CN104641000A - 用于检测艰难梭菌的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于快速检测生物或非生物样品中艰难梭菌(Clostridium difficile)的存在或不存在的方法。所述方法可以包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了经设计用于检测艰难梭菌的引物、探针和试剂盒。

Description

用于检测艰难梭菌的组合物和方法
发明领域
本发明涉及微生物诊断的领域，并且更具体而言，涉及艰难梭菌(Clostridium difficile)的检测。
发明背景
艰难梭菌(Clostridium difficile)(“艰难梭菌(C. difficile)”或“艰难梭菌(C. diff)”)是一种厌氧、革兰氏阳性、形成孢子的细菌，其可引起严重的腹泻和其他肠道疾病。艰难梭菌孢子经常在医院中发现，并且尽管孢子不能直接引起感染，但它们当被摄取时可以转化为活跃感染形式。艰难梭菌感染包括广泛范围的临床症状，从简单腹泻到与显著的发病率和死亡率相关的假膜性结肠炎。抗生素相关的结肠炎是艰难梭菌引起的结肠感染，其发生在肠道菌群中的竞争性细菌已经被抗生素清除时。它是患者当他们在医院中时获取的最常见感染。
大多数艰难梭菌感染发生在年龄为65岁或以上的人之间和卫生保健设施诸如医院和养老院中的患者之间。从1996年到2009年，年龄为65岁或以上的住院人的艰难梭菌比率增加200％，其中年龄为65-74岁的那些增加175％，年龄为75-84岁的那些增加198%，且年龄为85岁或以上的那些增加201%。年龄为85岁或以上的患者间的艰难梭菌比率显著高于其他年龄组的那些(全国医院出院调查，年度档案，1996年-2009年(National Hospital Discharge Survey, Annual Files, 1996-2009))。
诊断艰难梭菌结肠炎通常涉及检测粪便样品中由艰难梭菌产生的毒素的测试。存在两种不同的能够引起结肠炎的艰难梭菌毒素，称为毒素A(tdcA)和毒素B(tcdB)。用于这些毒素的诊断测试是可商购的。然而，这些测试不完美，并且可导致假阳性测试(当不存在艰难梭菌时发现毒素)，且可发生假阴性测试(当存在艰难梭菌时未发现毒素)。例如，艰难梭菌和索氏梭菌(C. sordellii)之间交叉反应的可能性是已知的。参见，“Cloning and characterization of the cytotoxin L-encoding gene of Clostridium sordellii: homology with Clostridium difficile cytotoxin B”, Green等人, Gene, 1995, 161:57-61)。因此，仍然存在开发用于检测艰难梭菌的分子测试的显著临床需要，所述分子测试比培养更灵敏，且较不易于获得假阳性或假阴性结果。
发明概述
本发明的实施方案涉及用于快速检测生物或非生物样品中艰难梭菌的存在或不存在的方法。本发明包括包含进行至少一个循环步骤的艰难梭菌的检测方法，所述循环步骤可以包括扩增步骤和杂交步骤。此外，本发明涉及设计用于检测艰难梭菌的引物、探针和试剂盒。在本发明的方法中靶向用于检测艰难梭菌的基因是艰难梭菌毒素B (tcdB)基因。例如，选择编码细胞毒素B的tcdB基因，因为其被确定为对于产毒素的艰难梭菌是特异性的，并且不存在于其他梭菌属物种中，例外是索氏梭菌的一些肠毒素阴性、细胞毒素阳性的菌株(Green, 等人, J. Med. Microbiol. 1996, 44:60-64)。产毒素的艰难梭菌菌种间tcdB基因的异质性导致多达31种毒素型，迄今包括Tox 0，这是参考菌株VPI 10463。tcdB基因编码具有负责结合宿主细胞膜的C-末端结构域、参与内化的中间部分和N-末端催化(毒性)部分的单链蛋白(Rupnik, 等人, Microbiology, 2005, 151(1):199-208)。
在一个方面，本发明提供了用于检测样品中的艰难梭菌的方法，所述方法包括：进行扩增步骤，所述扩增步骤包括使样品与tcdB引物组接触，如果艰难梭菌存在于样品中，则产生扩增产物；进行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的tcdB探针接触；和检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示样品中艰难梭菌的存在，并且其中所述扩增产物的不存在指示样品中艰难梭菌的不存在。在一个实施方案中，tcdB引物组的每个引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的核苷酸序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的核苷酸序列或其互补序列组成；并且其中所述一种或多种可检测的tcdB探针包含选自SEQ ID NO: 7、8和9的核苷酸序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO: 7、8和9的核苷酸序列或其互补序列组成。在一些实施方案中，杂交步骤包括使扩增产物与由供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记的探针接触。该方法还可以包括检测探针的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在。荧光的存在或不存在指示样品中艰难梭菌的存在或不存在。
在一个方面，扩增可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。在某些方面，第一和第二荧光部分可以沿着探针长度在彼此不超过5个核苷酸内。在另一个方面，tcdB探针包括允许二级结构形成的核酸序列。此类二级结构形成通常导致第一和第二荧光部分之间的空间接近。此方法的某些实施方案中，在探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。
在另一个方面，本发明提供了检测来自个体的生物样品中艰难梭菌的存在或不存在的方法。此类方法通常包括进行至少一个循环步骤，其包括扩增步骤和染料-结合步骤。通常，所述扩增步骤包括使样品与一对tcdB引物接触，如果样品中存在tcdB核酸分子，则产生tcdB扩增产物，并且所述染料-结合步骤包括使tcdB扩增产物与双链DNA结合染料接触。此类方法还包括检测双链DNA结合染料结合至扩增产物中的存在或不存在，其中结合的存在指示样品中存在艰难梭菌，并且其中结合的不存在指示样品中不存在艰难梭菌。代表性双链DNA结合染料是溴化乙锭。此外，此类方法还可以包括确定tcdB扩增产物与双链DNA结合染料之间的解链温度，其中所述解链温度证实艰难梭菌的存在或不存在。
在进一步方面，本发明提供了用于检测艰难梭菌的核酸(tcdB目标)的试剂盒。所述试剂盒可以包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含选自SEQ ID NO:1、2和3的序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO:1、2和3的序列或其互补序列组成；第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含选自SEQ ID NO:4、5和6的序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO:4、5和6的序列或其互补序列组成；和第三可检测地标记的寡核苷酸，所述第三可检测地标记的寡核苷酸包含选自SEQ ID NO:7、8和9的序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO:7、8和9的序列或其互补序列组成。在某些实施方案中，第一和第二寡核苷酸是引物寡核苷酸，而第三可检测标记的寡核苷酸是探针寡核苷酸。
在一个实施方案中，试剂盒可以包括已用供体和相应的受体荧光部分标记的探针，或可以包括用于标记探针的荧光部分。在某些实施方案中，受体荧光部分是猝灭剂。该试剂盒还可包括核苷三磷酸、核酸聚合酶和核酸聚合酶功能所需的缓冲液中的至少一种。该试剂盒还可包括关于使用引物、探针和荧光部分以检测样品中艰难梭菌的存在或不存在的包装说明书和使用说明书。
在一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的核苷酸序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的核苷酸序列或其互补序列组成，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。在另一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包括与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9之一或其互补序列具有至少70%序列同一性(例如至少75%、80%、85%、90% 或 95%等)的核酸，所述寡核苷酸具有100个或更少，更具体地40个或更少的核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9之一或其互补序列具有90％序列同一性。通常，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在这些实施方案的某些中，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸，30个或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸，例如以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一个保守修饰的变化。
在又另一个方面，本发明提供了寡核苷酸引物对，其中第一寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:1、2和3的序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO:1、2和3的序列或其互补序列组成，且其中第二寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:4、5和6的序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO:4、5和6的序列或其互补序列组成。在这些实施方案的某些中，所述寡核苷酸中的至少一个具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸，30个或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，所述寡核苷酸中的至少一个包含至少一个修饰的核苷酸，例如，以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。在一些实施方案中，所述寡核苷酸中的至少一个包括至少一个保守修饰的变化。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是举例说明性的，并且不意图是限制性的。
本发明的一个或多个实施方案的细节在下文附随的附图和说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点根据附图和详述和权利要求将是显而易见的。
附图简述
图1A、1B和1C显示用针对艰难梭菌的毒素B基因的各种引物对产生的PCR产物的凝胶数据，和与索氏梭菌的交叉反应性的水平；CDB203BZ/CDB202BZ (图1A)，CDN211BZ/CDB214N (图1B)和CDB205BZ/CDB204BZ (图1C)。
图2A、2B和2B显示用各种引物对扩增艰难梭菌Tox 0和索氏梭菌的基因组DNA中CDB242HQ6探针的PCR生长曲线：CDB203BZ/CDB202BZ (图2A)、CDN211BZ/CDB214N (图2B)和CDB205BZ/CDB204BZ (图2C)。
发明详述
本文描述了用于检测样品中的艰难梭菌的实时测定。提供了用于检测艰难梭菌的引物和探针，以及含有此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比较用于检测艰难梭菌的实时PCR增加的灵敏度，以及改善的实时PCR特征包括样品污染(containment)和扩增产物的实时检测，使得这种技术用于在临床实验室中常规诊断艰难梭菌感染的实施可行。
所述方法可包括进行至少一个循环步骤，其包括使用一对tcdB引物扩增来自样品的tcdB核酸分子的部分。如本文使用的“ tcdB引物”是指对编码tcdB的核酸序列特异性退火并在合适条件下起始由其的合成的寡核苷酸引物。tcdB引物各自对tcdB核酸分子内或邻近的目标退火，从而使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于tcdB的核酸序列。tcdB扩增产物产生的条件是tcdB核酸存在于样品中，因此tcdB扩增产物的存在指示样品中艰难梭菌的存在。扩增产物应含有与一种或多种可检测的tcdB探针互补的核酸序列。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与一种或多种可检测的tcdB探针接触，用于检测样品中艰难梭菌的存在或不存在。
如本文使用的术语“扩增”是指合成与模板核酸分子(例如tcdB核酸分子)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度下使引物对模板核酸退火，并且由引物酶促延长，以生成扩增产物。扩增通常要求脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如Platinum® Taq)和用于聚合酶的最佳活性的合适缓冲液和/或辅因子(例如MgCl2和/或KCl)的存在。
术语“引物”在本文中如本领域技术人员已知的使用，并且是指寡聚化合物，主要是寡核苷酸，但也指修饰的寡核苷酸，其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3'-末端提供游离3'-OH基团，在那里更多的“核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶与之结合，建立3'至5'磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸盐。因此，除了可能用于预期功能外，在根据本发明的“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间不存在基本差异。
术语“杂交”是指一种或多种探针对扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针的解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。
术语“5' 至3' 外切核酸酶活性”是指通常与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5'末端去除。
术语“热稳定的聚合酶”是指其为热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且当处于升高的温度经历实现双链模板核酸变性所需的时间时，不会不可逆地变性。通常，合成在每个引物的3'末端处起始，并且沿着模板链以5'至 3'方向前进。热稳定的聚合酶已从下述中分离：黄栖热菌(Thermus fiavus)、红栖热菌(T. ruber)、嗜热栖热菌(T. thermophilus)、水生栖热菌(T. aquaticus)、乳栖热菌(T. lacteus)、红色栖热菌(T. rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)。然而，并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。
术语“其互补序列(complement thereof)”是指与给定核酸是相同长度且准确互补的核酸。
当就核酸而言使用时，术语“延伸”或“延长”是指当另外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸内时。例如，核酸任选通过掺入核苷酸的生物催化剂进行延伸，所述生物催化剂例如通常在核酸的3'末端处添加核苷酸的聚合酶。
在两个或更多个核酸序列的背景下，术语“相同的”或 “同一性”百分比是指当例如如使用技术人员可用的序列比较算法之一或通过目视检查测量的，就最大对应性比较且比对时，其为相同或具有其为相同的指定的核苷酸百分比的两个或更多个序列或子序列。适合于测定序列同一性和序列相似性百分比的示例性算法是BLAST程序，其在例如下述中描述：Altschul等人(1990) “Basic local alignment search tool” J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish等人(1993) “Identification of protein coding regions by database similarity search” Nature Genet. 3:266-272, Madden等人(1996) “Applications of network BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul 等人(1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 和Zhang等人(1997) “PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation” Genome Res. 7:649-656。
在寡核苷酸背景下的“修饰的核苷酸”是指其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸替换为给寡核苷酸提供所需性质的不同核苷酸的改变。可以在本文描述的寡核苷酸中取代的示例性修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮杂-2-脱氧黄苷、吡唑嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基 Ribo-U、2'-0-甲基 Ribo-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可以在本发明的寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或是本领域另外已知的。在某些实施方案中，相对于相应未修饰的寡核苷酸的解链温度，修饰的核苷酸取代修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步举例说明，在本发明的一些实施方案中，某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如最小化引物二聚体形成等)，增加预期目标扩增子的得率，等等。这些类型的核酸修饰的实例在例如美国专利号6,001,611中描述。
艰难梭菌核酸和寡核苷酸
本发明提供了通过扩增例如tcdB 基因的部分来检测艰难梭菌的方法。来自艰难梭菌的tcdB 基因的核酸序列是可获得的(参见例如GenBank登记号AM180355)。具体地，本发明提供了扩增且检测tcdB核酸分子的引物和探针。
对于艰难梭菌的检测，提供了扩增tcdB核酸分子的引物和探针。除本文例示那些外的tcdB核酸也可以用于检测样品中的艰难梭菌。例如，功能变体可以通过本领域技术人员使用常规方法针对特异性和/或灵敏度进行评估。代表性功能变体可以包括例如本文公开的tcdB核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。
更具体而言，本发明的寡核苷酸各自包括具有选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的序列的核酸，其基本上相同的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9之一，或SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的互补序列和变体具有至少例如80%、90%或95%的序列同一性。
表I: 正向引物
表II: 反向引物
表III: 探针
在本发明的一个实施方案中，使用tcdB引物和探针的特定组，以便提供怀疑含有艰难梭菌的生物样品中的艰难梭菌的检测。引物和探针组可以包含对于tcdB特异性的至少一个引物和探针，其包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的核酸序列，或由选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的核酸序列组成。在本发明的另一个实施方案中，对于tcdB的引物包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的引物中的任何的功能活性变体，或由SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的引物中的任何的功能活性变体组成。
SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的引物和/或探针中的任何的功能活性变体可以通过在本发明的方法中使用引物和/或探针进行鉴定。SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的任何的引物和/或探针的功能活性变体与这样的引物有关，与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的各自序列相比较，所述引物在本发明的方法或试剂盒中提供相似或更高的特异性和灵敏度。
通过一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，诸如在SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的各自序列的5'末端和/或3'末端处的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，变体可以例如与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9的序列不同。如上所详述，引物(和/或探针)可以是化学修饰的，即引物和/或探针可以包含修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)随后是修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)通过一些修饰而不同于天然“核苷酸”，但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖(pentofuranosyl sugar)或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸酯部分或磷酸酯样部分、或其组合组成。例如，“标记”可结合至“核苷酸”的碱基部分，由此获得“修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可替换为例如7-脱氮杂嘌呤，由此同样获得“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。以如上文对于“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式，“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)通过一些修饰不同于天然核苷。
扩增编码tcdB的核酸分子，例如编码tcdB的可选部分的核酸的寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物，可以使用例如计算机程序诸如OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.)进行设计。当设计待用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于合适大小的扩增产物以利于检测(例如通过电泳)，关于一对引物成员相似的解链温度，和每个引物的长度(即，引物需要足够长来以序列特异性退火且起始合成，但不是如此长，使得保真度在寡核苷酸合成期间减少)。通常，寡核苷酸引物是长度8 – 50个核苷酸(例如，长度8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸)。
除了一组引物以外，本发明的方法还可以使用一种或多种探针，以便检测艰难梭菌的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其通过设计或选择而含有特定核苷酸序列，这允许其在限定的预定严格性下与“目标核酸”，在本文情况下，与tcdB (目标)核酸特异性(即优先)杂交。“探针”可以被称为“检测探针”，意指它检测目标核酸。
根据本发明，所述tcdB探针可以用至少一种荧光标记进行标记。在一个实施方案中，tcdB探针可以用供体荧光部分例如荧光染料和相应的受体荧光部分例如猝灭剂进行标记。
在本发明的一个实施方案中，至少一个探针包含荧光部分和核酸序列或由荧光部分和核酸序列组成，所述核酸序列选自SEQ ID NO: 7、8和9(不含标记显示)。
设计待用作杂交探针的寡核苷酸可以类似于引物设计的方式进行。本发明的实施方案可以使用单个探针或一对探针用于检测扩增产物。取决于实施方案，使用的探针可以包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以使序列特异性杂交发生，但不如此长，使得保真度在合成期间减少。寡核苷酸探针通常是长度15 - 30(例如16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
本发明的构建体包括含有tcdB核酸分子(例如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9)的载体。本发明的构建体可以用作例如对照模板核酸分子。适合于在本发明中使用的载体是商购可得的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法产生。TcdB核酸分子可以例如通过化学合成、由艰难梭菌直接克隆、或通过PCR扩增而获得。
除了tcdB核酸分子(例如含有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和9中的一个或多个序列的核酸分子)以外，适合于在本发明的方法中使用的构建体通常还包括编码用于选择所需构建体和/或转化体的可选标记(例如抗生素抗性基因)的序列、和复制起点。载体系统的选择通常取决于几个因素，包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、可选择性、可诱导性和易于回收。
本发明含有tcdB核酸分子的构建体可以在宿主细胞中繁殖。如本文使用的术语宿主细胞意欲包括原核生物和真核生物，例如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可以包括大肠杆菌(E. coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母诸如酿酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，哺乳动物细胞诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，昆虫细胞和植物细胞诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)。本发明的构建体可以使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术引入宿主细胞内。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是用于将核酸引入宿主细胞内的常见方法。此外，裸露DNA可以直接递送给细胞(参见例如，美国专利号5,580,859和5,589,466)。
聚合酶链式反应(PCR)
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规PCR技术。PCR通常采用两个寡核苷酸引物，其与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合。在本发明中有用的引物包括能够充当在tcdB核酸序列(例如SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和 6)内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优选是单链的，但引物可以是双链的。首先将双链引物变性，即处理以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至它占优势地变性(例如大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性)。用于使模板核酸变性必需的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度和变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常范围为约90℃ - 约105℃一段时间，所述时间取决于反应特征例如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒 - 4分钟(例如1分钟 - 2分钟30秒，或1.5分钟)。
如果双链模板核酸通过加热变性，则允许反应混合物冷却至促进每个引物对其在tcdB核酸上的目标序列退火的温度。用于退火的温度通常是约35℃ - 约65℃(例如约40℃ - 约60℃；约45℃ - 约50℃)。退火时间可以是约10秒 – 约1分钟(例如约20秒 – 约50秒；约30秒 – 约40秒)。随后将反应混合物调整至在其下聚合酶的活性得到促进或最佳化的温度，即足以使延伸从退火引物发生，以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以由对核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应如此高，以便使来自其互补模板的延伸产物变性(例如用于延伸的温度通常范围为约40℃ - 约80℃(例如约50℃ - 约70℃；约60℃)。延伸时间可以是约10秒 – 约5分钟(例如约30秒 – 约4分钟；约1分钟 – 约3分钟；约1分钟30秒 – 约2分钟)。
PCR测定可以采用艰难梭菌核酸诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸无需纯化；它可以是复杂混合物的较小部分，诸如人细胞中含有的艰难梭菌核酸。艰难梭菌核酸可以通过常规技术从生物样品中提取，所述常规技术诸如Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Persing等人(编), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.)中所述的那些。核酸可以得自许多(any number of)来源诸如质粒，或天然来源包括细菌、酵母、病毒、细胞器，或高等生物诸如植物或动物。
寡核苷酸引物(例如SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6)与PCR试剂在诱导引物延伸的反应条件下组合。例如，链延伸反应通常包括50 mM KCl、10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、15 mM MgCl2、0.001%(w/v)明胶、0.5-1.0 µg变性模板DNA、50 pmol的每个寡核苷酸引物、2.5 U Taq聚合酶和10％DMSO)。反应通常含有150 - 320 µM的每种dATP、dCTP、dTTP、dGTP，或其一种或多种类似物。
新近合成的链形成可以在反应的以后步骤中使用的双链分子。链分离、退火和延长步骤可以根据需要重复多次，以产生所需数量的对应于目标tcdB核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。循环步骤(即变性、退火和延伸)优选重复至少一次。对于在检测中的使用，循环步骤数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的目标序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。
荧光共振能量转移(FRET)
FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于下述概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分置于彼此一定距离内时，能量转移在两个荧光部分之间发生，其可以显现或另外检测和/或定量。当供体通过光辐射用合适波长激发时，供体通常将能量转移给受体。受体通常用不同波长再发射以光辐射形式的转移能量。
在一个实例中，寡核苷酸探针可以含有供体荧光部分和相应的猝灭剂，其消散以除光以外形式的转移能量。当探针完整时，能量转移通常在两个荧光部分之间发生，使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针通过例如Taq聚合酶的5' 至 3'外切核酸酶活性切割，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于这个目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、Iowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa)、BlackBerry™猝灭剂650 (BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)。
在另一个实例中，各自含有荧光部分的两个寡核苷酸探针可以在特定位置处与扩增产物杂交，所述特定位置通过寡核苷酸探针与tcdB目标核酸序列的互补性决定。在寡核苷酸探针在合适位置处与扩增产物核酸杂交后，生成FRET信号。杂交温度可以范围为约35℃到约65℃，约10秒到约1分钟。
荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(含有合适的二色镜和滤器用于监控在特定范围上的荧光发射)、光子计数光电倍增系统或荧光计进行。起始能量转移的激发可以用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光导纤维光源或对于所需范围中的激发适当过滤的其他高强度光源进行。
如本文就供体和相应的受体荧光部分使用的，“相应的”是指具有重叠供体荧光部分的激发光谱的发射光谱的受体荧光部分。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长大至少100 nm。相应地，有效的非辐射性能量转移可以在两者之间产生。
荧光供体和相应的受体部分通常就下述进行选择：(a)高效率福斯特能量转移；(b)大的最终斯托克斯位移(>100 nm)；(c)发射尽可能远地进入可见光谱的红色部分内的位移(>600 nm)；和(d)发射向高于通过在供体激发波长处的激发产生的拉曼水荧光发射波长的位移。例如，可以选择供体荧光部分，其具有接近激光线的最大激发(例如氦-镉442 nm或氩488 nm)、高消光系数、高量子产率、及其荧光发射与相应受体荧光部分的激发光谱的良好重叠。可以选择相应的受体荧光部分，其具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠、和在可见光谱的红色部分中的发射(>600 nm)。
可以在FRET技术中与多个受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、萤光黄VS、4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸衍生物。取决于使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二乙撑三胺五乙酸酯、或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可以例如得自Molecular Probes(Junction City, Oreg.)或Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)。
供体和受体荧光部分可以经由接头臂结合至合适的探针寡核苷酸。每个接头臂的长度是重要的，因为接头臂将影响供体和受体荧光部分之间的距离。用于本发明目的的接头臂长度是从核苷酸碱基到荧光部分以埃(Å)表示的距离。通常而言，接头臂是约10 Å – 约25 Å。接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂结合至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分结合至接头臂的方法。
受体荧光部分诸如LC Red 640-NHS-酯可以与C6-亚磷酰胺(可得自ABI (Foster City, Calif.)或Glen Research (Sterling, Va.))组合，以产生例如LC Red 640-亚磷酰胺。频繁使用的将供体荧光部分例如荧光素偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene (Ashland, Mass.)的荧光素-CPG's)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex (San Ramon, Calif.)的荧光素-CPG)、或在寡核苷酸合成后需要荧光素-NHS-酯偶联的3'-氨基-CPGs。
艰难梭菌的检测
本发明提供了用于检测生物或非生物样品中艰难梭菌的存在或不存在的方法。要求保护的方法可以避免样品污染(例如，运行与运行间的遗留污染)、假阴性(例如，灵敏度)和假阳性(例如，特异性)的问题。该方法包括进行至少一个循环步骤和FRET检测步骤，所述循环步骤包括使用一对tcdB引物从样品中扩增tcdB核酸分子的部分。进行多个循环步骤，优选在热循环仪中。本发明的方法可以使用tcdB引物和探针进行，以检测tcdB的存在，并且tcdB的检测指示样品中艰难梭菌的存在。
如本文描述的，扩增产物可以使用利用FRET技术的标记的杂交探针进行检测。一个FRET形式利用TaqMan®技术，以检测扩增产物的存在或不存在，并且因此检测艰难梭菌的存在或不存在。TaqMan®技术利用由两个荧光部分标记的一个单链杂交探针。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与目标DNA(即扩增产物)结合，并且在后续延长期过程中通过Taq聚合酶的5'至 3'外切核酸酶活性降解。因此，激发的荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。例如，ABI PRISM® 7700序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)使用TaqMan®技术，并且适合于进行本文描述的方法用于检测样品中艰难梭菌的存在或不存在。
与FRET结合的分子信标也可以用于使用本发明的实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用由第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，并且荧光标记通常位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。由于在探针内的二级结构形成，当探针在溶液中时，两个荧光部分处于空间接近。在与目标核酸(即扩增产物)杂交后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，使得在用合适波长的光激发后，可以检测到第一荧光部分的发射。
另一个常见形式的FRET技术利用两个杂交探针。每个探针可以由不同荧光部分标记，并且通常设计为在目标DNA分子(例如扩增产物)中彼此紧密接近杂交。供体荧光部分例如荧光素在470 nm处通过LightCycler®仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移给受体荧光部分诸如LightCycler®-Red 640 (LC Red 640)或LightCycler®-Red 705 (LC Red 705)。受体荧光部分随后发出更长波长的光，其通过LightCycler®仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分处于直接局部接近时，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才可发生。发出信号的强度可以与原始目标DNA分子数目(例如艰难梭菌基因组数目)关联。如果发生tcdB核酸的扩增，并且产生扩增产物，则杂交步骤导致基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。
通常，FRET的存在指示样品中艰难梭菌的存在，并且FRET的不存在指示样品中艰难梭菌的不存在。然而，不足够的样本收集、运送延迟、不合适的运送条件或某些收集拭子的使用(海藻酸钙或铝柄(aluminum shaft))都是可以影响测试结果的成功和/或准确度的条件。使用本文公开的方法，在例如45个循环步骤内的FRET检测指示艰难梭菌感染。
可以在实践本发明的方法中使用的代表性生物样品包括但不限于皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养、皮肤和软组织感染。生物样品的收集和贮存方法是本领域技术人员已知的。生物样品可以进行处理(例如通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)，以释放艰难梭菌核酸，或在一些情况下，生物样品可以直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。
解链曲线分析是可以包括在循环概况中的另外步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，所述解链温度定义为在其下一半DNA双链体已分离成单链的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子具有比具有丰富A和T核苷酸的那些更高的Tm。通过检测在其下丧失信号的温度，可以测定探针的解链温度。类似地，通过检测在其下生成信号的温度，可以测定探针的退火温度。来自tcdB扩增产物的tcdB探针的解链温度可以证实样品中艰难梭菌的存在或不存在。
在每个热循环运行内，同样使对照样品循环。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针来扩增艰难梭菌核酸对照模板(除了tcdB以外)。阳性对照样品还可扩增例如含有tcdB核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可以在内部(例如在样品内)或在分开的样品运行中与患者样品并行扩增。每个热循环仪运行也可包括阴性对照，其例如缺乏艰难梭菌模板DNA。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指示剂。因此，对照反应可以容易地测定例如引物以序列特异性退火且起始延长的能力，以及探针以序列特异性杂交和FRET发生的能力。
在一个实施方案中，本发明的方法包括避免污染的步骤。例如，利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述，以减少或消除一个热循环仪运行和下一个之间的污染。
与FRET技术结合的常规PCR方法可以用于实践本发明的方法。在一个实施方案中，使用LightCycler®仪器。下述专利申请描述如在LightCycler®技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。
LightCycler®可以使用PC工作站进行操作，并且可以利用Windows NT操作系统。当机器将毛细管顺次置于光学单元上时，可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时展示荧光信号。荧光采集时间是10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤后，可以对于所有样品不断更新荧光相对于循环数目的定量显示。生成的数据可以保存用于进一步分析。
作为FRET的替代，扩增产物可以使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如SYBR® Green或SYBR® Gold (Molecular Probes))进行检测。在与双链核酸相互作用后，此类荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发出荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料诸如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。
应当理解本发明并不受一种或多种商购可得仪器的配置限制。
制品/试剂盒
本发明还提供了检测艰难梭菌的制品或试剂盒。根据本发明的制品可以包括用于检测艰难梭菌的引物和/或探针，连同合适的包装材料。用于检测艰难梭菌的代表性引物和探针能够与tcdB核酸分子杂交。此外，该试剂盒还可包括合适包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料，例如固体支持物、缓冲液、酶和DNA标准品。设计引物和探针的方法在本文中公开，并且提供了扩增tcdB核酸分子和与tcdB核酸分子杂交的引物和探针的代表性实例。
本发明的制品还可包括一种或多种荧光部分用于标记探针，或可替代地，可以标记由试剂盒供应的探针。例如，制品可以分别包括用于标记tcdB探针之一的供体荧光部分和用于标记另一个tcdB探针的受体荧光部分。合适的FRET供体荧光部分和相应的受体荧光部分的实例在上文提供。
本发明的制品还可含有包装说明书或包装标签，在其上具有关于使用tcdB引物和探针检测样品中的艰难梭菌的指导。制品可以另外包括用于进行本文公开的方法的试剂(例如缓冲液、聚合酶、辅因子、或预防污染的试剂)。此类试剂可以对于本文描述的商购可得的仪器之一是特异性的。
本发明还将在下述实施例中描述，所述实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
实施例
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，其真正范围在随附权利要求中记载。应当理解可以在所述程序中作出修改，而不背离本发明的精神。
实施例 1
与索氏梭菌的交叉反应性
包含以下引物组的三种活化的主混合物(MMx)：a) CDB203BZ/CDB202BZ (SEQ ID NO:2和4的烷基化版本 - 两种引物都是在3'末端碱基(苄基)烷基化，b) CDB211BZ /CDB214N，正向引物是(苄基)烷基化的，且反向引物是未烷基化的，和c) CDB205BZ/CDB204BZ (SEQ ID NO:3和5的烷基化版本 - 两种引物都是在3'末端碱基(苄基)烷基化，使用作为用于检测的裸探针的相同探针CDB242HQ6 (SEQ ID NO. 9)进行测试。
一式三份的以1+E3基因组当量(genomic equivalent, ge)投入(input)的Tox 0和6份重复的以1+E6 ge投入的索氏梭菌11279和11266的独有物种的基因组DNA模板，连同无模板对照缓冲液用3种活化的MMx在LC480仪器上扩增。每种模板的重复反应物连同100 bp分子量标记物在凝胶上运行(图1A-C)。
凝胶数据显示，对于阳性对照模板，最特异性PCR产物由CDB211BZ/124N生成，随后为CDB203BZ/202BZ，然后为CDB205BZ/204BZ；阴性对照没有揭示用所有3个引物组的任何PCR特异性产物，但非特异性产物是引物对CDB211BZ/214N的现象。三种引物对中，使用两种索氏梭菌分离株11279和11266作为模板，只有CDB211BZ/214N生成可见的特异性PCR产物。偶尔，CDB203BZ/202BZ会生成针对索氏梭菌的基因组模板的PCR特异性产物，然而产物产量从未与CDB211BZ/214N相匹配。(NC：无模板对照，PC：艰难梭菌Tox 0基因组DNA，100 bp梯(ladder)作为分子量标记物。)
尽管索氏梭菌的扩增用引物对CDB211BZ/214N进行(图1B)，然而所述探针能够针对索氏梭菌进行区分，而不生成任何生长曲线(图2B)。
尽管前述发明已经出于清楚和理解的目的进行相当详细地描述，但本领域技术人员从阅读本公开将清楚的是，可以进行形式和细节的各种改变，而不脱离本发明的真正范围。例如，上述所有技术和设备可以以各种组合使用。

Claims (16)

1.检测样品中的艰难梭菌(C. difficile)的方法，所述方法包括：
- 进行扩增步骤，所述扩增步骤包括使样品与tcdB引物组接触，如果tcdB核酸存在于样品中，则产生扩增产物；
- 进行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测的tcdB探针接触；和
- 检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示样品中艰难梭菌的存在，并且其中所述扩增产物的不存在指示样品中艰难梭菌的不存在；
其中tcdB引物组的每个引物包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5和6的序列或其互补序列；
并且
其中一种或多种可检测的tcdB探针包含选自SEQ ID NO: 7、8和9的序列或其互补序列。
2.权利要求1的方法，其中：
- 所述杂交步骤包括使扩增产物与用供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记的探针接触；和
- 所述检测步骤包括检测探针的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在指示样品中艰难梭菌的存在或不存在。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述扩增采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。
4.权利要求2或3中任一项的方法，其中所述第一和第二荧光部分在所述探针上彼此的不超过5个核苷酸之内。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述第二荧光部分是猝灭剂。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述tcdB探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致所述第一和第二荧光部分之间的空间接近。
7.用于检测艰难梭菌的核酸的试剂盒，其包含：
- 第一寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO: 1、2和3的序列或其互补序列；
- 第二寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO: 4、5和6的序列或其互补序列；和
- 第三可检测标记的寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO: 7、8和9的序列或其互补序列。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述第三可检测标记的寡核苷酸包含供体荧光部分和相应的受体荧光部分。
9.权利要求8的试剂盒，其中所述受体荧光部分是猝灭剂。
10.权利要求7-9中任一项的试剂盒，其进一步包含以下组分中的至少一种：核苷三磷酸、核酸聚合酶和对于所述核酸聚合酶的功能必需的缓冲液。
11.寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的核苷酸序列或其互补序列。
12.权利要求11的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。
13.权利要求11或12中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个保守修饰的变化。
14.权利要求11-13中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。
15.权利要求11-14中任一项的寡核苷酸，其进一步包含一个或多个可检测的标记。
16.权利要求11-15中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个标记部分和/或至少一个猝灭剂部分。
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