CN102154518B - 利用rt-lamp方法快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水稻、小麦和玉米等植株上水稻黑条矮缩病毒的快速检测技术及其在病害诊断上的应用方法。利用这一方法可以排除南方水稻黑条矮缩病的干扰，快速鉴定出水稻黑条矮缩病毒植株样品，进而采取针对性的防治策略，减少病害带来的损失。

Description

利用RT-LAMP方法快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒

技术领域

本发明涉及水稻、小麦和玉米等植株上水稻黑条矮缩病毒的快速检测技术及其在病害诊断上的应用，属于农业科学技术领域。

背景技术

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，是水稻上一种危害严重的病毒病，隶属于植物呼肠孤病毒科斐济病毒属(Fijivirus)，病毒粒体球状，主要由灰飞虱传播，田间症状前期主要表现为植矮缩，叶片浓绿，后期在叶片、叶鞘及茎杆上出现蜡滴状突起，而后形成黑条，对水稻的产量影响很大，重病田甚至可导致无产量。该病毒除侵染水稻外，还可侵染玉米(玉米粗缩病)、小麦(小麦绿矮)及多种禾本科杂草。1963和1966年在中国江苏、上海、浙江一带流行，90年代在我国许多玉米和水稻产区爆发流行，造成了严重损失。近年来该病在江浙地区蔓延发生，且呈日渐严重的趋势，2008年仅江苏省发病面积就达400万亩，致使当地的水稻生产损失严重。

2007年以来在广东和海南等省新发生一种水稻病毒病，田间症状与水稻黑条矮缩病毒极其相似，对其基因组序列进行测定后发现其与水稻黑条矮缩病毒存在较大差异(两者的S9和S10片段的同源性仅仅为75％和80％)，定名为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarfvirus，SRBSDV)，该病毒也属于植物呼肠孤病毒科斐济病毒属(Fijivirus)，病毒粒体球状，基因组由10条双链RNA组成，传播介体主要为白背飞虱，灰飞虱也可传播，田间症状表现为植株矮缩、叶色深绿、叶背及茎秆出现条状乳白色或深褐色小突起，寄主除水稻外还包括玉米及多种杂草。近年来该病长江下游地区蔓延发生，且呈日渐严重的趋势，2009年南方水稻黑条矮缩病毒全国发生面积达300万亩，2010年迅速上升至1900万亩，仅湖南省就发生近1000万亩，绝收面积8万亩，给水稻生产带来了巨大的损失。

由于两种病毒在症状、粒体形状、传播介体及寄主等方面非常相似，由此也给其诊断及鉴定造成了困难。目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有：生物学接种实验，血清学检测，电镜观察及分子生物学检测。由于这两种病毒在很多方面都具有非常接近的特性，因此传统的植物病毒检测方法，如电镜观察(病毒粒子大小形状相近)、传统的生物学接种鉴定(症状、介体、寄主范围相近)、血清学检测(序列仍有较高的同源性)等方法都很难区分。环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)，是由Notomi T等在2000年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，它是一种高灵敏的链置换技术，一种新型的PCR替代技术。LAMP特点是针对靶基因的6个区域设计了4个特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶——Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒温(65℃)的条件下反应1小时即可完成核酸扩增反应，通过荧光染色直接目测比色就可以得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断。

发明内容

本发明提供了一种快速检测植株上水稻黑条矮缩病毒的方法，通过该方法可以排除南方水稻黑条矮缩病毒的干扰，快速诊断出疑似病株是否为水稻黑条矮缩病。

本发明所提供的一种快速检测植株上水稻黑条矮缩病毒的方法，是通过以下方法获得的：

1)根据NCBI已报道的水稻黑条矮缩病毒核苷酸序列，通过软件DNAstar分析后找出该病毒核酸相对保守的区域作为模板参考序列使用在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物；

2)Trizol reagent法提取植株总RNA；

3)设置不同内外引物浓度比例、Mg²⁺浓度，确定最佳反应体系；分别改变反应时间和温度进行RT-LAMP扩增反应，确定最佳反应条件。

4)在最佳反应参数条件下，以南方水稻黑条矮缩病毒为对照验证这一方法的特异性；

5)与RT-PCR方法进行比较，验证RT-LAMP的可靠性；

6)通过肉眼判断和SYBR GreenI染色对RT-LAMP产物进行可视化处理。

本发明提供的引物序列如下：

F 3GGTACTTCTACTTCTAGTCCTT

B 3CTTTTTTCATGTCCATCAACTT

FIP ACGTAAAGACGATCCTTTTTCAGT-ACAGATAAGAAATTCATTGACTGG

BIP AGTGCCACTAATACTTCAACCAC-TCGTCAAAATATTGAACAGAGA

RT-LAMP的反应温度为60-63℃，反应时间为60-80min。利用电泳检测或荧光染料方法可以排除南方水稻黑条矮缩病的干扰，鉴定出水稻黑条矮缩病毒植株样品。

一种检测植株上水稻黑条矮缩病毒方法的应用包括：在水稻、小麦和玉米等疑似病植株的快速诊断与鉴别。

利用这一方法可以排除南方水稻黑条矮缩病的干扰，快速鉴定出水稻黑条矮缩病毒植株样品，进而采取针对性的防治策略，减少病害带来的损失。

附图说明图1为不同反应温度条件下RT-LAMP结果的电泳图(M为标准分子量；1为60℃；2为61℃；3为62℃；4为63℃；5为64℃；6为65℃；7为阴性对照)。

图2为不同反应时间条件下RT-LAMP结果的电泳图(M为标准分子量；1为20min；2为40min；3为60min；4为80min；5阴性对照)。

图3为RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较图及荧光染料方法检测RT-LAMP扩增产物图(A为RT-LAMP反应结果图；B为RT-PCR反应结果图；C为SYBR GreenI荧光染料方法检测结果图；1为0.3255μg/μl；2为0.3255×10^-1μg/μl；3为0.3255×10^-2μg/μl；4为0.3255×10^-3μg/μl；5为0.3255×10^-4μg/μl；6为0.3255×10^-5μg/μl；7为0.3255×10^-6μg/μl总RNA；8为阴性对照)。

具体实施方法

实施例1，水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP反应条件的优化

①水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP引物的设计。

根据NCBI已报道的水稻黑条矮缩病毒(AF227206.1，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/183229399；EU784843.1，http://Www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/209867306)S10核苷酸序列，通过软件DNAstar分析后找出该病毒核酸相对保守的区域950-1467bp，利用EU523359.1上的对应区域950-1467bp作为模板参考序列使用在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0 /index.html)设计引物。将模板序列上传后，由系统软件计算获得初步的LAMP引物组合(FIP，BIP，F3，B3)，再通过软件提供的引物相应的3’端或5’端稳定性及引物二聚体等参数对设计出的多对引物进行比较选择，最终选取一组最合适的引物，序列如下：

F 3GGTACTTCTACTTCTAGTCCTT

B 3CTTTTTTCATGTCCATCAACTT

FIP ACGTAAAGACGATCCTTTTTCAGT-ACAGATAAGAAATTCATTGACTGG

BIP AGTGCCACTAATACTTCAACCAC-TCGTCAAAATATTGAACAGAGA

②水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP的温度梯度实验

从江苏省重病区采集病株，参照季英华等的方法采用RT-PCR筛选出水稻黑条矮缩病毒样品用于RT-LAMP检测试验(季英华等，《(中国水稻科学》，2011)。参照

Reagents(康为世纪)使用说明，提取样品总RNA。虽然Bst DNA polymerase的最适反应温度为65.8℃，但许多报道已经证实RT-LAMP适宜反应温度在60℃-65℃之间，同时由于不同引物在设计时不可能保证所有引物的Tm值完全一致，而且RT-LAMP还要考虑到反转录酶的适宜反应温度，有鉴于此，本发明对RT-LAMP反应温度进行优化试验。RT-LAMP体系为：外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.2μM，dNTP混合物(10mM each)2.5μl，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH4)₂SO₄，8mM MgSO₄，0.1％TritonX-100，Bst DNA聚合酶8U，M-MuLV反转录酶100U，RNase Inhibitor 20U，8M甜菜碱，2μl总RNA模板，补充DEPC水至25μl。混匀反应物在60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃六种条件下恒温反应1h，80℃反应5min终止RT-LAMP反应，取2μL扩增产物上样，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结果EB染色。结果显示在同样反应体系条件下，在60℃，61℃，62℃，63℃恒温反应1h后有阶梯状扩增条带，说明这四个反应温度都适合，64℃恒温反应1h后扩增产物的电泳条带亮度非常弱，而65℃恒温反应1h及阴性对照无扩增产物。(图1)。因此本发明RT-LAMP的反应温度应为60-63℃。

③水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP的反应时间梯度实验

许多报道已经证实了RT-LAMP反应时间少于1h也能检测到扩增产物。按照②中已经优化好的RT-LAMP体系加样后置于63℃恒温条件下反应，分别设置恒温反应20min，40min，60min，80min四种处理，按②中完成反应后电泳检测。结果显示当反应时间为40min时已经有扩增产物，但产物较少，但是当反应时间为60min时，RT-LAMP扩增产物开始增多，此后当继续增加反应时间时，扩增产物的量几乎不发生改变(图2)。因此本发明确定的RT-LAMP的反应时间为60-80min。

④RT-LAMP与RT-PCR灵敏性比较

为了确定RT-LAMP和RT-PCR两种检测方法的灵敏度，将提取的总RNA用分光光度计测定浓度(0.3255μg/μl)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度RNA稀释液2μL作为模板，采用所设引物用③中RT-LAMP反应体系进行反应(反应时间为1h)。取2μL扩增产物上样，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳。同时，以RT-LAMP相同的2μL总RNA为模板，B3为反转录引物，参照M-MuLV反转录酶使用说明进行反转录合成cDNA第一链。以RT合成的cDNA为模板，以F3和B 3为引物进行PCR扩增，使用常规PCR反应体系。取2μL扩增产物上样，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果EB染色。结果显示用RT-LAMP方法可以检测到浓度是0.3255×10^-4μg/μl的RBSDV的总RNA，而RT-PCR也能检测到浓度是0.3255×10^-4μg/μl的RBSDV的总RNA，即RT-LAMP和RT-PCR灵敏性是基本一致的(图3)。

⑤荧光染料方法检测RT-LAMP扩增产物

按④中RT-LAMP反应产物电泳检测后，向PCR管中加入SYBR GreenI(1∶1000)2μl，1-5min后察结果。结果显示阳性扩增产物迅速变成绿色，而无扩增产物及阴性对照保持染料的橙色(图3)。

实施例2，水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP反应的特异性试验

为了验证RT-LAMP方法的特异性，选择与RBSDV同一属的南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)作为对照。分别以RBSDV和SRBSDV的总RNA为模板，用②中的RT-LAMP反应体系进行反应。结果显示用RT-LAMP引物去扩增SRBSDV的RNA模板时，没有扩增出条带；而扩增RBSDV的RNA时能够扩增出目的条带，这表明本发明建立的RT-LAMP检测方法具有很好的特异性。

一种检测植株上水稻黑条矮缩病毒方法的应用包括：在水稻、玉米和小麦等疑似病植株的快速诊断与鉴别。

上述实施不以任何形式限定本发明。

Claims (1)

1.一种快速检测植株上水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于：利用RT-LAMP反应的特异性引物，在60-63℃条件下恒温反应60-80min，利用电泳检测或荧光染料方法可以排除南方水稻黑条矮缩病的干扰，鉴定出水稻黑条矮缩病毒植株样品，所述“RT-LAMP反应的特异性引物”是指以下4条引物：

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