CN106834438A - 即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒 - Google Patents

即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒。该发明的恒温检测试剂盒，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。其中的关键组分包括有dNTPs、聚合酶Bsu、单链结合蛋白、重组酶（E.coli RecT）。本发明亦可基于恒温扩增反应试剂配合一种荧光标记的探针，可以进行即时荧光检测。本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在30 min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。

Description

即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，特别涉及一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。
背景技术
单核增生性李斯特菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单核增生性李斯特菌的携带率为0.6-16%，有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。一旦感染，轻则出现发烧、肌肉疼痛、恶心、腹泻等症状，重则出现头痛、颈部僵硬、身体失衡和痉挛等症状。受感染的孕妇可能出现早产、流产和死产，婴儿健康也可能受影响。因此，对食品中单核增生性李斯特菌的检测关系到人体的健康安全，急需要一种能即时检测出单增李斯特菌的方法。
单核增生性李斯特菌常用的检测方法有免疫金标试纸条法及聚合酶链式反应法，其中免疫金标试纸条法操作简单，检测结果快速且直观，但存在着灵敏度不足的缺点；而聚合酶链式反应法，在灵敏度和特异性等方面有优势，但存在着需要检测耗时较长，对检测人员的技术要求比较高等缺点。
与上述两种办法相比，本发明所运用的恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。另外，恒温扩增体系有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远远高于传统PCR技术，所用时间更短，最短可以在5min内实现。由于恒温扩增技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其在项目上的应用越来越广泛。将恒温扩增技术应用在食品安全中单增李斯特菌的检测上，让单增李斯特菌的检测过程更加简便快捷。
发明内容
本发明的目的在于一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，单增李斯特菌hlyA基因特异性引物。
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒反应液的具体成分如下：
Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒启动液的具体组分如下：
氯化镁 10mM
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒反应酶系的具体组分如下：
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒特异性引物序列如下：
上游引物：CAACATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCC
下游引物：TGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGAC
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒特异性探针序列如下：
CGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAG(FAM-dt)A(dSpacer)A(BHQ-dT)ACAAGGATTGGATTACA
本发明的有益效果：
本发明的恒温扩增体系，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。
本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在30min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。
附图说明：
图1、图2、图3和图4为对应实施例的结果图，图中标记的编号即为对应反应管编号。
具体实施方式
下面结合具体的实验，进一步说明快速检测单增李斯特试剂盒的优势。
本发明的目的在于一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，单增李斯特菌hlyA基因特异性引物。各组分的具体成分如下：
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒反应液的具体成分如下：
Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒启动液的具体组分如下：
氯化镁 10mM
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒反应酶系的具体组分如下：
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒特异性引物序列如下：
上游引物：CAACATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCC
下游引物：TGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGAC
即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒特异性探针序列如下：
CGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAG(FAM-dt)A(dSpacer)A(BHQ-dT)ACAAGGATTGGATTACA
下面结合具体的实验，进一步说明即时检测单核增生性李斯特菌试剂盒的优势，但并非限制本发明。
实验样本来源：
以单核增生性李斯特菌经培养后提取得到的核酸溶液作为样本；
以沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌经放大培养后提取得到的核酸溶液作为特异性实验的样本；
以混合感染沙门氏菌-单核增生性李斯特菌、大肠杆菌-单核增生性李斯特菌的奶制品经放大培养后提取得到的核酸溶液作为混合感染实验的样本；
以灭菌纯水为阴性对照样本。
实施例1（灵敏度实验）：
本实施例将单核增生性李斯特菌核酸按照10倍、100倍、1000倍、10000倍稀释，将稀释后的核酸依次标记为样本1、样本2、样本3、样本4，其浓度分别是10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul，用灭菌纯水作为阴性对照。取5个200ul反应管，依次标记为反应管1~5，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~5中，在反应管1中加入2ul 样本1，在反应管2中加入2ul 样本2，依次类推，反应管5加入2ul灭菌纯水，最后用灭菌纯水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。
选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。
反应结束后，从反应管1~5中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图1.
实施例2（特异性实验）：
本实施例将单核增生性李斯特菌核酸、沙门氏菌核酸、大肠杆菌核酸、志贺氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸依次标记为样本1、样本2、样本3、样本4，样本5，其浓度均为10ng/ul。取5个200ul反应管，依次标记为反应管1~5，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~5中，在反应管1中加入2ul 样本1，在反应管2中加入2ul 样本2，依次类推，最后用灭菌纯水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。
选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。
反应结束后，从反应管1~5中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图2.
实施例3（混合感染实验）：
本实施例将沙门氏菌-单核增生性李斯特菌核酸、大肠杆菌-单核增生性李斯特菌核酸依次标记为样本1、样本2，其浓度均为10ng/ul。取3个200ul反应管，依次标记为反应管1~3，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~3中，在反应管1中加入2ul 样本1，在反应管2中加入2ul 样本2，反应管3加入2ul灭菌纯水，最后用灭菌纯水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。
选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。
反应结束后，从反应管1~3中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图3.
实施例4（荧光检测实验）
本实施例通过在反应体系中加入特异性荧光探针，通过收集荧光信号快速获得检测结果。将单核增生性李斯特菌核酸标记为样本1，其浓度为1ng/ul。取两个200ul反应管，分别标记为反应管1跟反应管2，并加入20ul反应液、5ul反应酶系到管子，在反应管1中加入特异性荧光探针30nM和2ul样本1，反应管2中加入特异性荧光探针30nM和灭菌纯水，最后用灭菌纯水将反应管1和2补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。
选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光，具体上机条件为：37℃，30s，30个循环，每个循环都搜集荧光。
结论：
1.从图1的结果可以看到，单核增生性李斯特菌核酸浓度在10ng/ul、1ng/ul跟0.1ng/ul在200bp处有清晰的目的条带，浓度0.01ng/ul有较弱的目的条带，说明本发明试剂盒扩增效果好，灵敏度高。
2.从图2的结果可以看到，仅在样本1即单核增生性李斯特菌核酸在200bp处有扩增条带，其余样本无非特异性条带，说明本发明试剂盒扩增的特异性好，能准确的区分所检测的目的菌与其他食品常见菌。
3.从图3的结果可以看到，混合感染样本1跟2在200bp处有扩增条带，说明样本中不同核酸对本发明试剂盒的检测不造成干扰，说明本发明试剂盒特异性好，稳定性高。
4.从图4的结果可以看出，反应管1有“S”型扩增曲线，反应管2没有扩增曲线，说明本发明试剂盒的阴阳性恒温扩增效果好。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州和实生物技术有限公司
<120> 一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒
<130> 2016
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caacatctcc gcctgcaagt cctaagacgc c 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtattagta taccacggag atgcagtgac 30
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgaaaagaaa cacgcggatg aaatcgataa gaaacaagga ttggattaca 50

Claims (9)

1.一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其反应液组成如下：
Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL
反应酶系和启动液各适量。
2.根据权利要求1所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其启动液组成如下：
氯化镁 10mM。
3.根据权利要求1所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其反应酶系组成如下：
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
荧光探针（如果需要） 30nM
重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。
4.根据权利要求3所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，所采用的上游引物跟下游引物，其特征在于上游引物序列为：CAACATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCC；
下游引物序列为：TGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGAC。
5.根据权利要求1所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，基于恒温扩增反应试剂配合一种双色荧光标记的探针，可以进行即时荧光检测，所采用的荧光探针，其特征在于荧光探针序列为：CGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAG(FAM-dt)A(dSpacer)A(BHQ-dT)ACAAGGATTGGATTACA。
6.根据权利要求1所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：Tris-缓冲液的pH为7～9，优选pH为8.3。
7.根据权利要求3所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。
8.根据权利要求1-6所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：恒温扩增的温度为37～42℃，优选扩增温度为37℃。
9.根据权利要求1-3所述的一种即时检测单核增生性李斯特菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于用氯化镁作为反应的启动液，浓度为5mM~20mM，优选浓度为10mM。
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