CN114196769B - 一种用于检测沙门氏菌的引物、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于检测沙门氏菌的引物、试剂盒及其使用方法，属于细菌检测领域。解决了现有技术中沙门氏菌的检测方法，检测灵敏度低、准确性低、易出现假阴性与假阳性结果、成本高的问题。本发明的试剂盒，包括沙门氏菌菌属保守基因invA、肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E、鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物，以及探针SC‑E6、探针SC‑E6‑TM。该用于检测沙门氏菌的试剂盒，具有很高的检测准确性和灵敏度，且操作便捷，成本低，能够避免检测过程中发生气溶胶污染。
Description
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种用于检测沙门氏菌的引物、试剂盒及其使用方法。
背景技术
沙门氏菌作为一种食源性致病菌，可对肉、蛋、奶等食物造成污染，极大威胁着人类和动物的健康。目前，沙门氏菌感染已被认为是世界范围内的一个主要公共卫生问题。因此，针对沙门氏菌的检测及精准分型在食品安全和标准的微生物分析中是一个非常重要的挑战。
现有的检测沙门氏菌的方法主要有选择性培养基培养观察法、基于免疫的检测方法和基于核酸的检测方法。培养观察法一般历时3-4天才能完成，且易出现假阳性或假阴性结果；基于免疫的检测方法主要为酶联免疫吸附试验(ELISA)，该方法大大提高了检测的特异性，但是检测灵敏性不足；而基于核酸的检测方法目前主要基于聚合酶链式反应(PCR)原理，该方法与其他两种方法相比特异性和敏感性相对有所提高，但是仍有假阴性与假阳性结果出现，这无形中造成检测时间过长、检测成本偏高现象。此外，环介导等温扩增(LAMP)自研发出来以来，因其操作简单、扩增效率高的特点，被广泛应用于病原菌的检测。但是这种检测方法仍存在一定问题，比如反应体系中容易产生副产物从而导致假阳性问题，另外在反应过程中如需开盖进行操作，会将扩增产物直接暴露于环境中，导致扩增子气溶胶污染问题。因此，亟需研发者开发出一种高灵敏度、高特异性、高准确性，且真操作便捷、低成本的沙门氏菌检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明为解决现有技术中沙门氏菌的检测方法，检测灵敏度低、准确性低、易出现假阴性与假阳性结果、成本高的问题，提供了一种用于检测沙门氏菌的引物、试剂盒及其使用方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下。
本发明提供一种沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的SCON-F3、SCON-B3、SCON-FIP、SCON-BIP和SCON-LP；
所述SCON-F3的序列为CGTCATTCCATTACCTACCT；
所述SCON-B3的序列为CAATCAAGATAAGACGACTGG；
所述SCON-FIP的序列为GAACGACCCCATAAACACCAATTGGTTGATTTCCTGATCGC；
所述SCON-BIP的序列为TGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGACTGATCGATAATGCCAGAC；
所述SCON-LP的序列为ATCGCCAGTACGATATTCAGT。
本发明还提供一种含有上述沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物的用于检测沙门氏菌的试剂盒，还包括探针SC-E6；
所述探针SC-E6，包括摩尔比为1:1:1:1或1:2:2:1或1:3:3:1的SC-E6-1、SC-E6-2、SC-E6-3和SC-E6-4；
所述SC-E6-1的序列为5′-ROX-CGACGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-Inverted dT；
所述SC-E6-2的序列为5′-BHQ1-GAACAATGCAACGCCCGGGGAGGAGTCCCTGCTCCCTCACGCTCTTTCGTCG-BHQ2；
所述SC-E6-3的序列为5′-ACTGTTAATTACGAGGGAGCAGGGACTCCTCTTAGAGCG-Inverted dT；
所述SC-E6-4的序列为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTGTTC-FAM。
进一步的，还包括肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物；
所述肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物包括物质的量比为1:1:4:4:2的E6E-F3、E6E-B3、E6E-FIP、E6E-BIP和E6E-LP；
所述E6E-F3的序列为AGCAATGGTTGGGTTCGG；
所述E6E-B3的序列为GCCCTGTACACTGCATCC；
所述E6E-FIP的序列为GCACCCTTGCATCTACAGCAGGCAGGGGCACAATAACCGTAA；
所述E6E-BIP的序列为TAGCTCGACCAAAGTGACGGTGTCACAACATTCCATGAGCCA；
所述E6E-LP的序列为ACCGATGAGCGCCTCTCCGG。
进一步的，所述SC-E6探针的制备方法为：以5μL 10μmol/L SC-E6-1计，按SC-E6探针的组成取相应各组分，与10μL等温扩增缓冲液混合，并用去离子水补齐至100μL，混合均匀，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃，得到SC-E6探针；
所述等温扩增缓冲液由0.2M Tris、0.1M(NH4)2SO4、0.5M KCL、0.02M MgSO4和0.4gTween-20组成。
本发明还提供一种含有上述沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物的用于检测沙门氏菌的试剂盒，还包括探针SC-E6-TM；
所述探针SC-E6-TM，包括摩尔比为1:1:1:1:1:1或1:1:1:2:2:2或1:1:1:3:3:3的SC-E6-TM-1、SC-E6-TM-2、SC-E6-TM-3、SC-E6-TM-4、SC-E6-TM-5和SC-E6-TM-6；
所述SC-E6-TM-1的序列为5′-BHQ1-CAATGCAACGCCGCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCACGCTCTTTCgtcg-BHQ1；
所述SC-E6-TM-2的序列为5′-ACTGTTAATTACCGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAAGCGGCCGCTTCTTG-Inverted dT；
所述SC-E6-TM-3的序列为5′-BHQ2-GTTTAGTCAGCTCTTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGCCGGTTAGAGCG-Inverted dT；
所述SC-E6-TM-4的序列为5′-VIC-cgacGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-Inverted dT；
所述SC-E6-TM-5的序列为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTG-FAM；
所述SC-E6-TM-6的序列为5′-TAAGTTTTACCGAACAAGAAGCGGCCGAGCTGACTAAAC-ROX。
进一步的，还包括肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物、鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物中的一种或两种；
所述肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的E6E-F3、E6E-B3、E6E-FIP、E6E-BIP和E6E-LP；
所述E6E-F3的序列为AGCAATGGTTGGGTTCGG；
所述E6E-B3的序列为GCCCTGTACACTGCATCC；
所述E6E-FIP的序列为GCACCCTTGCATCTACAGCAGGCAGGGGCACAATAACCGTAA；
所述E6E-BIP的序列为TAGCTCGACCAAAGTGACGGTGTCACAACATTCCATGAGCCA；
所述E6E-LP的序列为ACCGATGAGCGCCTCTCCGG；
所述鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的TMDH-F3、TMDH-B3、TMDH-FIP、TMDH-BIP和TMDH-LP；
所述TMDH-F3的序列为CGCTGGATATCATCCGCTC；
所述TMDH-B3的序列为TTCGCCTCGACGACTTCA；
所述TMDH-FIP的序列为GAATCGTCACGCCGGAGTGCGCTGAAAGGTAAGCTGCCA；
所述TMDH-BIP的序列为GCTGTCGCAGATTCCAGGCGACCGGCGTTCTGAATACGT；
所述TMDH-LP的序列为CCGCCAATCACCGGCACTTCAACTTCCGT。
进一步的，所述SC-E6-TM探针的制备方法为：以5μL 10μmol/L SC-E6-TM-1计，按SC-E6-TM探针的组成取相应各组分，与10μL等温扩增缓冲液混合，并用去离子水补齐至100μL，混合均匀后，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃，得到SC-E6-TM探针；
所述等温扩增缓冲液由0.2M Tris、0.1M(NH4)2SO4、0.5M KCL、0.02M MgSO4和0.4gTween-20组成。
本发明还提供上述用于检测沙门氏菌的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一、将1μL的待测物、检测液、1.5μL的10mmol/L dNTPs、0.5μL的100mmol/LMg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱于250μL离心管中并用去离子水补齐体积至21μL，充分混匀，得到样品；
所述待测物为含有沙门氏菌菌属保守基因invA的pUC57-invA质粒、含有肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的pUC57-prot6E质粒、含有鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的pUC57-mdh质粒或从待测样品中提取的基基因组DNA；
所述检测液包括1.5μL的沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物，还包括1.5μL的肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物和1.5μL的鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物中的一种或两种；
所述1.5μL的沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物包括5μM SCON-F3、5μMSCON-B3、20μM SCON-FIP、20μM SCON-BIP和10μM SCON-LP；
所述1.5μL的肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物包括5μM E6E-F3、5μM E6E-B3、20μM E6E-FIP、20μM E6E-BIP和10μM E6E-LP；
所述1.5μL的鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物包括5μM TMDH-F3、5μM TMDH-B3、20μMTMDH-FIP、20μMTMDH-BIP和10μM TMDH-LP；
步骤二、将样品放入PCR仪保持95℃2min，以每秒降温0.1℃的速度降温至4℃保持2min以上，加入2.5μL SC-E6探针或SC-E6-TM探针，最后加入1.5μL 8U Bst 2.0聚合酶(专门生物催化合成脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一类酶)，混匀，转移20μL至荧光定量PCR管或八连排中，然后将荧光定量PCR管或八连排置于实时荧光定量PCR仪的样品槽，设置温度条件55℃，荧光信号采集时间间隔为1min，连续采集90次。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的用于检测沙门氏菌的引物、试剂盒和使用方法，可单独或同时检测三个沙门氏菌基因位点，有效辨别鼠伤寒沙门氏菌和肠道沙门氏菌肠炎血清型。在原理上满足沙门氏菌的检测，具有很高的检测准确性和灵敏度，避免诊断假阳性与假阴性的发生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明的用于检测沙门氏菌的试剂盒1的原理图；
图2为本发明的用于检测沙门氏菌的试剂盒2的原理图；
图3为本发明实施例1的以pUC57-invA质粒为待测物时的LAMP扩增结果；
图4为本发明实施例2的以pUC57-prot6E质粒为待测物时的LAMP扩增结果；
图5为本发明实施例3的以pUC57-mdh质粒为待测物时的LAMP扩增结果；
图6为本发明实施例4的SC-E6探针的native-PAGE结果；
图7为本发明实施例5的SC-E6探针的摩尔比例优化结果；
图8为本发明实施例6的以沙门氏菌的invA和prot6E基因的DNA序列为待测物时的LAMP特异性检测结果；
图9为本发明实施例6的以沙门氏菌ATCC 13076基因组DNA为待测物时的LAMP检测结果；
图10为本发明实施例7的SC-E6-TM探针native-PAGE结果；
图11-13为本发明实施例8的SC-E6-TM探针的摩尔比例优化结果；
图14-16为本发明实施例9的以沙门氏菌的invA、prot6E和mdh基因的DNA序列为待测物时的LAMP特异性检测结果；
图17为本发明实施例9的以沙门氏菌ATCC 13076基因组DNA和沙门氏菌ATCC14028基因组DNA为待测物时的LAMP检测结果。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。
本发明的用于检测沙门氏菌的试剂盒，针对的是沙门氏菌菌属共有保守基因invA、肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E和鼠伤寒沙门杆菌特异表达基因mdh。
invA基因的部分序列为：GCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTATCTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTACTTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATT。
prot6E基因序列为：GGAGGGAGTGACAGCGTCATGATGCGGGTGAACGGTCAGGCGTCAACTAATGGTCCGCTGTTCTGGCTGGAGAATGGCGGACAGCGGGTGAAGCTGACGGGGGCAAAAAGTGATGCCTTCTGCATCTCCCCCACCGCCCCGAACAGGTGTGAGCTTCGTCCGGTGACGATATCCGGCGAACTCCCCGGAGAGATATTGATGCGACGGTGGTCTTTGATGTGGTTTATCCGCAGTAGGTAGCCAGTATAAATCGCCCGGCGTGGGTTAAGCGCACCACAATATGCGAATGAACCGTGTCGATAACAACGGACAAAACTGTACAGGAATGATTATGAAACCGATTTCTTATTTTACCGGGAGCAGAAAACGCAGCAGCACATGTCTGATATCGTCGTTGCTGCTTCCGGGAATGACAGCCATGGGTATTTCACTTCCCGGCACCGCAGCAATGGTTGGGTTCGGGGGAGACTATACCTACAGGGGCACAATAACCGTAACCGGAGAGGCGCTCATCGGTCCTGCTGTAGATGCAAGGGTGCCTAAGGTTAGTGTGACTCTCTGTAGCTCGACCAAAGTGACGGTGGAACAATGCAACGCCCGGTTAGAGCGCAAAAATCAGGATGGCTCATGGAATGTTGTGACAGGGATGCAGTGTACAGGGCAAAATAGCAATAATTTAAGTGTGGTGACCCCCATCTCAAAAATCTATAAGCTCGTGTACGGCGATTTCTACCGTGTCGTTTTTATGAATGTGAGGGCGAGGTTTGAACCAAGTGGAGCAGCTGAGCATGGTTCGCGTTGTTTTGTTGAAAAACAAAGCTACAGCTATGGGAATCCTGTCAGTGGAGGAGTACTGGAGTTGAGTACATTGTCAGGTCAAACTGAACGTTTGGCTGCCTATGGCCAGCACGAGACGACATTCTTGATGCCAGTCACTGCGGTCGATAAAACTTATATCGAATACCCGACCATGACCCGGTTGAGTGTTGCTCCCGACGGAAGCGCGCGCGGACAGGTAGTCACCGTTGTGGGTCGTAACGCACAAGTGAAATTTACCCTGAGGGAGGCTTATGGTAATAATAATTTGGGGCAGTATTGGATACCAACGGCTGCTAGCGGGAGTAAAATTAAACCGCAGTTGATAAAAAAGGACGGATCACAATGTGTCAATGCCCGTGAAGGGGAGTCATGTGACCTTTATTATCCACCGGGATCTGTACCTCCAGGACGATACTACCGCGGCTATGTGGACATTTACGCCACGGTATATTGACGTCACGGTGAAATAATCCGGGAGCAATTTCAGCTATTCCCGAGCTTATGCTCACATTTTCTCATGGAGACCGGAATTGTCGGCACTGGCATCTTTCACCGGATAACAAAGCGGGTCAAAAATGCATAAATCTTATTCAGCGAGCTGCTCAAATGTTATTACCCGACCTCAATGGATGTTATTGGGTATATCCTTCCATGGAAATACGCAATGAGAAGGCGCTGTTTTTATTTACATACAAAGAGTAACTCCGGTTTATGAGT。
mdh基因序列为：GCCAAAATTGCGCGACTCCGCATTCTTGATGAGTGAGGATTGTAATCATTGAATTTGTGAATTAAGGTCGCCGCCGCGGAGCAATAGACACTTAGCTAATCATATAATAAGGAGTTTAGGATGAAAGTCGCAGTCCTCGCCGCTGCTGGTGGTATCGGTCAGGCGCTGGCATTACTTTTAAAAAACCAACTGCCTTCAGGTTCAGAACTCTCCCTGTACGACATCGCTCCAGTGACTCCCGGTGTGGCCGTTGATTTGAGCCACATCCCCACCGCTGTAAAAATCAAAGGTTTCTCCGGTGAAGACGCAACCCCGGCGCTTGAAGGCGCTGACGTAGTACTGATTTCTGCGGGTGTGGCGCGTAAGCCGGGTATGGACCGTTCCGACCTGTTTAACGTTAACGCCGGCATCGTGAAAAACCTGGTGCAGCAGATCGCTAAAACCTGCCCGAAAGCGTGCGTGGGCATTATCACCAACCCGGTGAACACCACCGTTGCGATTGCGGCGGAAGTGCTGAAAAAAGCAGGCGTATACGACAAAAACAAACTGTTTGGCGTTACCACGCTGGATATCATCCGCTCTAATCCCTTTGTTGCAGAGCTGAAAGGTAAGCTGCCAACGGAAGTTGAAGTGCCGGTGATTGGCGGGCACTCCGGCGTGACGATTCTGCCGCTGCTGTCGCAGATTCCAGGCGTAAGTTTTACCGAACAAGAAGCGGCCGAGCTGACTAAACGTATTCAGAACGCCGGTACTGAAGTCGTCGAGGCGAAAGCCGGCGGCGGATCGGCAACCCTCTCTATGGGCCAGGCTGCCGCGCGTTTCGGTGTTTCTCTGGTTCGCGCTCTGCAGGGCGAGAAGGGCGTGGTGGAATGCGCCTATGTGGAAGGCGACGGTCAGTATGCCCGTTTCTTCTCTCAGCCGCTGCTGCTGGGTAAAAACGGCGTAGAAGAGCGTAAATCCATCGGCACACTGAGCGCTTTCGAGCAACATTCGCTGGACGCTATGCTGGATACGCTGAAAAAAGATATTCAGTTGGGTGAAGAAATTATTAATAAATAAGCTGTTCCTGCCCGATGCCGGGGCTTTTGCTCCGGCTTCTTTACATGTAAACAAGCCACGAAA。
本发明的沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的SCON-F3、SCON-B3、SCON-FIP、SCON-BIP和SCON-LP；SCON-F3的序列为CGTCATTCCATTACCTACCT；SCON-B3的序列为CAATCAAGATAAGACGACTGG；SCON-FIP的序列为GAACGACCCCATAAACACCAATTGGTTGATTTCCTGATCGC；SCON-BIP的序列为TGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGACTGATCGATAATGCCAGAC；SCON-LP的序列为ATCGCCAGTACGATATTCAGT。
本发明的肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的E6E-F3、E6E-B3、E6E-FIP、E6E-BIP和E6E-LP；E6E-F3的序列为AGCAATGGTTGGGTTCGG；E6E-B3的序列为GCCCTGTACACTGCATCC；E6E-FIP的序列为GCACCCTTGCATCTACAGCAGGCAGGGGCACAATAACCGTAA；E6E-BIP的序列为TAGCTCGACCAAAGTGACGGTGTCACAACATTCCATGAGCCA；E6E-LP的序列为ACCGATGAGCGCCTCTCCGG。
本发明的鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的TMDH-F3、TMDH-B3、TMDH-FIP、TMDH-BIP和TMDH-LP；TMDH-F3的序列为CGCTGGATATCATCCGCTC；TMDH-B3的序列为TTCGCCTCGACGACTTCA；TMDH-FIP的序列为GAATCGTCACGCCGGAGTGCGCTGAAAGGTAAGCTGCCA；TMDH-BIP的序列为GCTGTCGCAGATTCCAGGCGACCGGCGTTCTGAATACGT；TMDH-LP的序列为CCGCCAATCACCGGCACTTCAACTTCCGT。
上述技术方案中，用于检测沙门氏菌菌属共有保守基因invA、肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E和鼠伤寒沙门杆菌特异表达基因mdh的LAMP扩增引物均可通过Primer Explorer V5软件设计。
本发明的可分别或同时检测沙门氏菌菌属保守基因invA和肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的探针组合SC-E6，包括摩尔比为1:1:1:1或1:2:2:1或1:3:3:1的SC-E6-1、SC-E6-2、SC-E6-3和SC-E6-4；SC-E6-1的序列为5’端修饰ROX荧光，3’端修饰InverteddT的核酸序列，具体为5′-ROX-CGACGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-Inverted dT；SC-E6-2的序列为5’端修饰BHQ1，3’端修饰BHQ2的核酸序列，具体为5′-BHQ1-GAACAATGCAACGCCCGGGGAGGAGTCCCTGCTCCCTCACGCTCTTTCGTCG-BHQ2；SC-E6-3的序列为3’端修饰Inverted dT的核酸序列，具体为5′-ACTGTTAATTACGAGGGAGCAGGGACTCCTCTTAGAGCG-Inverted dT；SC-E6-4的序列为3’端修饰FAM荧光的核酸序列，具体为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTGTTC-FAM。
上述技术方案中，SC-E6探针的制备方法为：以5μL 10μmol/L SC-E6-1计，按SC-E6探针的组成取相应各组分，与10μL等温扩增缓冲液混合，并用去离子水补齐至100μL，混合均匀，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃，得到SC-E6探针；其中，等温扩增缓冲液由0.2M Tris、0.1M(NH4)2SO4、0.5M KCL、0.02M MgSO4和0.4g Tween-20组成。
本发明的可分别或同时检测沙门氏菌菌属保守基因invA、肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E和鼠伤寒肠沙门氏菌特异表达基因mdh的探针组合SC-E6-TM，包括摩尔比为1:1:1:1:1:1或1:1:1:2:2:2或1:1:1:3:3:3的SC-E6-TM-1、SC-E6-TM-2、SC-E6-TM-3、SC-E6-TM-4、SC-E6-TM-5和SC-E6-TM-6；SC-E6-TM-1的序列为5’端修饰BHQ1，3’端修饰BHQ1的核酸序列，具体为5′-BHQ1-CAATGCAACGCCGCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCACGCTCTTTCgtcg-BHQ1；SC-E6-TM-2的序列为3’端修饰Inverted dT的核酸序列，具体为5′-ACTGTTAATTACCGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAAGCGGCCGCTTCTTG-Inverted dT；SC-E6-TM-3的序列为5’端修饰BHQ2，3’端修饰Inverted dT的核酸序列，具体为5′-BHQ2-GTTTAGTCAGCTCTTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGCCGGTTAGAGCG-Inverted dT；SC-E6-TM-4的序列为5’端修饰VIC荧光，3’端修饰Inverted dT的核酸序列，具体为5′-VIC-cgacGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-Inverted dT；SC-E6-TM-5的序列为3’端修饰FAM荧光的核酸序列，具体为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTG-FAM；SC-E6-TM-6的序列为3’端修饰ROX荧光的核酸序列，具体为5′-TAAGTTTTACCGAACAAGAAGCGGCCGAGCTGACTAAAC-ROX。
上述技术方案中，SC-E6-TM探针的制备方法为：以5μL 10μmol/L SC-E6-TM-1计，按SC-E6-TM探针的组成取相应各组分，与10μL等温扩增缓冲液混合，并用去离子水补齐至100μL，混合均匀后，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃，得到SC-E6-TM探针；其中，等温扩增缓冲液由0.2M Tris、0.1M(NH4)2SO4、0.5M KCL、0.02M MgSO4和0.4gTween-20组成。
上述技术方案中，用于检测沙门氏菌的invA、prot6E和mdh基因探针序列通过NUPACK软件设计。该Toehold辅助的链置换探针序列的特点是探针与LAMP的其中一个环状区域序列(检测识别区域)互补，并在序列的5’或3’端修饰荧光基团和淬灭基团，使得完整探针处于无荧光状态，即SC-E6探针、SC-TM探针和SC-E6-TM探针。
本发明的用于检测沙门氏菌的试剂盒，可以包括沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物和探针SC-E6；也可以包括沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物、肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物和探针SC-E6，记作试剂盒1；也可以包括沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物和探针SC-E6-TM；也可以包括沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物、肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物和探针SC-E6-TM；也可以包括沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物、鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物和探针SC-E6-TM；也可以包括沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物、肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物、鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物和探针SC-E6-TM，记作试剂盒2。在使用时，每个试剂盒可单独检测含有相应扩增物的细菌，也可以一起检测所有含有相应扩增物的细菌。
本发明用于检测沙门氏菌的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一、将1μL的待测物、检测液、1.5μL的10mmol/L dNTPs、0.5μL的100mmol/LMg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱于250μL离心管中并用去离子水补齐体积至21μL，充分混匀，得到样品；
其中，待测物为pUC57-invA质粒(含有沙门氏菌菌属保守基因invA)、pUC57-prot6E质粒(含有肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E)、pUC57-mdh质粒(含有鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh)，或待测样品中提取的基因组DNA(按照中华人民共和国国家标准GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中指定的方法对待检样品进行处理及增菌培养，采用水煮法或市售细菌基因组DNA提取试剂盒从待检样品中提取DNA)；检测液为1.5μL的沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物、1.5μL的肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物和1.5μL的鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物中的一种或多种，即根据实际盒的组成，当试剂盒含有一种扩增引物，放入一种扩增引物，当试剂盒含有两种扩增引物，也可以放入其中的一种或两种，当试剂盒含有三种引物，可以放入其中的一种、两种或三种；1.5μL的沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物包括5μM SCON-F3、5μM SCON-B3、20μM SCON-FIP、20μMSCON-BIP和10μM SCON-LP；1.5μL的肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物包括5μM E6E-F3、5μM E6E-B3、20μM E6E-FIP、20μM E6E-BIP和10μM E6E-LP；1.5μL的鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物包括5μM TMDH-F3、5μM TMDH-B3、20μMTMDH-FIP、20μMTMDH-BIP和10μM TMDH-LP；
步骤二、将样品放入PCR仪保持95℃2min，以每秒降温0.1℃的速度降温至4℃保持2min以上，加入2.5μL SC-E6探针或SC-E6-TM探针，最后加入1.5μL 8U Bst 2.0聚合酶，混匀，转移20μL至八连排中，然后将八连排置于实时荧光定量PCR仪的样品槽，设置温度条件55℃，荧光信号采集时间间隔为1min，连续采集90次。
本发明的用于检测沙门氏菌的试剂盒1的原理，如图1所示：用于检测沙门氏菌的试剂盒2的原理如图2所示。即采用LAMP核酸扩增方法对核酸进行扩增，得到基因扩增序列，然后通过多元特异性探针辅助的链置换反应，实现了检测序列的信号传导，最终以荧光强度作为反应信号的输出方式，当不存在阳性样本时，体系中没有产生针对目的序列的特异性LAMP产物，体系中没有发生链置换反应并不伴随荧光信号的产生，此为阴性结果；而当含有invA、pro t6E和mdh基因的阳性样本单独或同时存在时，体系中发生针对目的序列的特异性LAMP扩增，特异性探针与LAMP中的特异环状部位结合发生链置换反应产生荧光信号，此为阳性结果。利用LAMP扩增反应与多元探针偶联，使荧光信号作为检测输出信号对病原体基因进行直接检测，该方法操作简单，可同时检测两个或三个沙门氏菌基因位点，有效辨别鼠伤寒沙门氏菌和肠道沙门氏菌肠炎血清型。上述方法可分别在检测特异性上与LAMP完美互补，有利于实现沙门氏菌的现场即时检测。由此完成针对沙门氏菌的超灵敏现场即时检测方法。
在本发明中所使用的术语，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有说明。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例中的沙门氏菌的invA、prot6E和mdh基因来源：
先将沙门氏菌的invA、prot6E和mdh基因序列交至生工生物有限公司进行基因合成。参考序列为National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中的M90846.1、U66901.1 X61029.1序列，部分该序列分别插入pUC57载体上，获得pUC57-invA、pUC57-prot6E质粒和pUC57-mdh质粒。
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
用于检测沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP引物设计与验证。按照物质的量比为1:1:4:4:2的SCON-F3、SCON-B3、SCON-FIP、SCON-BIP和SCON-LP；其中，SCON-F3的序列为CGTCATTCCATTACCTACCT；SCON-B3的序列为CAATCAAGATAAGACGACTGG；SCON-FIP的序列为GAACGACCCCATAAACACCAATTGGTTGATTTCCTGATCGC；SCON-BIP的序列为TGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGACTGATCGATAATGCCAGAC；SCON-LP的序列为ATCGCCAGTACGATATTCAGT。
基于LAMP法扩增沙门氏菌菌属保守基因invA序列：25μL LAMP反应体系中含有1μL待测物，1.5μL的5μmol/L SCON-B3、1.5μL的5μmol/L SCON-F3、1.5μL的20μmol/L SCON-FIP、1.5μL的20μmol/L SCON-BIP、1.5μL的10μmol/L SCON-LP、1.5μL的10mmol/L dNTPs、0.5μL的100mmol/L Mg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液(0.2M Tris、0.1M(NH4)2SO4、0.5MKCL、0.02M MgSO4、0.4g Tween-20)、5μL的5mol/L甜菜碱、1μL20×Evagreen染料与1.5μL的8U Bst 2.0聚合酶，用ddH2O补齐体积，充分混匀。反应条件为：设置温度条件60℃，荧光信号采集时间间隔为1min，连续采集90次；随后80℃反应20min。得到的为invA基因序列LAMP扩增产物。
待测物分别为：pUC57-invA质粒(浓度2000copies/μL)、阴性对照(ddH2O)。
图3为根据仪器荧光值分析扩增结果：以pUC57-invA质粒为待测物时的LAMP扩增结果；结果显示，在无模板的体系中(SCON NC)没有发生LAMP扩增，当存在pUC57-invA质粒(SCON PC)时，有扩增信号产生。
实施例2
用于检测肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP引物设计与验证。按照物质的量比为1:1:4:4:2的E6E-F3、E6E-B3、E6E-FIP、E6E-BIP和E6E-LP；其中，E6E-F3的序列为AGCAATGGTTGGGTTCGG；E6E-B3的序列为GCCCTGTACACTGCATCC；E6E-FIP的序列为GCACCCTTGCATCTACAGCAGGCAGGGGCACAATAACCGTAA；E6E-BIP的序列为TAGCTCGACCAAAGTGACGGTGTCACAACATTCCATGAGCCA；E6E-LP的序列为ACCGATGAGCGCCTCTCCGG。
基于LAMP法扩增肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E序列：25μL LAMP反应体系中含有1μL待测物，1.5μL的5μmol/L E6E-B3、1.5μL的5μmol/L E6E-F3、1.5μL的20μmol/L E6E-FIP、1.5μL的20μmol/LE6E-BIP、1.5μL的10μmol/L E6E-LP、1.5μL的10mmol/LdNTPs、0.5μL的100mmol/L Mg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱、1μL 20×Evagreen染料与1.5μL的8U Bst 2.0聚合酶，用ddH2O补齐体积，充分混匀。反应条件为：设置温度条件60℃，荧光信号采集时间间隔为1min，连续采集90次；随后80℃反应20min。得到的为prot6E基因序列LAMP扩增产物。
待测物分别为：pUC57-prot6E质粒(浓度2000copies/μL)、阴性对照(ddH2O)。
图4为根据仪器荧光值分析扩增结果：以pUC57-prot6E质粒为待测物时的LAMP扩增结果；结果显示，在无模板的体系(E6E NC)中没有发生LAMP扩增，当存在pUC57-prot6E质粒(E6E-PC)时，有扩增信号产生。
实施例3
用于检测鼠伤寒沙门杆菌特异表达基因mdh的LAMP引物设计与验证。按照物质的量比为1:1:4:4:2的TMDH-F3、TMDH-B3、TMDH-FIP、TMDH-BIP和TMDH-LP；其中，TMDH-F3的序列为CGCTGGATATCATCCGCTC；TMDH-B3的序列为TTCGCCTCGACGACTTCA；TMDH-FIP的序列为GAATCGTCACGCCGGAGTGCGCTGAAAGGTAAGCTGCCA；TMDH-BIP的序列为GCTGTCGCAGATTCCAGGCGACCGGCGTTCTGAATACGT；TMDH-LP的序列为CCGCCAATCACCGGCACTTCAACTTCCGT。
基于LAMP法扩增鼠伤寒沙门杆菌特异表达基因mdh序列：25μL LAMP反应体系中含有1μL待测物，1.5μL的5μmol/L TMDH-B3、1.5μL的5μmol/L TMDH-F3、1.5μL的20μmol/LTMDH-FIP、1.5μL的20μmol/L TMDH-BIP、1.5μL的10μmol/L TMDH-LP、1.5μL的10mmol/LdNTPs、0.5μL的100mmol/L Mg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱、1μL20×Evagreen染料与1.5μL的8U Bst2.0聚合酶，用ddH2O补齐体积，充分混匀。反应条件为：设置温度条件60℃，荧光信号采集时间间隔为1min，连续采集90次；随后80℃反应20min。得到的为mdh基因序列LAMP扩增产物。
待测物分别为：pUC57-mdh质粒(浓度2000copies/μL)、阴性对照(ddH2O)。
图5为根据仪器荧光值分析扩增结果：以pUC57-mdh质粒为待测物时的LAMP扩增结果；结果显示，在无模板的体系(TMDH NC)中没有发生LAMP扩增，当存在pUC57-mdh质粒(TMDH PC)时，有扩增信号产生。
实施例4
利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证二元检测探针SC-E6的可行性。
进行可行性验证所需模拟目的序列分别为沙门氏菌菌属共有保守基因invA的LAMP产物环部序列Mimic 1与肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP产物环部序列Mimic 2；其中Mimic 1为TTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTG；Mimic 2为GAACAATGCAACGCCCGGTTAGAGCGCAAAAATCAGGA。
用于验证二元检测探针的可行性且可分别或同时检测Mimic 1与Mimic 2的特异探针，包括摩尔量比为1:1:1:1的未经修饰序列SC-E6-1、SC-E6-2、SC-E6-3和SC-E6-4；SC-E6-1的序列为5′-CGACGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-3′；SC-E6-2的序列为5′-GAACAATGCAACGCCCGGgGAGGAGTCCCTGCTCCCTCACGCTCTTTCGTCG-3′；SC-E6-3的序列为5′-ACTGTTAATTACGAGGGAGCAGGGACTCCTCTTAGAGCG-3′；。SC-E6-4的序列为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTGTTC-3′。
探针的孵育方法为：将5μL 10μmol/L SC-E6-1、5μL 10μmol/L SC-E6-2、5μL 10μmol/L SC-E6-3、5μL 10μmol/L SC-E6-4、10μL 10×等温扩增缓冲液(0.2M Tris、0.1M(NH4)2SO4、0.5M KCL、0.02M MgSO4、0.4g Tween-20)、70μL水于1.5mL离心管中，充分混合。通过退火程序，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法：本实验中聚丙烯酰胺凝胶浓度采用8％-25％。以浓度8％为例(不同比例调整丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺40％溶液(29：1)和去离子水的比例)，取10mL丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺40％溶液(29：1)、2.5mL5×TBE、2.5mL甘油、200μL10％过硫酸铵、53μL四甲基乙二胺、35mL去离子水于50mL离心管中，小心充分混匀以避免气泡，将混匀完全的液体在2分钟内加入到胶板中，使液体均匀分布在凝胶板中，小心避免产生气泡，插入样梳，约30min凝胶完全凝固形成非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。待凝胶完全凝固后，拔出样梳，将凝胶板垂直放入电泳槽中，电泳槽中放入适量1×TBE，以完全没过胶孔。上样，取混匀后的SC-E6探针1μM，加入3μL 6×Loading缓冲液，并用去离子水补充体积至18μL，18μL体系样品全部上样。全部上样完成后正确连接电源正负极，恒压250V，由于不同的胶浓度DNA迁移率不同，所以一般以指示条带到达整个胶的2/3处停止电泳。取50mL 1×TBE于50mL离心管中，加入13μLMonTrackTM Safe Red荧光核酸染料，混匀，得到核酸染料，倒入摇胶槽中。把胶平整放入摇胶槽中，使核酸染料全部没过胶，摇胶仪转速设置为60rpm，保持30min，摇胶全程需要避光。结束后取出凝胶，用凝胶成像仪进行采点拍照分析结果。
从图6可以看出，第一泳道为SC-E6-1与Mimic 1的结合效果，第二泳道为SC-E6-4与Mimic 2的结合效果，第三、四泳道分别为SC-E6-2和SC-E6-3，第五泳道为SC-E6-2与SC-E6-3的结合效果，第六泳道是探针4条链都存在时，完整的探针稳定结合效果。第七泳道SC-E6-1、SC-E6-2与SC-E6-3相结合的效果，第八泳道SC-E6-2、SC-E6-3与SC-E6-4相结合的效果，第十泳道是当完整探针(四条链)和Mimic 1反应后的结果，其中Mimic 1与SC-E6-1结合，导致探针只剩下2-3-4链；第十一泳道是当完整探针(四条链)和Mimic 2反应后的结果，其中Mimic 2与SC-E6-4结合，导致探针只剩下1-2-3链。第九泳道是当完整探针与Mimic 1和Mimic 2同时存在时，Mimic 1与SC-E6-1结合，Mimic 2与SC-E6-4结合，导致探针只剩下2-3链。上述结果显示，二元探针对于沙门氏菌菌属保守基因invA与肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的模拟序列的检测反应可以顺利实现。
实施例5
二元检测探针SC-E6进行比例优化
此部分所用探针是分别进行荧光或猝灭基团修饰的二元检测探针SC-E6，其中SC-E6-1的序列为5′-ROX-CGACGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-Inverted dT-3′；SC-E6-2的序列为5′-BHQ1-GAACAATGCAACGCCCGGgGAGGAGTCCCTGCTCCCTCACGCTCTTTCGTCG-BHQ2-3′；SC-E6-3的序列为5′-ACTGTTAATTACGAGGGAGCAGGGACTCCTCTTAGAGCG-InverteddT-3′；SC-E6-4的序列为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTGTTC-FAM-3′。
探针比例1组为：SC-E6-1：SC-E6-2：SC-E6-3：SC-E6-4＝1:1:1:1(摩尔比)，图6中表示为F:Q＝1:1；分别将5μL 10μmol/L SC-E6-1、5μL 10μmol/L SC-E6-2、5μL 10μmol/LSC-E6-3、5μL 10μmol/L SC-E6-4、10μL 10×等温扩增缓冲液、70μL去离子水于1.5mL离心管中，充分混合。通过退火程序，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃。
探针比例2组为：SC-E6-1：SC-E6-2：SC-E6-3：SC-E6-4＝1:2:2:1(摩尔比)，图6中表示为F:Q＝1:2；分别将5μL 10μmol/L SC-E6-1、10μL 10μmol/L SC-E6-2、10μL 10μmol/LSC-E6-3、5μL 10μmol/L SC-E6-4、10μL 10×等温扩增缓冲液、60μL去离子水于1.5mL离心管中，充分混合。通过退火程序，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃。
探针比例3组为：SC-E6-1：SC-E6-2：SC-E6-3：SC-E6-4＝1:3:3:1(摩尔比)，图6中表示为F:Q＝1:3；分别将5μL 10μmol/L SC-E6-1、15μLμmol/L SC-E6-2、15μLμmol/L SC-E6-3、5μLμmol/L SC-E6-4、10μL 10×等温扩增缓冲液、50μL去离子水于1.5mL离心管中，充分混合。通过退火程序，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃。
制备3组invA基因单元检测体系：将浓度为1μL 100mmol/L Mg2+、5μL 10×等温扩增缓冲液、0.5μL 10μmol/L Mimic 1置于250μL离心管中，每组样品中再分别加入2.5μL探针1组，探针2组，探针3组，并用去离子水补充体积至50μL，混匀，55℃下孵育30min，取15μL放入384孔板中，每组设置三个平行样品，酶标仪检测终点荧光值。
制备3组prot6E基因单元检测体系：将浓度为1μL 100mmol/L Mg2+、5μL 10×等温扩增缓冲液、0.5μL 10μmol/L Mimic 2置于250μL离心管中，每组样品中再分别加入2.5μL探针1组，探针2组，探针3组，并用去离子水补充体积至50μL，混匀，55℃下孵育30min，取15μL放入384孔板中，每组设置三个平行样品，酶标仪检测终点荧光值。
制备3组invA和prot6E基因多元检测体系，将浓度为1μL 100mmol/L Mg2+、5μL 10×等温扩增缓冲液、0.5μL 10μmol/L Mimic 1和Mimic 2置于250μL离心管中，每组样品中再分别加入2.5μL探针1组，探针2组，探针3组，并用去离子水补充体积至50μL，混匀，55℃下孵育30min，取15μL放入384孔板中，每组设置三个平行样品，酶标仪检测终点荧光值。
图7为SC-E6探针摩尔比例优化结果，其中左图为ROX荧光信号检测结果，右图为FAM荧光信号的检测检测结果；图中1为ROX背景信号，2为加入Mimic 1，3为加入Mimic 2，4为加入Mimic 1和Mimic 2，5-8、9-12同1-4情况相同。结果显示探针SC-E6与Mimic 1反应生成SC-E6-1-Mimic 1复合物引发ROX荧光信号，探针SC-E6与Mimic 2反应生成SC-E6-4-Mimic 2复合物引发FAM荧光信号。探针摩尔比例＝1:1:1:1时，有大量荧光泄漏，有较高背景信号。探针摩尔比例＝1:2:2:1和探针比例＝1:3:3:1时，荧光泄漏较少，有较低背景信号。相比较，探针摩尔比例＝1:2:2:1时有较高信噪比，所以探针选用SC-E6-1：SC-E6-2：SC-E6-3：SC-E6-4＝1:2:2:1(摩尔比)作为最优比例SC-E6探针。
实施例6
利用二元探针SC-E6特异性检测沙门氏菌LAMP产物
此部分使用检测模板为2000copies/μL pUC57-invA、pUC57-prot6E。
invA基因或prot6E基因的LAMP扩增产物制备：将1μL浓度为2000copies/μL的沙门氏菌检测模板(pUC57-invA或pUC57-prot6E或pUC57-mdh)、1.5μL 5μmol/L SCON-B3引物、1.5μL 5μmol/L SCON-F3引物、1.5μL 20μmol/L SCON-FIP引物、1.5μL 20μmol/L SCON-BIP引物、1.5μL 10μmol/L SCON环部序列引物、1.5μL的10mmol/L dNTPs、0.5μL的100mmol/LMg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱于250μL离心管中并用去离子水补齐体积至21μL，充分混匀，得到样品。
此部分使用检测模板为沙门氏菌ATCC 13076基因组DNA。按照中华人民共和国国家标准GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中指定的方法对待检样品进行处理及增菌培养，采用市售细菌基因组DNA提取试剂盒从待检样品中提取DNA。
invA基因或prot6E基因的LAMP扩增产物制备：将1μL浓度为2000copies/μL的沙门氏菌检测模板(pUC57-invA或pUC57-prot6E或pUC57-mdh)、1.5μL 5μmol/L SCON-B3引物、1.5μL 5μmol/L SCON-F3引物、1.5μL 20μmol/L SCON-FIP引物、1.5μL 20μmol/L SCON-BIP引物、1.5μL 10μmol/L SCON环部序列引物、1.5μL的10mmol/L dNTPs、0.5μL的100mmol/LMg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱于250μL离心管中并用去离子水补齐体积至21μL，充分混匀，得到样品。
invA基因和prot6E基因的LAMP产物制备：将1μL上述沙门氏菌ATCC13076基因组DNA、1.5μL的5μmol/L SCON-F3/B3引物、1.5μL的5μmol/L E6E-F3/B3引物、1.5μL的20μmol/L SCON-FIP/BIP引物、1.5μL的20μmol/L E6E-FIP/BIP引物、1.5μL的10μmol/L SCON环引物、1.5μL的10μmol/L E6E环引物、1.5μL的10mmol/L dNTPs、0.5μL的100mmol/L Mg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱于250μL离心管中并用去离子水补齐体积至21μL，充分混匀，得到样品。
LAMP-探针扩增反应：将上述样品分别，放入PCR仪保持95℃2min，以每秒降温0.1℃的速度降温至4℃保持2min以上，加入2.5μL探针(探针制备方法采用实施例5中的F:Q＝1:2)，最后加入1.5μL 8U Bst 2.0聚合酶，混匀，转移20μL至八连排中，然后将八连排置于实时荧光定量PCR仪的样品槽，设置温度条件55℃，荧光信号采集时间间隔为1min，连续采集90次，启动LAMP-探针扩增反应。
图8左图结果显示，invA基因LAMP扩增产物与探针结合应检测到ROX荧光，prot6E基因LAMP扩增产物与探针结合应检测到FAM荧光，只有invA基因LAMP扩增产物与探针存在时可以检测到ROX荧光信号，而prot6E基因LAMP扩增产物和mdh基因LAMP扩增产物分别与探针都存在时，以及在不加入任何模板的情况下没有检测到ROX荧光信号；同样右图所示，只有prot6E基因LAMP扩增产物与探针存在时可以检测到FAM荧光信号，而invA基因LAMP扩增产物和mdh基因LAMP扩增产物分别与探针都存在时没有检测到FAM荧光信号上述结果说明说明该探针可以满足分别检测沙门氏菌invA和prot6E基因的需求。
图9结果显示，加入沙门氏菌ATCC 13076基因组DNA时，即可检测到invA基因，又可检测到prot6E基因，并且阴性对照无荧光信号，说明该探针可以满足同时检测沙门氏菌invA和prot6E基因的需求。
实施例7
利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证三元检测探针SC-E6-TM的可行性。
进行可行性验证所需模拟目的序列分别为实施例4中的Mimic 1与Mimic2、以及实施例5中的Mimic 3。
用于验证三元检测探针的可行性且可分别或同时检测Mimic 1、Mimic 2与Mimic3的特异探针，包括物质的量比为1:1:1:1:1:1的未经修饰序列SC-E6-TM-1、SC-E6-TM-2、SC-E6-TM-3、SC-E6-TM-4、SC-E6-TM-5和SC-E6-TM-6；SC-E6-TM-1的序列为5′-CAATGCAACGCCGCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCACGCTCTTTCgtcg-3′；SC-E6-TM-2的序列为5′-ACTGTTAATTACCGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAAGCGGCCGCTTCTTG-3′；SC-E6-TM-3的序列为5′-GTTTAGTCAGCTCTTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGCCGGTTAGAGCG-3′；SC-E6-TM-4的序列为5′-cgacGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-3′；SC-E6-TM-5的序列为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTG-3′；SC-E6-TM-6的序列为5′-TAAGTTTTACCGAACAAGAAGCGGCCGAGCTGACTAAAC-3′。
探针的孵育方法与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法与实施例4相同。
从图10可以看出，第一泳道为探针的结合效果，第二泳道为SC-TM-4与Mimic 3的结合效果，第三泳道为SC-E6-TM-4和Mimic 1的结合效果，第四泳道为SC-E6-TM-5和Mimic2的结合效果，第五泳道为SC-E6-TM-6和Mimic3的结合效果，第六泳道为SC-E6-TM-1、SC-E6-TM-2和SC-E6-TM-3的结合效果，第二泳道是当完整探针(六条链)和Mimic 1-2-3反应后的结果，其中Mimic 1-2-3分别与SC-E6-TM-4-5-6结合，导致探针只剩下1-2-3链；第十一泳道是当完整探针(四条链)和Mimic 3反应后的结果，其中Mimic 2与SC-TM-4结合，导致探针只剩下1-2-3链。上述结果显示，三元探针对于invA、prot6E与mdh的模拟序列的检测反应可以顺利实现。
实施例8
三元检测探针SC-E6-TM进行比例优化
此部分所用探针是分别进行荧光或猝灭基团修饰的三元检测探针SC-E6-TM，其中SC-E6-TM-1的序列为5′-BHQ1-CAATGCAACGCCGCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCACGCTCTTTCGTCG-BHQ1-3′；SC-E6-TM-2的序列为5′-ACTGTTAATTACCGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAAGCGGCCGCTTCTTG-Inverted dT-3′；SC-E6-TM-3的序列为5′-BHQ2-GTTTAGTCAGCTCTTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGCCGGTTAGAGCG-Inverted dT-3′；SC-E6-TM-4的序列为5′-VIC-CGACGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-Inverted dT-3′；SC-E6-TM-5的序列为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTG-FAM-3′；SC-E6-TM-6的序列为5′-TAAGTTTTACCGAACAAGAAGCGGCCGAGCTGACTAAAC-ROX-3′。
探针比例1组为：SC-E6-TM-1：SC-E6-TM-2：SC-E6-TM-3：SC-E6-TM-4：SC-E6-TM-5：SC-E6-TM-6＝1:1:1:1:1:1(摩尔比)，图13中表示为F:Q＝1:1；分别将5μL 10μmol/L SC-E6-TM-1、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-2、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-3、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-4、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-5、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-6、10μL 10×等温扩增缓冲液、60μL去离子水于1.5mL离心管中，充分混合。通过退火程序，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃。
探针比例2组为：SC-E6-TM-1：SC-E6-TM-2：SC-E6-TM-3：SC-E6-TM-4：SC-E6-TM-5：SC-E6-TM-6＝1:1:1:2:2:2(摩尔比)，图14中表示为F:Q＝1:2；分别将5μL 10μmol/L SC-E6-TM-1、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-2、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-3、10μL 10μmol/L SC-E6-TM-4、10μL 10μmol/L SC-E6-TM-5、10μL 10μmol/L SC-E6-TM-6、10μL 10×等温扩增缓冲液、45μL去离子水于1.5mL离心管中，充分混合。通过退火程序，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃。
探针比例3组为：SC-E6-TM-1：SC-E6-TM-2：SC-E6-TM-3：SC-E6-TM-4：SC-E6-TM-5：SC-E6-TM-6＝1:1:1:3:3:3(摩尔比)，图15中表示为F:Q＝1:3；分别将5μL 10μmol/L SC-E6-TM-1、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-2、5μL 10μmol/L SC-E6-TM-3、15μL 10μmol/L SC-E6-TM-4、15μL 10μmol/L SC-E6-TM-5、15μL 10μmol/L SC-E6-TM-6、10μL 10×等温扩增缓冲液、30μL去离子水于1.5mL离心管中，充分混合。通过退火程序，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃。
制备3组invA基因单元检测体系：将浓度为1μL 100mmol/L Mg2+、5μL 10×等温扩增缓冲液、0.5μL 10μmol/L Mimic 1置于250μL离心管中，每组样品中再分别加入2.5μL探针1组，探针2组，探针3组，并用去离子水补充体积至50μL，混匀，55℃下孵育30min，取15μL放入384孔板中，每组设置三个平行样品，酶标仪检测终点荧光值。
制备3组prot6E基因单元检测体系：将浓度为1μL 100mmol/L Mg2+、5μL 10×等温扩增缓冲液、0.5μL 10μmol/L Mimic 2置于250μL离心管中，每组样品中再分别加入2.5μL探针1组，探针2组，探针3组，并用去离子水补充体积至50μL，混匀，55℃下孵育30min，取15μL放入384孔板中，每组设置三个平行样品，酶标仪检测终点荧光值。
制备3组mdh基因单元检测体系：将浓度为1μL 100mmol/L Mg2+、5μL 10×等温扩增缓冲液、0.5μL 10μmol/L Mimic 3置于250μL离心管中，每组样品中再分别加入2.5μL探针1组，探针2组，探针3组，并用去离子水补充体积至50μL，混匀，55℃下孵育30min，取15μL放入384孔板中，每组设置三个平行样品，酶标仪检测终点荧光值。
制备3组invA、prot6E和mdh基因多元检测体系，将浓度为1μL 100mmol/L Mg2+、5μL10×等温扩增缓冲液、0.5μL 10μmol/L Mimic 1、Mimic2和Mimic 3置于250μL离心管中，每组样品中再分别加入2.5μL探针1组，探针2组，探针3组，并用去离子水补充体积至50μL，混匀，55℃下孵育30min，取15μL放入384孔板中，每组设置三个平行样品，酶标仪检测终点荧光值。
图11-13为SC-E6-TM探针摩尔比例优化结果，其中图11为VIC荧光信号检测结果，图12为FAM荧光信号的检测检测结果，图13为ROX荧光信号的检测检测结果。图11中VIC为不加入模板是监测VIC荧光背景信号，SCON为加入Mimic 1，E6E为加入Mimic 2，TMDH为加入Mimic 3，Mixture为同时加入Mimic 1、Mimic 2和Mimic 3；图12中FAM为不加入模板是监测FAM荧光背景信号，SCON为加入Mimic 1，E6E为加入Mimic 2，TMDH为加入Mimic 3，Mixture为同时加入Mimic 1、Mimic 2和Mimic 3；图13中ROX为不加入模板是监测ROX荧光背景信号，SCON为加入Mimic 1，E6E为加入Mimic 2，TMDH为加入Mimic 3，Mixture为同时加入Mimic 1、Mimic 2和Mimic 3。结果显示探针SC-E6-TM与Mimic 1反应生成SC-E6-TM-4-Mimic 1复合物引发VIC荧光信号，探针SC-E6-TM与Mimic 2反应生成SC-E6-TM-5-Mimic2复合物引发FAM荧光信号,探针SC-E6-TM与Mimic3反应生成SC-E6-6-Mimic 3复合物引发ROX荧光信号。探针摩尔比例＝1:1:1:1:1:1时，有大量荧光泄漏，有较高背景信号。探针摩尔比例＝1:1:1:2:2:2和探针比例＝1:1:1:3:3:3时，荧光泄漏较少，有较低背景信号。相比较，探针摩尔比例＝1:1:1:2:2:2时有较高信噪比，所以探针选用SC-E6-TM-1：SC-E6-TM-2：SC-E6-TM-3：SC-E6-TM-4：SC-E6-TM-5：SC-E6-TM-6＝1:1:1:2:2:2(摩尔比)作为最优比例SC-E6-TM探针。
实施例9
利用三元探针SC-E6-TM特异性检测沙门氏菌LAMP产物
此部分使用检测模板为2000copies/μL pUC57-invA、pUC57-prot6E与pUC57-mdh。
invA或prot6E或mdh基因的LAMP扩增产物制备同实施例1、2、3。
此部分使用检测模板为沙门氏菌ATCC 13076基因组DNA和沙门氏菌ATCC 14028基因组DNA。(按照中华人民共和国国家标准GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》中指定的方法对待检样品进行处理及增菌培养，采用市售细菌基因组DNA提取试剂盒从待检样品中提取DNA。)
invA、prot6E和mdh基因的LAMP产物制备：将1μL上述沙门氏菌ATCC 13076基因组DNA和沙门氏菌ATCC 14028基因组DNA、1.5μL的SCON引物(5μM B3/F3,20μM FIP/BIP,10μMLP)、1.5μL的E6E引物(5μMB3/F3,20μM FIP/BIP,10μM LP)、1.5μL的mdh引物(5μM B3/F3,20μM FIP/BIP,10μM LP)、1.5μL的10mmol/L dNTPs、0.5μL的100mmol/LMg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱于250μL离心管中并用去离子水补齐体积至21μL，充分混匀，得到样品。
LAMP-探针扩增反应：将样品放入PCR仪保持95℃2min，以每秒降温0.1℃的速度降温至4℃保持2min以上，加入2.5μL探针(探针制备方法采用实施例10中的)，最后加入1.5μL8U Bst 2.0聚合酶，混匀，转移20μL至八连排中，然后将八连排置于实时荧光定量PCR仪的样品槽，设置温度条件55℃，荧光信号采集时间间隔为1min，连续采集90次，启动LAMP-探针扩增反应。
图14-16结果显示，invA基因LAMP扩增产物与探针结合应检测到VIC荧光，prot6E基因LAMP扩增产物与探针结合应检测到FAM荧光，mdh基因LAMP扩增产物与探针结合应检测到ROX荧光。只有invA基因LAMP扩增产物与探针存在时可以监测到VIC荧光信号，而prot6E基因LAMP扩增产物和mdh基因LAMP扩增产物分别与探针都存在时没有检测到VIC荧光信号，以及在不加入任何模板的情况下也没有检测到VIC荧光信号；只有prot6E基因LAMP扩增产物与探针存在时可以检测到FAM荧光信号，而invA基因LAMP扩增产物和mdh基因LAMP扩增产物分别与探针都存在时没有检测到FAM荧光信号，以及在不加入任何模板的情况下也没有监测到FAM荧光信号；只有mdh基因LAMP扩增产物与探针存在时可以监测到ROX荧光信号，而invA基因LAMP扩增产物和prot6E基因LAMP扩增产物分别与探针都存在时没有检测到ROX荧光信号，以及在不加入任何模板的情况下也没有检测到ROX荧光信号,说明该探针可以满足检测沙门氏菌invA、prot6E和mdh基因的需求。
图17结果显示，加入沙门氏菌ATCC 13076基因组DNA和沙门氏菌ATCC 14028基因组DNA时，可以同时检测到沙门氏菌invA、prot6E和mdh基因，说明该检测体系可以实现短时间内对沙门氏菌的检测，该探针可以满足同时检测沙门氏菌invA、prot6E和mdh基因的需求。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国科学院长春应用化学研究所
<120> 一种用于检测沙门氏菌的试剂盒
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcactgaata tcgtactggc gatattggtg tttatggggt cgttctacat tgacagaatc 60
ctcagttttt caacgtttcc tgcggtactg ttaattacca cgctctttcg tctggcatta 120
tcgatcagta ccagtcgtct tatcttgatt gaagccgatg ccggtgaaat tatcgccacg 180
ttcgggcaat tcgttattgg cgatagcctg gcggtgggtt ttgttgtctt ctctattgtc 240
accgtggtcc agtttatcgt tattaccaaa ggttcagaac gtgtcgcgga agtcgcggcc 300
cgattttctc tggatggtat gcccggtaaa cagatgagta ttgatgccga tttgaaggcc 360
ggtattattg atgcggatgc cgcgcgcgaa cggcgaagcg tactggaaag ggaaagccag 420
ctttacggtt cctttgacgg tgcgatgaag tttatcaaag gtgacgctat tgccggcatc 480
attattatct ttgtgaactt tattggcggt atttcggtgg ggatgactcg ccatggtatg 540
gatttgtcct ccgccctgtc tacttatacc atgctgacca ttggtgatgg tcttgtcgcc 600
cagatccccg cattgttgat t 621
<210> 2
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggagggagtg acagcgtcat gatgcgggtg aacggtcagg cgtcaactaa tggtccgctg 60
ttctggctgg agaatggcgg acagcgggtg aagctgacgg gggcaaaaag tgatgccttc 120
tgcatctccc ccaccgcccc gaacaggtgt gagcttcgtc cggtgacgat atccggcgaa 180
ctccccggag agatattgat gcgacggtgg tctttgatgt ggtttatccg cagtaggtag 240
ccagtataaa tcgcccggcg tgggttaagc gcaccacaat atgcgaatga accgtgtcga 300
taacaacgga caaaactgta caggaatgat tatgaaaccg atttcttatt ttaccgggag 360
cagaaaacgc agcagcacat gtctgatatc gtcgttgctg cttccgggaa tgacagccat 420
gggtatttca cttcccggca ccgcagcaat ggttgggttc gggggagact atacctacag 480
gggcacaata accgtaaccg gagaggcgct catcggtcct gctgtagatg caagggtgcc 540
taaggttagt gtgactctct gtagctcgac caaagtgacg gtggaacaat gcaacgcccg 600
gttagagcgc aaaaatcagg atggctcatg gaatgttgtg acagggatgc agtgtacagg 660
gcaaaatagc aataatttaa gtgtggtgac ccccatctca aaaatctata agctcgtgta 720
cggcgatttc taccgtgtcg tttttatgaa tgtgagggcg aggtttgaac caagtggagc 780
agctgagcat ggttcgcgtt gttttgttga aaaacaaagc tacagctatg ggaatcctgt 840
cagtggagga gtactggagt tgagtacatt gtcaggtcaa actgaacgtt tggctgccta 900
tggccagcac gagacgacat tcttgatgcc agtcactgcg gtcgataaaa cttatatcga 960
atacccgacc atgacccggt tgagtgttgc tcccgacgga agcgcgcgcg gacaggtagt 1020
caccgttgtg ggtcgtaacg cacaagtgaa atttaccctg agggaggctt atggtaataa 1080
taatttgggg cagtattgga taccaacggc tgctagcggg agtaaaatta aaccgcagtt 1140
gataaaaaag gacggatcac aatgtgtcaa tgcccgtgaa ggggagtcat gtgaccttta 1200
ttatccaccg ggatctgtac ctccaggacg atactaccgc ggctatgtgg acatttacgc 1260
cacggtatat tgacgtcacg gtgaaataat ccgggagcaa tttcagctat tcccgagctt 1320
atgctcacat tttctcatgg agaccggaat tgtcggcact ggcatctttc accggataac 1380
aaagcgggtc aaaaatgcat aaatcttatt cagcgagctg ctcaaatgtt attacccgac 1440
ctcaatggat gttattgggt atatccttcc atggaaatac gcaatgagaa ggcgctgttt 1500
ttatttacat acaaagagta actccggttt atgagt 1536
<210> 3
<211> 1122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccaaaattg cgcgactccg cattcttgat gagtgaggat tgtaatcatt gaatttgtga 60
attaaggtcg ccgccgcgga gcaatagaca cttagctaat catataataa ggagtttagg 120
atgaaagtcg cagtcctcgc cgctgctggt ggtatcggtc aggcgctggc attactttta 180
aaaaaccaac tgccttcagg ttcagaactc tccctgtacg acatcgctcc agtgactccc 240
ggtgtggccg ttgatttgag ccacatcccc accgctgtaa aaatcaaagg tttctccggt 300
gaagacgcaa ccccggcgct tgaaggcgct gacgtagtac tgatttctgc gggtgtggcg 360
cgtaagccgg gtatggaccg ttccgacctg tttaacgtta acgccggcat cgtgaaaaac 420
ctggtgcagc agatcgctaa aacctgcccg aaagcgtgcg tgggcattat caccaacccg 480
gtgaacacca ccgttgcgat tgcggcggaa gtgctgaaaa aagcaggcgt atacgacaaa 540
aacaaactgt ttggcgttac cacgctggat atcatccgct ctaatccctt tgttgcagag 600
ctgaaaggta agctgccaac ggaagttgaa gtgccggtga ttggcgggca ctccggcgtg 660
acgattctgc cgctgctgtc gcagattcca ggcgtaagtt ttaccgaaca agaagcggcc 720
gagctgacta aacgtattca gaacgccggt actgaagtcg tcgaggcgaa agccggcggc 780
ggatcggcaa ccctctctat gggccaggct gccgcgcgtt tcggtgtttc tctggttcgc 840
gctctgcagg gcgagaaggg cgtggtggaa tgcgcctatg tggaaggcga cggtcagtat 900
gcccgtttct tctctcagcc gctgctgctg ggtaaaaacg gcgtagaaga gcgtaaatcc 960
atcggcacac tgagcgcttt cgagcaacat tcgctggacg ctatgctgga tacgctgaaa 1020
aaagatattc agttgggtga agaaattatt aataaataag ctgttcctgc ccgatgccgg 1080
ggcttttgct ccggcttctt tacatgtaaa caagccacga aa 1122
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcattcca ttacctacct 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caatcaagat aagacgactg g 21
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaacgacccc ataaacacca attggttgat ttcctgatcg c 41
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgacagaatc ctcagttttt caacgactga tcgataatgc cagac 45
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgccagta cgatattcag t 21
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcaatggtt gggttcgg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccctgtaca ctgcatcc 18
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcacccttgc atctacagca ggcaggggca caataaccgt aa 42
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tagctcgacc aaagtgacgg tgtcacaaca ttccatgagc ca 42
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accgatgagc gcctctccgg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgctggatat catccgctc 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttcgcctcga cgacttca 18
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaatcgtcac gccggagtgc gctgaaaggt aagctgcca 39
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gctgtcgcag attccaggcg accggcgttc tgaatacgt 39
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccgccaatca ccggcacttc aacttccgt 29
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgacgaaaga gcgtggtaat taacagtacc gcaggaaa 38
<210> 20
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaacaatgca acgcccgggg aggagtccct gctccctcac gctctttcgt cg 52
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
actgttaatt acgagggagc agggactcct cttagagcg 39
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcctgatttt tgcgctctaa ccgggcgttg cattgttc 38
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgacgaaaga gcgtggtaat taacagtacc gcaggaaa 38
<210> 24
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgtttagtca gctcggccgg aggagtccct gctccctcac gctctttcgt cg 52
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
actgttaatt acgagggagc agggactcct cgcttcttgt tc 42
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taagttttac cgaacaagaa gcggccgagc tgactaaacg 40
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caatgcaacg ccgcaccagg cagttgagac gaacattcct aagtcacgct ctttc 55
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
actgttaatt accgacttag gaatgttcga catgcgaggg tccaagcggc cgcttcttg 59
<210> 29
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtttagtcag ctcttggacc ctcgcatgac tcaactgcct ggtgccggtt agagcg 56
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaaagagcgt ggtaattaac agtaccgcag gaaa 34
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tcctgatttt tgcgctctaa ccgggcgttg cattg 35
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
taagttttac cgaacaagaa gcggccgagc tgactaaac 39
Claims (7)
1.用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，包括沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物和探针SC-E6；
所述沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的SCON-F3、SCON-B3、SCON-FIP、SCON-BIP和SCON-LP；
所述SCON-F3的序列为CGTCATTCCATTACCTACCT；
所述SCON-B3的序列为CAATCAAGATAAGACGACTGG；
所述SCON-FIP的序列为GAACGACCCCATAAACACCAATTGGTTGATTTCCTGATCGC；
所述SCON-BIP的序列为TGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGACTGATCGATAATGCCAGAC；
所述SCON-LP的序列为ATCGCCAGTACGATATTCAGT；
所述探针SC-E6，包括摩尔比为1:1:1:1或1:2:2:1或1:3:3:1的SC-E6-1、SC-E6-2、SC-E6-3和SC-E6-4；
所述SC-E6-1的序列为5′-ROX-CGACGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-InverteddT；
所述SC-E6-2的序列为5′-BHQ1-GAACAATGCAACGCCCGGGGAGGAGTCCCTGCTCCCTCACGCTCTTTCGTCG-BHQ2；
所述SC-E6-3的序列为5′-ACTGTTAATTACGAGGGAGCAGGGACTCCTCTTAGAGCG-InverteddT；
所述SC-E6-4的序列为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTGTTC-FAM。
2.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，还包括肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物；
所述肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物包括物质的量比为1:1:4:4:2的E6E-F3、E6E-B3、E6E-FIP、E6E-BIP和E6E-LP；
所述E6E-F3的序列为AGCAATGGTTGGGTTCGG；
所述E6E-B3的序列为GCCCTGTACACTGCATCC；
所述E6E-FIP的序列为GCACCCTTGCATCTACAGCAGGCAGGGGCACAATAACCGTAA；
所述E6E-BIP的序列为TAGCTCGACCAAAGTGACGGTGTCACAACATTCCATGAGCCA；
所述E6E-LP的序列为ACCGATGAGCGCCTCTCCGG。
3.根据权利要求1所述的用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述SC-E6探针的制备方法为：以5μL 10μmol/L SC-E6-1计，按SC-E6探针的组成取相应各组分，与10μL等温扩增缓冲液混合，并用去离子水补齐至100μL，混合均匀，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃，得到SC-E6探针；
所述等温扩增缓冲液由0.2M Tris、0.1M(NH4)2SO4、0.5M KCL、0.02M MgSO4和0.4gTween-20组成。
4.用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，包括沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物和探针SC-E6-TM；
所述沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的SCON-F3、SCON-B3、SCON-FIP、SCON-BIP和SCON-LP；
所述SCON-F3的序列为CGTCATTCCATTACCTACCT；
所述SCON-B3的序列为CAATCAAGATAAGACGACTGG；
所述SCON-FIP的序列为GAACGACCCCATAAACACCAATTGGTTGATTTCCTGATCGC；
所述SCON-BIP的序列为TGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGACTGATCGATAATGCCAGAC；
所述SCON-LP的序列为ATCGCCAGTACGATATTCAGT；
所述探针SC-E6-TM，包括摩尔比为1:1:1:1:1:1或1:1:1:2:2:2或1:1:1:3:3:3的SC-E6-TM-1、SC-E6-TM-2、SC-E6-TM-3、SC-E6-TM-4、SC-E6-TM-5和SC-E6-TM-6；
所述SC-E6-TM-1的序列为5′-BHQ1-CAATGCAACGCCGCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCACGCTCTTTCgtcg-BHQ1；
所述SC-E6-TM-2的序列为5′-ACTGTTAATTACCGACTTAGGAATGTTCGACATGCGAGGGTCCAAGCGGCCGCTTCTTG-Inverted dT；
所述SC-E6-TM-3的序列为5′-BHQ2-GTTTAGTCAGCTCTTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGCCGGTTAGAGCG-Inverted dT；
所述SC-E6-TM-4的序列为5′-VIC-cgacGAAAGAGCGTGGTAATTAACAGTACCGCAGGAAA-Inverted dT；
所述SC-E6-TM-5的序列为5′-TCCTGATTTTTGCGCTCTAACCGGGCGTTGCATTG-FAM；
所述SC-E6-TM-6的序列为5′-TAAGTTTTACCGAACAAGAAGCGGCCGAGCTGACTAAAC-ROX。
5.根据权利要求4所述的用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，还包括肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物、鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物中的一种或两种；
所述肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的E6E-F3、E6E-B3、E6E-FIP、E6E-BIP和E6E-LP；
所述E6E-F3的序列为AGCAATGGTTGGGTTCGG；
所述E6E-B3的序列为GCCCTGTACACTGCATCC；
所述E6E-FIP的序列为GCACCCTTGCATCTACAGCAGGCAGGGGCACAATAACCGTAA；
所述E6E-BIP的序列为TAGCTCGACCAAAGTGACGGTGTCACAACATTCCATGAGCCA；
所述E6E-LP的序列为ACCGATGAGCGCCTCTCCGG；
所述鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物，包括物质的量比为1:1:4:4:2的TMDH-F3、TMDH-B3、TMDH-FIP、TMDH-BIP和TMDH-LP；
所述TMDH-F3的序列为CGCTGGATATCATCCGCTC；
所述TMDH-B3的序列为TTCGCCTCGACGACTTCA；
所述TMDH-FIP的序列为GAATCGTCACGCCGGAGTGCGCTGAAAGGTAAGCTGCCA；
所述TMDH-BIP的序列为GCTGTCGCAGATTCCAGGCGACCGGCGTTCTGAATACGT；
所述TMDH-LP的序列为CCGCCAATCACCGGCACTTCAACTTCCGT。
6.根据权利要求4所述的用于检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于，所述SC-E6-TM探针的制备方法为：以5μL 10μmol/L SC-E6-TM-1计，按SC-E6-TM探针的组成取相应各组分，与10μL等温扩增缓冲液混合，并用去离子水补齐至100μL，混合均匀后，95℃孵育5min，并以每秒降温0.1℃的速度降至37℃，得到SC-E6-TM探针；
所述等温扩增缓冲液由0.2M Tris、0.1M(NH4)2SO4、0.5M KCL、0.02M MgSO4和0.4gTween-20组成。
7.权利要求1-6任何一项所述的用于检测沙门氏菌的试剂盒的非疾病诊断目的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将1μL的待测物、检测液、1.5μL的10mmol/L dNTPs、0.5μL的100mmol/L Mg2+、2.5μL的10×等温扩增缓冲液、5μL的5mol/L甜菜碱于250μL离心管中并用去离子水补齐体积至21μL，充分混匀，得到样品；
所述待测物为含有沙门氏菌菌属保守基因invA的pUC57-invA质粒、含有肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的pUC57-prot6E质粒、含有鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的pUC57-mdh质粒或从待测样品中提取的基因组DNA；
所述检测液包括1.5μL的沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物，还包括1.5μL的肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物和1.5μL的鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物中的一种或两种；
所述1.5μL的沙门氏菌菌属保守基因invA的LAMP扩增引物包括5μM SCON-F3、5μMSCON-B3、20μM SCON-FIP、20μM SCON-BIP和10μM SCON-LP；
所述1.5μL的肠道沙门氏菌肠炎血清型特异表达基因prot6E的LAMP扩增引物包括5μME6E-F3、5μM E6E-B3、20μM E6E-FIP、20μM E6E-BIP和10μM E6E-LP；
所述1.5μL的鼠伤寒沙门氏菌的特异表达基因mdh的LAMP扩增引物包括5μM TMDH-F3、5μM TMDH-B3、20μM TMDH-FIP、20μM TMDH-BI P和10μM TMDH-LP；
步骤二、将样品放入PCR仪保持95℃2min，以每秒降温0.1℃的速度降温至4℃保持2min以上，加入2.5μL SC-E6探针或SC-E6-TM探针，最后加入1.5μL 8U Bst 2.0聚合酶，混匀，转移20μL至荧光定量PCR管或八连排中，然后将荧光定量PCR管或八连排置于实时荧光定量PCR仪的样品槽，设置温度条件55℃，荧光信号采集时间间隔为1min，连续采集90次。
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