CN101899530B - 烟草普通花叶病毒环介导等温扩增检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种烟草普通花叶病毒环介导等温扩增检测方法，包括步骤1)：提供两对用于检测烟草普通花叶病毒的LAMP引物序列，即长度分别为45bp、44bp、20bp和20bp的寡聚核苷酸序列，上游引物1、下游引物1、上游引物2和下游引物2，上述两对LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下：上游引物1：5’-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3’，下游引物1：5’-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3’，上游引物2：5’-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3’，下游引物2：5’-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3’，还包括步骤2)：提供一种烟草普通花叶病毒的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，最后根据反应混合物的颜色显示对检测结果进行判断。

Description

烟草普通花叶病毒环介导等温扩增检测方法

技术领域

本发明涉及一种利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术进行病样检测的方法，尤其是一种烟草普通花叶病毒病环介导等温扩增检测方法。

背景技术

烟草普通花叶病毒病(Tobacco mosaic virus，TMV)在世界各烟区都普遍发生，在20世纪60年代以前，是我国烟草危害最重的病毒病，至今在南方烟区和东北烟区仍为烟草主要病毒病害。病毒病的发生严重影响烟叶的产量和质量，给我国烟草生产造成了重大的经济损失。因此开发新的技术快速、准确、灵敏地检测TMV，加强漂浮育苗苗期检疫以及栽培土壤环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国烟草生产的健康持续发展具有重要意义。

目前用于烟草病毒检测的方法主要有生物学诊断、电子显微镜、酶联免疫吸附技术(ELISA)以及分子生物学等方法：生物学方法主要是鉴别寄主反应或指示植物等，这种仅仅以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法，虽曾广泛运用，却由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制而运用较少。电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长；酶联免疫吸附技术(ELISA)虽具简便、快速等优点，但灵敏度较差，且存在非特异性反应；上述三种方法均不能快速、简便、准确地检测烟草普通花叶病毒。近年来发展起来的以分子生物学技术为基础的病毒检测方法主要有RT-PCR法以及PCR微量板杂交等检测方法，克服了上述三种方法的缺点，在实验室条件下实现了烟草普通花叶病毒的相对快速、准确检测。由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪，凝胶电泳和成像系统等大大限制了这些检测方法在生产中的推广应用。

环介导等温扩增技术是2000年由Notomi等发明的。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增。LAMP是一种新式恒温核酸扩增方法，采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(B st DNA polymerase)，在恒温条件(60～65℃)，进行核酸的指数级扩增，在45～60min的时间里其扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个数量级。在扩增反应中产生茎——环结构，引物与其杂交启动新一轮核酸合成。最近几年已开始应用于生物致病病原的检测。到目前为止，尚未见利用LAMP技术检测烟草普通花叶病毒的报道。

发明内容

(发明目的)本发明的目的是提供一种烟草普通花叶病毒环介导等温扩增检测方法，以实现能对烟草普通花叶病毒进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有技术的不足。具体地说，本发明将TMV基因组中的保守核酸序列——衣壳蛋白基因作为靶DNA，针对该基因的保守区段设计了4条特异引物，然后利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒定温度下对目的核酸进行扩增，实现了对TMV的快速和高灵敏检测。

本发明所述的烟草普通花叶病毒环介导等温扩增检测方法，包括如下步骤：

1)提供两对用于检测烟草普通花叶病毒的LAMP引物序列，即长度分别为45bp、44bp、20bp和20bp的寡聚核苷酸序列，依次命名为上游引物1、下游引物1、上游引物2和下游引物2；上述两对LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下：

上游引物1：5’-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3’

下游引物1：5’-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3’

上游引物2：5’-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3’

下游引物2：5’-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3’

2).提供一种烟草普通花叶病毒的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，最后根据反应混合物的颜色显示对检测结果进行判断。

本发明所提供的TMV检测方法具有如下优点：

(1)灵敏度高。对TMV的检测极限可低至10¹个拷贝，对TMV检测的灵敏比普通PCR方法高10倍以上。

(2)特异性强。所用的特异引物根据TMV主要衣壳蛋白基因中6个不同区域设计，特异性超过常规PCR。

(3)检测时间短。2-3个小时便可获得检测结果，比现有最快捷的PCR检测法节省3-5个小时。

(4)仪器要求宽松。不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只要一个水浴锅或金属浴就能完成检测反应。

(5)操作简单、结果明显。整个检测过程不涉及复杂仪器或设备(稍具分子生物学基础的人员即可完成操作)；检测结果清晰明显，直接用眼睛观察就可以判断。

(6)对人和环境安全。检测过程中不使用有毒试剂，对人和环境都非常安全。

(7)低成本。LAMP检测总成本大大低于现有最廉价的PCR检测方法。

总之，该方法具有比普通PCR检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，可以替代烟草普通花叶病毒的生物学、电子显微镜和PCR检测法。

具体实施方式

本发明根据以下步骤即可进行TMV病毒的检测，具体包括以下四个步骤：

(1)制备待检样品的LAMP反应模板：取0.2克样品，采用北京盖宁金诺生物技术有限公司组织基因组RNA提取试剂盒(GALEN BIOPHARM)进行提取组织的RNA，并将制备的RNA稀释为0.2μg/μL；

(2)配制LAMP反应体系：取上述制备的RNA模板1μL，加入到如下反应体系中：反转录酶1.6U，引物上游引物1和下游引物1各1.6μM，引物上游引物2和下游引物2各0.2μM，四种dNTP各1.5mM，MgCl₂ 8mM，Betaine 1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO₄ 2mM，，(NH₄)₂SO₄ 10mM，Triton X-100 0.1％，Bst DNA聚合酶8U，加入双蒸水使反应体系的总体积达到25μL；

(3)按照如下反应程序进行LAMP反应：63℃保温60分钟，然后80℃保温5分钟；

(4)检测结果显色及判断：LAMP反应结束后，在反应体系中加入染料为分子生物学应用的可使核酸显色的花青素类染料(如SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM、GeneFinder^TM等)，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的烟草普通花叶病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的烟草普通花叶病毒检测结果为阴性。

下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容。

为了建立TMV的LAMP检测方法，首先要选择TMV所具有的特异核苷酸序列，然后进行LAMP引物的设计和合成。研究表明TMV的主要衣壳蛋白基因(GenBank注册号为：AJ239099)，可以作为TMV的特征核苷酸序列，用于TMV的鉴定和检测。在确定主要衣壳蛋白基因作为TMV检测的特异核苷酸序列之后，就可以根据该基因的核苷酸序列设计LAMP扩增的引物。LAMP引物的设计首选软件PrimerExplore 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，也可以使用常用的引物设计软件(如Primer Primier 5.0或Omiga 2.0)按照LAMP引物的设计要求进行引物设计。利用软件PrimerExplore 4.0在线设计的TMV主要衣壳蛋白基因的LAMP引物如下：

上游引物1：5’-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3’

下游引物1：5’-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3’

上游引物2：5’-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3’

下游引物2：5’-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3’

按照上述引物序列进行LAMP引物的合成(可由商业的DNA合成公司合成，如上海生物工程公司)。

合成制备TMV主要衣壳蛋白基因的LAMP扩增引物之后，就可以进行TMV的LAMP检测了。其LAMP检测方法包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和扩增结果的判断。

LAMP检测反应所用的RAN模板可以用常规的组织核酸提取方法制备，也可用商品化的组织RNA提取试剂盒制备。本发明中采用北京盖宁金诺生物技术有限责任公司超纯总RNA提取试剂盒(GALEN BIOPHARM)进行样品RAN的提取，详细操作步骤参见该试剂盒的使用说明书。

制备LAMP反应RNA模板后，即可进行TMV的LAMP反应检测，为此，首先要配制出具有最佳扩增效率和检测特异性的反应体系，本发明中的LAMP反应中的引物、dNTP和Betaine(甜菜碱)、Mg²⁺的浓度均做了优化，它们的最佳浓度分别是引物上游引物1和下游引物1各1.6μM，引物上游引物2和下游引物2各0.2μM，四种dNTP各1.5mM，Betaine 1M。最终确定的反应体系为：引物上游引物1和下游引物1各1.6μM，引物上游引物2和下游引物2各0.2μM，四种dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)各1.5mM，MgCl₂8mM，Betaine(甜菜碱)1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO₄2mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，Triton X-100 0.1％，反转录酶1.6U，待检样品RNA模板1μL，Bst DNA聚合酶8U。按照上述体系要求配制反应混合物，混匀后分装到无菌Eppendorf管中(规格为200μL)，然后加入双蒸水使各Eppendorf管中反应体系的总体积达到25μL。

在反应程序中，扩增温度过高(如70℃)或过低(如60℃)均不利于LAMP反应获得最佳效果，本发明提供的引物和采用本发明确定的反应体系时，其扩增温度为62℃-64℃，最佳的反应温度为63℃。另外，反应时间对反应产物量也有较大影响，在反应时间少于45分钟时，无法观测到反应产物，为保证LAMP反应产生足够的产物便于观测，本发明中反应时间确定为1个小时。扩增反应结束时应在80℃保温5分钟以灭活DNA聚合酶。所以，进行LAMP检测时，需将上述含有反应体系的Eppendorf管放入水浴锅或金属浴中，63℃保温1个小时，然后80℃保温5分钟。

LAMP反应结束后，即可在反应产物中加入核酸染料进行检测结果的判断，本发明中使用的核酸染料为厦门百维信生物科技有限公司商品化生产的GeneFinder^TM。在反应产物中加入100倍稀释的GeneFinder^TM 2μL，用眼睛观察所测试样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的烟草普通花叶病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的烟草普通花叶病毒检测结果为阴性。

实施例1用LAMP方法检测烟草植株的TMV

首先按照本发明提供的LAMP引物序列合成用于TMV检测的LAMP引物上游引物1、下游引物1、上游引物2和下游引物2。然后根据以下步骤进行TMV病毒的检测。

(1)制备待检样品的LAMP反应模板：

取待检叶片0.1克，采用北京盖宁金诺生物技术有限责任公司超纯总RNA提取试剂盒(GALEN BIOPHARM)进行组织RNA的提取和纯化，具体提取和纯化步骤参见该试剂盒的操作说明书。

(2)配制LAMP反应体系：

取上述制备的DNA模板1μL，加入到如下反应体系中：引物上游引物1和下游引物1各1.6μM，引物上游引物2和下游引物2各0.2μM，四种dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)各1.5mM，MgCl₂ 8mM，Betaine(甜菜碱)1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO₄ 2mM，，(NH₄)₂SO₄ 10mM，Triton X-100 0.1％，BstDNA聚合酶8U；反转录酶1.6U，加入双蒸水使反应体系的总体积达到25μL。

(3)按照如下反应程序进行LAMP反应：

63℃保温60分钟，然后80℃保温5分钟。

(4)判断LAMP检测结果：

反应结束后，在反应体系中加入100倍稀释的GeneFinder^TM 2μL，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的烟草普通花叶病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的烟草普通花叶病毒检测结果为阴性。

利用上述方法已经完成了取自山东、云南、东北的50份烟草样品的检测，检测结果显示，凡是经TMV的PCR检测方法确定为阳性的样品，LAMP检测方法均能检测到TMV的存在；而其中三份经TMV的PCR检测方法确定为阴性的样品，用LAMP检测方法却检测出TMV的存在，后来把PCR检测方法的循环数增加到40，从这两份样品中又检测到了TMV，这说明PCR检测方法可能会出现漏检的情况，这也反映出该LAMP检测方法比PCR检测方法具有更高的灵敏度和可靠性。

实施例2用于TMV检测的LAMP方法和PCR方法的灵敏度测定及比较

用TMV主要衣壳蛋白基因(TCP)特异的PCR引物(正向引物：5’-CCATCACAGTTCGTGTTCTTG-3’和反向引物：5’-TAGCGTCTAACGTTTCGGCAG-3’)扩增TMV主要衣壳蛋白基因的全长序列，并构建到载体pDEST32中，获得含有TMV TCP基因全长的质粒pDEST32-TCP，然后测定质粒浓度并作10倍的梯度稀释。

将上述稀释后的质粒用作LAMP反应的模板分别进行扩增，用凝胶电泳分析LAMP的反应产物，结果显示本发明提供的LAMP检测方法对TMV的检测极限为10¹个拷贝的病毒粒子。

同时，将上述梯度稀释的质粒用作PCR反应的模板，利用烟草TMV主要衣壳蛋白基因特异的PCR引物(正向引物：5’-CCATCACAGTTCGTGTTCTTG-3’和反向引物：5’-TAGCGTCTAACGTTTCGGCAG-3’)，按照如下反应程序分别进行扩增：

95℃变性5min，1个循环；

94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；

72℃延伸7min；

然后在2％的琼脂糖凝胶电泳上分析PCR产物，结果发现，PCR方法对TMV的检测极限为10³个拷贝病毒粒子。

所以，本发明所提供的烟草普通花叶病毒LAMP检测方法比目前用于该病毒检测的PCR方法灵敏度高100倍。

序列表

<110>中国农业科学院烟草研究所

<120>烟草普通花叶病毒环介导等温扩增检测方法

<160>4

<210>1

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>1

gcaccacgtg tgattacgga cattttgacc tctggtcctg caact 45

<210>2

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>2

aagggttgtg tcttggatcg cgttttttac gtgcctgcgg atgt 44

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<400>3

cgagagctct tctggtttgg 20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_Feature

<400>4

gattcgaacc cctcgcttta 20

Claims (2)

1.一种烟草普通花叶病毒环介导等温扩增检测方法，包括如下步骤： 

1)提供两对用于检测烟草普通花叶病毒的LAMP引物序列，即长度分别为45bp、44bp、20bp和20bp的寡聚核苷酸序列，上游引物1和下游引物1、上游引物2和下游引物2，上述两对LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下： 

上游引物1：5’-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3’ 

下游引物1：5’-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3’ 

上游引物2：5’-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3’ 

下游引物2：5’-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3’； 

2)提供一种烟草普通花叶病毒的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，最后根据反应混合物的颜色显示对检测结果进行判断； 

3)上述的LAMP反应体系如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.5mM，MgCl₂8mM，甜菜碱1M，Tris-HCl 20mM，KCl10mM，MgSO₄2mM，(NH₄)₂SO₄10mM，Triton X-100 0.1％，Bst DNA聚合酶8U，反转录酶1.6U，待检样品RNA模板1μL，加入双蒸水使反应体系的总体积达到25μL； 

4)上述的LAMP反应程序如下：将上述LAMP反应体系在62℃～64℃保温60分钟，然后80℃保温5分钟； 

5)LAMP反应结束后，在反应体系中加入10～10000倍稀释的染料，然后在阳光下观察被测样品LAMP反应产物的颜色，如果是绿色则表示该样品的烟草普通花叶病毒检测结果为阳性，如果是橙黄色则表示该样品的烟草普通花叶病毒检测结果为阴性。 

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的染料为分子生物学应用的可使核酸显色的花青素类染料，为SYBR Green、GelRed、GelGreen、 GoldView^TM、GeneFinder^TM中的任意一种。