CN106350581A - 一种采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其包括以下步骤：(1)提取待测样品DNA：向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的内引物FIP 1μl、40pmol/μl的内引物BIP 1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以阴道加德纳菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCI pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；(3)LAMP反应：将步骤(2)中的PCR管于63℃恒温反应60min；(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

Description

一种采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法

【技术领域】

本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种细菌性阴道炎的检测方法，更具体的，涉及采用LAMP检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法。

【背景技术】

细菌性阴道炎(bacterial vaginosis，简称BV)是一种常见的、复杂的、以正常的阴道菌群改变为特征的临床症候群，它可引起严重的并发症，包括子宫颈炎、子宫内膜炎，也使患者增加感染HIV病毒和早产的风险。以前由于对其认识有限，曾报道过很多名称，如非特异性阴道炎、加德纳菌性阴道炎、阴道嗜血杆菌性阴道炎等。1984年，瑞典专题国际学术会议将其正式命名为细菌性阴道病。BV是育龄妇女最常见的阴道感染性疾病，在妇科门诊中的患病率为18.63％～20％。患者承受巨大的个人痛苦，家庭社会经济负担沉重。

阴道加德纳菌(Gardnerella Vaginalis)在BV的微生物菌群中占绝对优势，含量明显高于其它非正常菌群，是BV的感染原。最新报道阴道加德纳菌能明显刺激HIV病毒在单核-巨噬细胞系统和T淋巴细胞中的表达，与HIV的传播率增高有关。因此，检验受试者样品中阴道加德纳菌是否存在，对于BV的早诊、早治及预防至关重要。

目前对阴道加德纳菌的实验室诊断主要有直接涂片法、革兰氏染色法、分离培养法、免疫荧光法等。而以核酸扩增技术为代表的分子生物学检测方法也逐渐开始应用于阴道加德纳菌的检测和BV诊断中。其中，环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification of DNA，LAMP)是近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法(见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，HaseT.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12)：E63.)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，在链置换DNA聚合酶的作用下恒温扩增，快速实现大量拷贝数的核酸扩增。与变温循环扩增技术相比，等温扩增技术对仪器设备的需求较为简化，同时因为反应不需要变性-复性过程，因而能有效缩短反应时间。上述特点使得LAMP技术能更好地满足细菌性阴道炎门诊检验以及应急或现场检测对检测方法的快速简便性要求。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种采用LAMP检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法。

为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种细菌性阴道炎LAMP检测试剂盒，其包括针对阴道加德纳菌保守区域设计的引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核苷酸序列如下所示：

外引物F3：ATAGCTCTTGGAAACGGGTG(SEQ ID NO：1)

外引物B3：CGCAATATTCCCCACTGCTG(SEQ I D NO：2)

内引物FIP：ACCCCATCCCATGCCACTAAAC-AATGCTGGATGCTCCAACTT(SEQ ID NO：3)

内引物BIP：ACCTAGGCTTCGACGGGTAGC-TGGGCCGTATCTCAGTCC(SEQ ID NO：4)。

优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/μl，所述内引物FIP和所述内引物BIP的浓度均为40pmol/μl。

优选地，所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mM MgSO4和5mM甜菜碱组成。

优选地，所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μl。

优选地，所述核酸染料为1000×SYBR Green I。

优选地，本发明的试剂盒进一步包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。

优选地，所述DNA提取试剂是CTAB抽提缓冲液，其由100mM Tris-HCl pH 8.0、50mMEDTA、1M NaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB组成，pH 7.0-7.5。

在另一个方面中，本发明还提供一种采用上述的LAMP检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA：向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；

(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的内引物FIP 1μl、40pmol/μl的内引物BIP 1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以阴道加德纳菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；

(3)LAMP反应：将步骤(2)中的PCR管于63℃恒温反应60min；

(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

在另一个方面中，本发明还提供了引物在制备细菌性阴道炎LAMP试剂盒中的应用，其中所述引物针对阴道加德纳菌保守区域设计，核苷酸序列如下所示：

外引物F3：ATAGCTCTTGGAAACGGGTG(SEQ ID NO：1)

外引物B3：CGCAATATTCCCCACTGCTG(SEQ ID NO：2)

内引物FIP：ACCCCATCCCATGCCACTAAAC-AATGCTGGATGCTCCAACTT(SEQ ID NO：3)

内引物BIP：ACCTAGGCTTCGACGGGTAGC-TGGGCCGTATCTCAGTCC(SEQ ID NO：4)。

本发明的细菌性阴道炎LAMP检测试剂盒及检测方法具有以下有益效果：

1、高特异性：根据阴道加德纳菌基因的保守区设计四条特异性引物，通过环介导恒温扩增反应判断靶标物质的存在与否，假阳性率低；

2、耗时短：扩增在30-60min内即可完成，快速、高效且产率高；

3、灵敏度高：在复杂体系中可检测到单个细胞的靶目标，最低检测极限达到1pgDNA，标本的检出率达到98％以上；

4、鉴定简便：通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需高端的仪器设备以及繁锁的电泳和紫外观察等步骤。

【具体实施方式】

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1本发明的细菌性阴道炎LAMP检测试剂盒的制备

1.1试剂

引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；Bst DNA聚合酶和10×ThermoPol反应缓冲液购自NEB；SYBR Green I购自Invitrogen；其余PCR试剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。

1.2试剂盒的制备：

获得以下试剂，以制备本发明的细菌性阴道炎LAMP检测试剂盒：

CTAB抽提缓冲液：按照以下配方配制：100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1MNaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB，调整pH值至7.0-7.5；

反应缓冲液：按照以下配方配制：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mMMgSO4、5mM甜菜碱；

引物：外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：I所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。其中外引物F3和外引物B3的浓度为5pmol/μl，内引物FIP和内引物BIP的浓度为40pmol/μl。

浓度为8U/μl的Bst DNA聚合酶；

核酸染料：1000×SYBR Green I；

阳性对照：阴道加德纳菌基因组DNA；

阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。

实施例2

阴道加德纳菌特异性检测

2.1 LAMP特异性检测

待测菌株包括从BV患者阴道分泌物中分离得到的阴道加德纳菌，以及消化链球菌、紫单胞菌和嗜血杆菌各1株。

使用实施例1制备的试剂盒按照以下步骤对阴道加德纳菌进行检测：

(1)提取待测样品DNA：将待测菌株接种于PDA平板上，划线培养后，收集并离心，加入50μl CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；

(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其中四种引物各1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、步骤(1)所得模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以阴道加德纳菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；

(3)LAMP反应：将步骤(2)中PCR管于63℃恒温反应60min；

(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl1000×SYBR GreenI，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。

2.2检测结果

阴道加德纳菌的PCR管中均呈现绿色，而其作菌株的显色结果均为橙色，表明引物具有很强的特异性。

实施例3阴道加德纳菌灵敏度检测

3.1 LAMP灵敏度检测

按照实施例2的步骤(1)提取阴道加德纳菌DNA，并以10倍浓度系列稀释法稀释成100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg共7个梯度。

LAMP反应体系和反应条件以及结果分析同实施例2的步骤(2)-(4)。

3.2检测结果

除了DNA浓度为100fg的PCR管显示橙色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表明本发明的检测方法的最低检测极限达到1pg DNA，灵敏度很高。

Claims (7)

1.一种采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品DNA：向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取DNA；

(2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μl反应体系，其包括5pmol/μl的外引物F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的内引物FIP 1μl、40pmol/μl的内引物BIP 1μl、反应缓冲液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水补充至25μl，并以阴道加德纳菌基因组DNA作为阳性对照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作为阴性对照；

(3)LAMP反应：将步骤(2)中的PCR管于63℃恒温反应60min；

(4)分析判断反应产物结果：在(3)中所得反应产物中加入1μl核酸染料，如反应液颜色为橙色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性；

所述检测试剂盒包括针对阴道加德纳菌保守区域设计的引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核苷酸序列如下所示：

外引物F3：ATAGCTCTTGGAAACGGGTG(SEQ ID NO：1)

外引物B3：CGCAATATTCCCCACTGCTG(SEQ ID NO：2)

内引物FIP：ACCCCATCCCATGCCACTAAAC-AATGCTGGATGCTCCAACTT(SEQ ID NO：3)

内引物BIP：ACCTAGGCTTCGACGGGTAGC-TGGGCCGTATCTCAGTCC(SEQ ID NO：4)。

2.根据权利要求1所述的采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其特征在于：

所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmol/μl，所述内引物FIP和所述内引物BIP的浓度均为40pmol/μl。

3.根据权利要求1所述的采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其特征在于：

所述反应缓冲液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、50mM MgSO4和5mM甜菜碱组成。

4.根据权利要求1所述的采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其特征在于：

所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μl。

5.根据权利要求1所述的采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其特征在于：

所述核酸染料为1000×SYBR Green I。

6.根据权利要求1所述的采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其特征在于：

所述试剂盒包括DNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。

7.根据权利要求6所述的采用检测试剂盒对细菌性阴道炎进行检测的方法，其特征在于：

所述DNA提取试剂是CTAB抽提缓冲液，其由100mM Tris-HCl pH8.0、50mM EDTA、1MNaCl、1％(v/v)β-巯基乙醇、2％CTAB组成，pH 7.0-7.5。