CN105420360A

CN105420360A - 一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒

Info

Publication number: CN105420360A
Application number: CN201510899977.6A
Authority: CN
Inventors: 陈华云; 刘淑园; 陈嘉昌; 刘孝礼; 丁渭; 肖湘文; 黄爽; 曾烨; 彭俊然
Original assignee: GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2016-03-23

Abstract

本发明公开了一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，该试剂盒是一种基因在恒定温度下进行扩增和检测的试剂盒。本发明的恒温扩增反应试剂配合一种双色荧光标记的探针，可以进行快速荧光检测。本发明的恒温扩增体系，真正实现在同一个温度下进行基因扩增反应，反应体系不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在15min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。

Description

一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，特别涉及一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。

背景技术

阴道炎是妇产科患者最常见疾病,每年约有500~1000万女性罹患此病,而75%的妇女在一生中至少患病1次。传统的阴道炎诊断方法主要依赖于患者主诉、阴道检查以及实验室检查。阴道炎的症状缺乏特异性,因此在缺乏实验室确诊依据时,依据患者主诉和其他检查难以确诊。多数阴道炎患者即使反复感染,依然无法确认发病原因,且阴道炎患者多为混合感染,因此阴道炎的确诊十分困难。阴道炎最常见类型为细菌性阴道炎、真菌性阴道炎和滴虫性阴道炎,三者约占所有阴道炎的80%~90%。细菌性阴道炎（BV）是一种由阴道加特纳菌和一些压氧菌的混合感染，导致阴道内微生态平衡失调，引起的阴道分泌物增多，白带有鱼腥臭味及外阴瘙痒灼热的综合征。可分为嗜血杆菌性阴道炎、棒状杆菌阴道炎、压氧菌性阴道病炎、加特纳菌性阴道炎等。本病也可通过性接触传染，在性关系混乱的人群中发病率较高。念珠菌性阴道炎也称霉菌性阴道炎，是由念珠菌感染引起。其发病率仅次于细菌性阴道病。念珠菌性阴道炎多见于幼女、孕妇、糖尿病患者，以及绝经后曾用较大剂量雌激素治疗的患者。滴虫性阴道炎是由毛滴虫引起，寄生人体的毛滴虫有阴道毛滴虫、人毛滴虫和口腔毛滴虫，分别寄生于泌尿生殖系统、肠道和口腔，与皮肤病有关的是阴道毛滴虫，引起滴虫性阴道炎。

长期阴道炎可能导致不孕；影响日常生活的质量；会影响到胎儿的发育，导致早产或者流产；诱发其他疾病，如生殖器感染，盆腔炎、子宫内膜炎、夫妻生活痛等；所以及时检测及定期检测阴道炎致病病原体具有预防和治疗的积极意义。基于病原体DNA直接进行检测，相比涂片敏感性大大提高，可以极大提升阳性检出率。

阴道炎致病病原体DNA的检测常用到传统PCR技术，检测程序需要设置多个循环，每个循环包括核酸的变性、退火、延伸，这导致PCR在技术应用上有几点限制：第一，PCR技术需要昂贵的实验室仪器，同时仪器要具备精细的温度控制程序和加热模板，从而实现很高的温度下的DNA模板链的变性，较低的温度下引物探针退火延伸模板，这样重复温度变化几十个循环之后实现模板量的放大。由于每一个循环时间都较短，仪器必须能快速准确升降温度，这就需要银制或金制的加热模块，增加了仪器研制的成本。第二，PCR扩增体系中的聚合酶必须具有耐受高温的能力，否则必须在每一个循环中重新加入新酶，以实现下一循环的扩增，这样极容易造成污染也加大了成本。第三，在PCR循环中，每一个循环引物退火的时间都很短（几秒到十几秒）这就要求引物必须快速找到模板上同源匹配的区段，以实现延伸。这就要求PCR体系必须有过量的PCR引物。过量的引物会与模板错配，错误引发扩增，引物二聚体等等，进而抑制PCR扩增，特别是在模板量低的情况，会使这种情况加剧。

本发明恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，与传统的PCR技术相比，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。另外，恒温扩增体系有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远远高于传统PCR技术，所用时间更短，最短可以在5min内实现。最后，相对于目前其他恒温扩增技术平台相比，本发明所用的重组酶依赖扩增技术平台是新一代核酸检测的利器，在检测的时效性，便捷性和技术参数等多个方面都优于其它恒温扩增技术平台，通过试剂的有效匹配，甚至可以在人体腋下进行扩增反应。在该技术平台上，除了可以开发基于小型便携式设备用于医疗检测机构如医院急诊科、妇产科、手术室；社区服务中心和基层医疗机构；检验检疫疾病防控机构的分子诊断产品，还可以开发出适合家庭使用的分子诊断产品，使我国不同区域即便存在经济条件参差不齐的情况下，也可以展开全国性病毒性疾病、肿瘤和遗传性疾病的定期和快速普查。这是一个非常巨大的潜在市场，其经济价值和社会效益不可估量。当前我们已经开发适用于医疗机构和家庭使用的HIV检测产品和宫颈癌HPV检测产品。随着平台的不断成熟，可进一步拓展到食品安全、检验检疫、防恐等多个领域。

本发明阴道炎病原体基因即时检测试剂盒将恒温扩增技术应用到阴道炎病原微生物的检测上，缩短了反应时间，降低了体系对反应条件的要求，大大地提高了检测的效率，也不需要人为主观判读结果，同时检测结果不受混合感染的干扰，因此能更准确的提示混合感染的类型，非常有利于临床的快速诊断和对症治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，阴道炎病原体特异性引物及探针。

阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应液的具体组分如下：

品名浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）
	Tris-HCl 50mM
KCl 60mM
	二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
	海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
	BSA 0.1mg/mL

作为上述反应液的进一步改进，Tris-HCl的pH为7.0～9.0，优选pH为8.3。

阴道炎病原体基因即时检测试剂盒启动液的具体组分如下：

品名摩尔浓度
	氯化镁 5mM~20mM

作为上述启动液的进一步改进，氯化镁的优选浓度为10mM。

阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应酶系的具体组分如下：

品名浓度（摩尔浓度/酶浓度/质量浓度）
	dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 100ng/ul
	单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
	上游引物 200nM
下游引物 200nM

作为上述反应酶系的进一步改进，重组酶选自E.coliRecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/Exo∥蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。

阴道炎病原体基因即时检测试剂盒特异性引物及探针序列如下：

上游引物1	GTTCTGAATTTGAATGTGGTATGGGTAGGCTTG（SEQ ID NO：1）
		下游引物1	AGACAAACAGGTTATATATGAGTTTGAGACCA（SEQ ID NO：2）
荧光探针1	TACAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAACAG(FAM-dt)TC (dSpacer) AT (BHQ-dT)TTTTATATTCCTTCCTAG（SEQ ID NO：3）
		上游引物2	CCGGCTCCATTTTGGTGGAGTCGCTTGATCGTTTTG（SEQ ID NO：4）
下游引物2	CCCGTCACGTCCTTCATCGGTCCTGTCTA（SEQ ID NO：5）
		荧光探针2	TATTATGTCTAGAGAGTTAAGCGATAGGC（FAM-dt)TT(dSpacer)TT(BHQ-dT) ACTGGTGTATCACTGTAAGG（SEQ ID NO：6）
上游引物3	TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC（SEQ ID NO：7）
		下游引物3	ACACGCAGCCCTGCTCACGCAGATGGCAACGGC（SEQ ID NO：8）
荧光探针3	TCTCGATGAGAACGCAGCGAAA（FAM-dt)TG(dSpacer)GAT(BHQ-dT)ACG TAATRTAATTGCA（SEQ ID NO：9）

作为本发明方法的进一步改进，恒温扩增的温度为35～42℃，优选扩增温度为37℃。

本发明的有益效果：

本发明的恒温扩增体系，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。

本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在15min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。

本发明的恒温扩增体系使用荧光实时定量技术，应用范围更广，适用于市面上大多数荧光定量扩增仪。

本发明同时检测3种阴道炎常见的致病病原体，其中念珠菌属检测包括6种常见致病念珠菌种：白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌。对比常规检测的培养方法，时间更短，灵敏度高受培养条件限制少，人为误操作几率低。

附图说明：

图1至图9依次分别为实施例1至实施例9的荧光结果图，图中荧光曲线的标号对应实施例中反应管的标号。

具体实施方式

一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，采用了一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。试剂盒成分包括反应液，启动液，反应酶系，阴道炎病原体特异性引物及探针，各成分的具体组分如下：

阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应液的具体组分如下：

品名浓度（摩尔浓度/质量分数/质量浓度）
	Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
	二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
	海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
	BSA 0.1mg/mL

阴道炎病原体基因即时检测试剂盒启动液的具体组分如下：

品名摩尔浓度
	氯化镁 10mM

下面结合具体的实验，进一步说明阴道炎病原体基因即时检测试剂盒的优势，但并非限制本发明。

实验样本来源：

以阴道炎患者阴道分泌物中分离的阴道滴虫、阴道加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌经提取得到的核酸溶液作为样本；

以混合感染阴道滴虫-阴道加德纳菌、阴道滴虫-白色念珠菌、阴道加德纳菌-白色念珠菌的患者阴道分泌物提取得到的核酸溶液作为混合感染样本；

以外购金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株经提取得到的核酸溶液作为特异性实验的样本；

以正常人阴道分泌物提取物为阴性对照样本。

实施例1（8种阴道炎常见的致病病原体的检测）：

取11个200ul反应管，分别标记为反应管1~11。在反应管1~11中分别加入20ul反应液、5ul反应酶系；在反应管1、2中加入上游引物1（200nM）、下游引物1（200nM）、荧光探针1（150nM）；在反应管3、4中加入上游引物2（200nM）、下游引物2（200nM）、荧光探针2（150nM）；在反应管5~11中加入上游引物3（200nM）、下游引物3（200nM）、荧光探针3（150nM）。在反应管1中加入阴道滴虫样本2ul，反应管3中加入阴道加德纳菌样本2ul、反应管5~10分别加入白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌样本2ul，反应管2,、4、11都分别加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。

实施例2（非最优扩增温度条件的检测）：

同实施例1，不同处在于上机条件改为：35℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图2。

实施例3（非最优扩增温度条件的检测）：

同实施例1，不同处在于上机条件改为：42℃，30s，30个循环，每个循环都收集荧光。结果如图3。

实施例4（特异性实验）：

按照实施例1配制体系34管，分别标记1~31反应管。在1~13反应管的体系中加入上游引物1（200nM）、下游引物1（200nM）、荧光探针1（150nM）；在14~26反应管的体系中加入上游引物2（200nM）、下游引物2（200nM）、荧光探针2（150nM；在27~34反应管的体系中加入上游引物3（200nM）、下游引物3（200nM）、荧光探针3（150nM）。在1~13号反应管中按顺序分别加入阴道滴虫、加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌、金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体样本2ul；在14~26号反应管中按顺序分别加入加德纳菌、阴道滴虫、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌、金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体的样本2ul；在27~34号反应管中按顺序分别加入白色念珠菌、阴道滴虫、加德纳菌、金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图4。

实施例5（阴道滴虫重复性实验）：

按实施例1配制体系6管，分别标记反应管1~6。在反应管1~6中加入上游引物1（200nM）、下游引物1（200nM）、荧光探针1（150nM）。在反应管1~3中均加入阴道滴虫样本2ul，在反应管4~6中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图5。

实施例6（阴道加德纳菌重复性实验）：

按实施例1配制体系6管，分别标记反应管1~6。在反应管1~6中加入上游引物2（200nM）、下游引物2（200nM）、荧光探针2（150nM）。在反应管1~3中均加入阴道加德纳菌样本2ul，在反应管4~6中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图6。

实施例7（阴道滴虫和加德纳菌混合感染检测）：

按实施例1配制体系6管，分别标记反应管1~6。在反应管1、2中加入上游引物1（200nM）、下游引物1（200nM）、荧光探针1（150nM）；在反应管3、4中加入上游引物2（200nM）、下游引物2（200nM）、荧光探针2（150nM）；在反应管5、6中加入上游引物3（200nM）、下游引物3（200nM）、荧光探针3（150nM）。在反应管1、3、5中均加入阴道滴虫和加德纳菌混合感染样本2ul；在反应管2、4、6中均加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul，振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液（各管的终体积为50ul）。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图7。

实施例8（阴道滴虫和白色念珠菌混合感染检测）：

同实施例7，不同处是往反应管1、3、5中均加入阴道滴虫和白色念珠菌混合感染样本2ul。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图8。

实施例9（加德纳菌和白色念珠菌混合感染检测）：

同实施例7，不同处是往反应管1、3、5中均加入加德纳菌和白色念珠菌混合感染样本2ul。

选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光，结果如图9。

结论：

1.从图1的结果可以看出，对应的病原体样本扩增结果都有“S”型扩增曲线，说明本发明试剂盒的恒温扩增效果好。

2.从图2、3的结果可以看出，即使不是在最适温度下进行扩增反应，仍然得到稳定的阳性结果，说明本发明试剂盒的容错率高、稳定性强。

3.从图4的结果可以看出，非本试剂盒检测范围内的其他阴道内微生物（金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体）不会产生假阳性结果，且本试剂盒可检测的阴道滴虫、阴道加德纳菌、6种念珠菌属的检测相互之间不产生干扰，说明本试剂盒的特异性强。

4.从图5、6的结果可以看出，对阴道滴虫和阴道加德纳菌进行了重复实验，均得到相应的“S”型扩增曲线，说明本试剂盒的灵敏度高。

5.从图9的结果可以看出，混合感染型的样本中不同致病病原体相互之间不造成干扰，检测结果无误，说明本试剂盒的特异性好、稳定性强。

综上，本发明试剂盒的扩增效果好，特异性强，容错率高，稳定性强，灵敏度高。

<110>广州和实生物技术有限公司

<120>一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒

<130>

<160>9

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gttctgaatttgaatgtggtatgggtaggcttg33

<210>2

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<213>人工序列

<400>9

tctcgatgagaacgcagcgaaatggatacgtaatrtaattgca43

Claims

1.一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，其反应液组成如下：

Tris-HCl50mM

KCl60mM

二硫苏糖醇2mM

甜菜碱1M

海藻糖5.5%

PEG5.5%

BSA0.1mg/mL。

2.根据权利要求1所述的一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，其启动液组成如下：

氯化镁5mM~20mM。

3.根据权利要求1所述的一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，其反应酶系组成如下：

dNTPs200uM

聚合酶Bsu50U

单链结合蛋白262ng/ul

重组酶（E.coliRecT）360ng/ul

上游引物200nM

下游引物200nM

重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。

4.根据权利要求3所述的一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，所采用的上游引物、下游引物和荧光探针，其特征在于：

检测阴道滴虫的上游引物的序列为：GTTCTGAATTTGAATGTGGTATGGGTAGGCTTG；下游引物的序列为：AGACAAACAGGTTATATATGAGTTTGAGACCA；荧光探针序列为：TACAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAACAG(FAM-dt)TC(dSpacer)AT(BHQ-dT)TTTTATATTCCTTCCTAG；

检测阴道加德纳菌的上游引物序列为：CCGGCTCCATTTTGGTGGAGTCGCTTGATCGTTTTG；下游引物的序列为：CCCGTCACGTCCTTCATCGGTCCTGTCTA；荧光探针序列为：TATTATGTCTAGAGAGTTAAGCGATAGGC（FAM-dt)TT(dSpacer)TT(BHQ-dT)ACTGGTGTATCACTGTAAGG；

检测念珠菌属的上游引物的序列为：TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC；下游引物的序列为：ACACGCAGCCCTGCTCACGCAGATGGCAACGGC；荧光探针序列为：TCTCGATGAGAACGCAGCGAAA（FAM-dt)TG(dSpacer)GAT(BHQ-dT)ACGTAATRTAATTGCA。

5.根据权利要求1所述的一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，其特征在于：Tris-缓冲液的pH为7.0～9.0，优选pH为8.3。

6.根据权利要求3所述的一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，其特征在于：重组酶选自E.coliRecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/Exo∥蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。

7.根据权利要求1-6所述的一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，其特征在于：恒温扩增的温度为35～42℃，优选扩增温度为37℃。

8.根据权利要求1-3所述的一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒，其特征在于用氯化镁作为反应的启动液，浓度为5mM~20mM，优选浓度为10mM。