JN005858-JN005861、AF435794）、爪哇根结线虫M. javanica（JN005852、JN005854、JN005856、JN005857）、花生根结线虫M. arenaria（JN005870、EU364889、AF435803、U42339、U42342），伪根结线虫M. fallax（FN429017），西班牙根结线虫M. hispanica（GQ375158、EU443606-EU443608），泰国根结线虫M. thailandica（EU364890），朝鲜根结线虫M. konaensis（AF435797）以及巴拉那咖啡根结线虫M. paranaensis（AF43579-AF435780）有100%的覆盖率和100%的相似性；肾形肾状线虫的特异引物RF4只和肾形肾状线虫（HM131853 HM131884、GU120091、DQ328713）有100%的覆盖率和100%的相似性。

首先采用线虫的通用引物D2A和D3B对单条线虫的DNA提取物进行第一轮PCR扩增，然后以第一轮PCR产物为模板，分别采用线虫通用引物NF3和根结线虫的特异引物MF0以及肾形肾状线虫的特异引物RF4与下游通用引物NR0进行PCR扩增以检测引物的特异性。

PCR反应体系为：上下游引物各0.2μM，0.2mM dNTPs，含2 mM MgCl₂的1×PCR缓冲液，1U Taq DNA聚合酶，1µL第一轮PCR产物和余量ddH₂O，共25 μL。

PCR条件为：预变性94℃ 3min；94℃ 变性30 s，59℃退火30 s和72℃延伸 30s，共30个循环；终延伸72℃ 10min。

将5µL PCR产物用2％琼脂糖电泳分离，结果表明引物对NF3/NR0扩增根结线虫不同种、肾状线虫不同种群、其他植物寄生线虫以及自由生活的小杆线虫均产生约600bp左右的条带；引物对MF0/NR0扩增南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、象耳豆根结线虫的不同种群均可得到424bp大小的条带，扩增北方根结线虫得到427bp大小的条带，扩增拟禾本科根结线虫（M. graminicola）和禾本科根结线虫（M. graminis）均得到431bp大小的条带，而用作对照的其他植物寄生线虫和秀丽小杆线虫（C. elegans）均没有条带产生。引物对RF4/NR0只可扩增肾形肾状线虫不同种群得到265bp大小的条带，而包括根结线虫在内的其他植物寄生线虫以及秀丽小杆线虫均没有条带产生。此结果说明所设计引物具有高度特异性。

（2）多重PCR扩增反应体系的建立

采用线虫通用引物NF3和根结线虫的特异引物MF0以及肾形肾状线虫的特异引物RF4与下游通用引物NR0进行巢式多重PCR扩增以检测象耳豆根结线虫。DNA模板来自单条线虫。按下列体系配置PCR反应体系：

10×PCR buffer 2.5 µL，2.5mmol/L dNTPs 2 µL，10μmol/L NF3 0.3µL，10μmol/L NR0 1µL，10μmol/L MF0 0.7µL，10μmol/L RF4 0.5µL，rTaq 0.25µL，第一轮PCR产物1.0 µL和余量的ddH₂O，共 25.0µL。

多重PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃后延伸5 min。PCR反应可在Bio-Rad PCR 仪上完成。然后用2.0%琼脂糖凝胶加样5µL PCR产物电泳，紫外灯下观察，用凝胶成像分析系统照像。

电泳结果见附图1所示，其中1为南方根结线虫，2为爪哇根结线虫，3为花生根结线虫不同种群，4为象耳豆根结线虫不同种群，5为纳西根结线虫，6为北方根结线虫种群，7为拟禾本科根结线虫，8为禾本科根结线虫，9～13为肾形肾状线虫不同种群，14为南方根结线虫和肾形肾状线虫的混合DNA，15～23分别为矮化线虫、螺旋线虫、咖啡短体线虫、相似穿孔线虫、水稻潜根线虫、腐烂茎线虫、滑刃线虫、真滑刃线虫和秀丽小杆线虫，24为清水对照。结果表明该多重PCR体系特异性好。

（3）土壤总DNA的提取方法

取1g灭菌土（基质：壤土：沙=1:1:1，质量比；购自大洋植树袋厂有限公司），分别加入1条根结线虫或/和1条肾形肾状线虫。同时以不加虫的灭菌土DNA作为阴性对照，以ddH₂O作为空白对照。利用以下4种不同方法进行DNA提取，每个处理4个重复。

方法I：本实验自制抽提缓冲液Buffer H，使用酚氯仿进行土壤DNA提取。具体步骤如下：

1） 称取1g灭菌土于2mL离心管，加入600μL预热的抽提缓冲液Buffer H [20mM EDTA，1.5M NaCl，500mM Tris（pH 8.0），10% SDS，1% PVP]，颠倒混匀；

2）加入5μL（20mg/mL）蛋白酶K，涡旋混匀，置于65℃水浴1h，期间不时摇匀；

3）取出，在Mobio Vortex上以最大速度水平震荡10min；

4）12000g室温离心5min，取上清，加入300μL Tris-饱和苯酚，颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；

5）将上清转入干净的1.5 mL离心管中，加入300μL 氯仿/异戊醇（24：1，体积比），颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；

6）将上清转入干净的1.5mL离心管，加入1/10体积的冰NaAc（3 M， pH 5.2）和2倍体积的冷无水乙醇，混匀后–20℃静置20min，4℃ 12,000g离心10min，弃尽上清；

7）分别用500μL 70%的乙醇（体积百分比）和无水乙醇各洗沉淀一次，室温晾干；

8）加100μL灭菌双蒸水复溶，便可得到粗提的土壤DNA。粗提的DNA可直接用KOD Fx酶PCR扩增或–20℃保存。

方法II：选用土壤DNA提取试剂盒PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio,Carlsbad, CA），具体操作参考产品说明。

方法III：选用土壤DNA提取试剂盒UltraClean Soil DNA Purification Kit（MoBio, Carlsbad, CA），具体操作参考产品说明。

方法IV：参考Yan等的方法（Yan G, Smiley R W et al. Detection and Discrimination of Pratylenchus neglectus and P. thornei in DNA Extracts from Soil. Plant Disease. 2008, 92(11): 1480-1487），使用抽提缓冲液Buffer D进行土壤DNA的粗提。

对不同方法提取的土壤DNA进行多重PCR扩增检测DNA提取效率。除PCR循环数为35个循环外，其余反应体系和反应条件同前“（2）多重PCR扩增反应体系的建立”所述。采用通用引物NF3/NR0以及根结线虫的特异性引物MF0和肾状线虫的特异引物RF4对分别加入了1条根结线虫和/或1条肾形肾状线虫的土壤DNA进行多重PCR扩增。同时未加虫的灭菌土DNA作为对照，并设一清水阴性对照。扩增结果表明：使用两种Mobio试剂盒提取的DNA和用自制DNA提取缓冲液Buffer H提取的DNA巢式扩增均有特异性扩增条带产生，而Buffer D提取的土壤DNA粗提物扩增不到目的条带。电泳结果见附图2。附图中，I为裂解液Buffer H提取的DNA粗提物，II为土壤强力试剂盒（MOBIO）提取的DNA，III为普通土壤提取试剂盒（MOBIO）提取的DNA，IV为裂解液Buffer D提取的DNA粗提物；1代表1g灭菌土中加入1条南方根结线虫；2代表1g灭菌土中加入1条肾形肾状线虫；3代表1g灭菌土中加入1条南方根结线虫和1条肾形肾状线虫，4为灭菌土不加虫阴性对照，5为根结线虫和肾形肾状线虫单条虫的DNA混合物阳性对照，6为清水对照。因为试剂盒价格昂贵，因此本结果认为使用自制Buffer H作为裂解液对土壤总进行提取即可满足土壤中植物寄生线虫快速检测的需要。

（4）不同土壤DNA粗提物纯化方式比较

为了提高检测的灵敏度，本试验设置1g至30g不同重量灭菌土（基质：壤土：沙=1:1:1）中加入1条根结线虫和1条肾形肾状线虫。同时以不加虫的灭菌土DNA作为阴性对照，以ddH₂O作为空白对照。利用自制抽提缓冲液Buffer H进行 DNA提取，每个处理4个重复。DNA粗提物使用三种不同方法进行纯化，一是使用PowerClean® DNA Clean-Up Kit（MoBio, Carlsbad, CA），二是使用北京天根生物公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，三是使用北京天泽基因公司的腐殖酸去除剂。三种纯化方式具体操作见产品说明。纯化产物进行多重PCR扩增以评估检测的灵敏度。反应条件同前述“（3）土壤总DNA的提取方法”所述。结果表明：MoBio公司的纯化试剂盒纯化效果最好，可使多重PCR扩增的检测灵敏度提高到25g灭菌土中含有1条根结线虫和1条肾形肾状线虫；天根公司的普通DNA回收试剂盒次之，可检测到10g灭菌土中的1条根结线虫和1条肾形肾状线虫，灭菌土重量为15g时根结线虫特异条带不清晰；天泽基因公司的腐殖酸去除剂纯化效果最差，但也可检测到5g灭菌土中的1条根结线虫和1条肾形肾状线虫。电泳结果见附图3。附图中，A为PowerClean® DNA Clean-Up Kit纯化结果，B为天根生物公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化结果，C为北京天泽基因公司的腐殖酸去除剂纯化结果；1,2,3,4,5,6,7,8分别为1g，2g，5g，10g，15g，20g，25g，30g灭菌土中加入1条根结线虫和1条肾形肾状线虫的总DNA扩增结果；9为单条根结线虫和肾形肾状线虫的DNA混合物扩增阳性对照；10为灭菌土不加虫阴性对照；11为清水空白对照；M1为DS2000分子量Marker；M2为100bp分子量Marker。

实施例 2 根结线虫和肾形肾状线虫快速检测方法的田间应用

对采自广东、广西、云南、海南、内蒙古等省份不同地区的57份黄瓜根围土壤样品，首先根据形态学观察结合28S D2D3区分子扩增及序列比对确定主要植物寄生线虫种类，然后取5g新鲜的黄瓜根围土壤，采用自制抽提缓冲液Buffer H进行DNA粗提方法，北京天根生物公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，纯化产物直接进行巢式多重PCR，同时以不加虫的灭菌土作为阴性对照。每个样品4个重复。反应条件同前述“（3）土壤总DNA的提取方法”所述。检测结果见附图4，附图4中，1～46为田间黄瓜根围不同土壤样品，47为单条根结线虫和单条肾形肾状线虫DNA扩增结果，48为清水对照。多重PCR结果表明：2、7、10、12、17、20、21、23、26、27、30、32-38泳道的样品产生1条约600bp的通用条带和1条约400bp的根结线虫特异条带，说明这些样品中含有根结线虫；1、5、6、8、9、11、16、18、25、28、31、39、40、43泳道产生1条约600bp的通用条带和1条约250bp的肾形肾状线虫特异条带，其余泳道产生约600bp、400bp和约250bp大小的3条带，说明这些样品中既含有根结线虫，也有肾形肾状线虫存在。多重PCR检测灵敏度分别为500g土壤中含有15条根结线虫或16条肾形肾状线虫。通用条带的产生可以避免假阴性扩增结果的发生，有效防止结果判断错误。通过土壤DNA多重PCR鉴定结果与形态学和28S-PCR结果验证结果一致，充分说明根结线虫和肾形肾状线虫土壤DNA多重PCR检测方法的灵敏度、可信度及准确性。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物及方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acaagtaccg tgagggaaag ttg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcgaaggaa ccagctacta 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgagggaaa gttgcaaagc act 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttcaccatc tttcgggtct cac 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggggatgttt gaggcagatt tg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtctggctc ccatgttttc ca 22

Claims (9)

1.一组直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的PCR引物，其特征在于核苷酸序列如下：线虫的通用引物为D2A和D3B；D2A：SEQ ID NO:1；D3B：SEQ ID NO:2；巢式PCR扩增引物为NF3、NR0、MF0和RF4；NF3：SEQ ID NO:3；NR0：SEQ ID NO:4；MF0：SEQ ID NO:5；RF4：SEQ ID NO:6。

2.一种直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤如下：

（1）使用抽提缓冲液提取待测土壤DNA、纯化；

（2）巢式PCR扩增：进行两轮PCR扩增反应，第一轮以待测土壤DNA为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的线虫通用引物进行PCR扩增；第二轮以第一轮PCR产物为模板，SEQ ID NO: 3～6所示的引物进行PCR扩增；

（3）结果分析：

① 第二轮PCR扩增产物含有617~624bp和424~431bp的序列，表明待测土壤中含有根结线虫；

② 第二轮PCR扩增产物含有644bp和265bp的序列，表明待测土壤中含有肾形肾状线虫；

③ 第二轮PCR扩增产物含有617~644bp、424~431bp和265bp的序列，表明待测土壤中同时含有根结线虫和肾形肾状线虫。

3.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（3）结果分析中①第二轮PCR扩增产物含有617bp和424bp的序列时，表明待测土壤中含有南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、纳西根结线虫和/或象耳豆根结线虫；扩增产物中含有620bp和427bp的序列时，表明待测土壤中含有北方根结线虫；扩增产物中含有624bp和431bp的序列时，表明待检测土壤中含有拟禾本科根结线虫和/或禾本科根结线虫。

4.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（1）中所述抽提缓冲液为：20mM EDTA，1.5M NaCl，500mM Tris-HCl，质量体积比为10%的SDS水溶液，质量体积比为1%的PVP水溶液；其中Tris-HCl的pH值为8.0。

5.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（1）中的纯化是使用试剂盒PowerClean® DNA Clean-Up Kit。

6.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（1）提取待测土壤DNA具体为：

①待检测土壤与预热的抽提缓冲液混匀；

②加入蛋白酶K，混匀后在65℃下消化1小时后震荡10min；

③12000g室温离心5min，取上清加入Tris-饱和苯酚，颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；

④将上清转入干净的离心管，加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，颠倒混匀，4℃ 12,000g离心10min；

⑤将上清转入干净的离心管，加入3M，pH 5.2的冰醋酸，加入量为上清体积的1/10，再加入上清体积2倍的冷无水乙醇，混匀后–20℃静置20min，4℃ 12,000g离心10min，弃尽上清；

⑥分别用体积百分含量为70%的乙醇和无水乙醇各洗沉淀一次，室温晾干；

⑦加灭菌双蒸水复溶，可得到粗提的土壤DNA。

7.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（2）第一轮PCR的反应体系为：2×PCR buffer 12.5 µL，2mmol/L dNTPs 5 µL，10μmol/L 引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.5µL， KOD Fx 0.5µL，DNA模板1.0 µL和余量的ddH₂O，共 25.0µL；

PCR扩增条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃后延伸5 min。

8.根据权利要求2所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的方法，其特征在于步骤（2）第二轮PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5 µL，2.5mmol/L dNTPs 2 µL，10μmol/L SEQ ID NO:3所示引物 0.3µL，10μmol/L SEQ ID NO:4所示引物 1µL，10μmol/L SEQ ID NO:5 所示引物0.7µL，10μmol/L SEQ ID NO:6 所示引物0.5µL，rTaq 0.25µL，第一轮PCR产物1.0 µL和余量的ddH₂O，共 25.0µL；

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃后延伸5 min。

9.权利要求1所述直接同时检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫的引物在快速检测土壤中根结线虫和肾形肾状线虫中的应用。

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