CN104540967A - 用于检测单纯疱疹病毒1和2的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于快速检测生物或非生物样品中单纯疱疹病毒1和2 (HSV-1和HSV-2)的存在或不存在的方法。所述方法可以包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外，提供了靶向HSV-1病毒DNA聚合酶B (HSV-1 Pol)和HSV-1胸苷激酶C (HSV-1 TK)的基因和还靶向HSV-2胸苷激酶C (HSV-2 TK)和HSV-2糖蛋白B (HSV-2 gB)的基因的引物、探针以及经设计用于检测HSV-1和/或HSV-2的试剂盒。

Description

用于检测单纯疱疹病毒1和2的组合物和方法
发明领域
本发明涉及病毒诊断的领域，并且更具体而言，涉及单纯疱疹病毒1 和/或2的检测。
发明背景
单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)，也称为人疱疹病毒1和2型(HHV-1和-2)，是包膜双链DNA病毒，且属于疱疹病毒科(herpes virus family)疱疹病毒科(Herpesviridae)。通常，HSV病毒感染人的嘴(HSV-1)和生殖器(HSV-2)的皮肤或粘膜。HSV病毒能够在初始感染后建立终身潜伏感染，且从潜伏再活化进行新爆发。HSV感染通常涉及皮肤或粘膜上小水疱的长出，其后，病毒在提供感染区域的神经细胞内仍然处于休眠状态。病毒经历再活化的周期，其中病毒穿过神经纤维回到皮肤，且由此引起与较早感染的相同的皮肤区域中的水疱长出。还存在不涉及水疱形成的情况。
HSV是多种病症(包括失明和脑炎)的病原体。如果不进行治疗，则后者疾病的死亡率高达70％，相比之下，接受治疗的那些中只有19％。约38％的经治疗患者完全恢复，这强调了早期诊断HSV感染的重要性。HSV-1主要引起成人脑炎，而HSV-2更常见地引起新生儿脑炎，后者与母体生殖器感染相关。此外，HSV-2是社会中最常见的性传播疾病之一。HSV相关脑炎的致死率比所有其他类型的脑炎更高，为1至4/每百万/每年。其症状的大多种类包括发烧、头痛、癫痫、意识水平改变和性格改变。
传统上，据信HSV-1引起口腔感染，而HSV-2引起生殖器感染。然而，在许多发达国家中，HSV-1是原发性生殖器疱疹的较常见原因，且经常与HSV-2共感染。作为结果，拥有能够同时检测和鉴别两种病毒的PCR测定变得非常重要。这个新的HSV测定经设计以便在单一反应管中完成该测定。
HSV-1和/或HSV-2(HSV-1/2)感染的诊断通常使用适当临床样本上的细胞培养来进行，这耗时又费力。此外，HSV-1/2感染的血清学诊断缺乏足够灵敏度和特异性。因此，本领域中需要快速和可靠的方法来以灵敏的方式特异性检测两种类型的HSV。
发明概述
本发明的实施方案涉及用于快速检测生物或非生物样品中HSV-1 和/或HSV-2核酸的存在或不存在的方法，例如，通过在单一试管中的实时聚合酶链式反应多重检测HSV-1和/或HSV-2核酸。实施方案包括检测HSV-1和/或HSV-2核酸的存在或不存在的方法，包括进行至少一个循环步骤，其可包括扩增步骤和杂交步骤。此外，实施方案包括设计用于检测单一管中的单一HSV-1或HSV-2感染或HSV-1和HSV-2共感染的寡核苷酸引物、寡核苷酸探针和试剂盒。检测方法被设计为靶向HSV-1病毒DNA聚合酶B (HSV-1 Pol)和HSV-1胸苷激酶C (HSV-1 TK)的基因，并且还同时靶向HSV-2胸苷激酶C (HSV-2 TK)和HSV-2糖蛋白B (HSV-2 gB)的基因，这允许在单一测试中检测和区分HSV-1和/或HSV-2感染。
在一个实施方案中，提供了检测样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的存在或不存在的方法，其包括进行扩增步骤，所述扩增步骤包括将样品与多组的HSV-1和HSV-2寡核苷酸引物接触，如果样品中存在任何HSV-1和/或HSV-2核酸，则产生一种或多种扩增产物；进行杂交步骤，所述杂交步骤包括将一种或多种扩增产物与多种可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针接触；和检测一种或多种扩增产物的存在或不存在，其中一种或多种扩增产物的存在表明样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的存在，且其中一种或多种扩增产物的不存在表明样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的不存在；其中多组HSV-1和HSV-2寡核苷酸引物包括扩增HSV-1 Pol和HSV-1 TK基因目标的HSV-1寡核苷酸引物组，和扩增HSV-2 TK和HSV-2 gB基因目标的HSV-2寡核苷酸引物组，且其中所述多个可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针包括对于HSV-1 Pol和HSV-1 TK扩增产物特异性的至少两个HSV-1寡核苷酸探针，和对于HSV-2 TK和HSV-2 gB扩增产物特异性的至少两个HSV-2寡核苷酸探针。
在一个实施方案中，用于扩增HSV-1 Pol基因目标的寡核苷酸引物组包括具有包含SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；用于扩增HSV-1 TK基因目标的寡核苷酸引物组包括具有包含SEQ ID NO:4和5的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；用于扩增HSV-2 TK基因目标的寡核苷酸引物组包括具有包含SEQ ID NO:7和8的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；且用于扩增HSV-2 gB基因目标的寡核苷酸引物组包括具有包含SEQ ID NO:10和11的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸。 进一步，用于检测HSV-1 Pol扩增产物的可检测的HSV-1寡核苷酸探针具有包括SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-1 TK扩增产物的可检测的HSV-1寡核苷酸探针具有包括SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-2 TK扩增产物的可检测的HSV-2寡核苷酸探针具有包括SEQ ID NO:9的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-2 gB扩增产物的可检测的HSV-2寡核苷酸探针具有包括SEQ ID NO:12的核酸序列或其互补序列。在所述方法的另一个实施方案中，所述多个可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针各自用供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记，其中所述检测步骤包括检测HSV-1和/或HSV-2寡核苷酸探针中的一个或多个的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在表明样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的存在或不存在。
本发明的其他实施方案提供了寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12的核酸序列或其互补序列，或由其组成，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在另一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包括与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12之一具有至少70%序列同一性(例如至少75%、80%、85%、90% 或 95%等)的核酸或其互补序列，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。通常，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。在这些实施方案的某些中，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如35个或更少的核苷酸，30个或更少的核苷酸等)。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸，例如以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一个或多个可检测的标记。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个标记部分和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一个保守修饰的变化。特定核酸序列的“保守修饰的变化”或者，简单地，“保守的变化”是指这样的核酸，其编码相同或基本上相同的氨基酸序列，或当所述核酸不编码氨基酸序列时，为基本上相同的序列。技术人员将认识到在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸(通常小于5%，更通常小于4%、2%或1%)的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变化”，其中改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸由化学上相似的氨基酸的取代。
本发明的其它实施方案提供了包含适于从HSV-1 DNA聚合酶B (HSV-1 Pol)和HSV-1胸苷激酶C (HSV-1 TK)基因目标产生一种或多种扩增产物的一组寡核苷酸引物的组合物，所述寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:1、2、4和5的核酸序列或其互补序列或由其组成，所述寡核苷酸引物具有100或更少的核苷酸。在本发明的另一个实施方案中，提供了包含适于从HSV-2胸苷激酶C (HSV-2 TK)和HSV-2糖蛋白B (HSV-2 gB)基因目标产生一种或多种扩增产物的一组寡核苷酸引物的组合物，所述寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO:7、8、10和11的核酸序列或其互补序列或由其组成，所述寡核苷酸引物具有100或更少的核苷酸。在某些实施方案中，所述组合物包含一组寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物包含选自SEQ ID NO: 1、2、4、5、7、8、10和11的核酸序列或其互补序列或由其组成，所述寡核苷酸引物具有100或更少的核苷酸。在本发明的又另一个实施方案中，提供了包含适于检测HSV-1 DNA聚合酶B (HSV-1 Pol)和HSV-1胸苷激酶C (HSV-1 TK)扩增产物的一组可检测的寡核苷酸探针的组合物，所述寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:3和6的核酸序列或其互补序列，所述寡核苷酸探针具有100或更少的核苷酸。在又另一个实施方案中，提供了包含适于检测HSV-2胸苷激酶C (HSV-2 TK)和HSV-2糖蛋白B (HSV-2 gB)扩增产物的一组可检测的寡核苷酸探针的组合物，所述寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:9和12的核酸序列或其互补序列，所述寡核苷酸探针具有100或更少的核苷酸。在某些实施方案中，所述组合物包含一组寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含选自SEQ ID NO: 3、6、9和12的核酸序列或其互补序列或由其组成，所述寡核苷酸探针具有100或更少的核苷酸。
在一个方面，扩增可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。因此，第一和第二荧光部分可以沿着寡核苷酸探针长度在彼此不超过5个核苷酸内。在另一个方面， HSV-1和HSV-1寡核苷酸探针包括允许二级结构形成的核酸序列。此类二级结构形成通常导致第一和第二荧光部分之间的空间接近。此方法的一些实施方案中，在寡核苷酸探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。
在又另一个方面，本发明提供了检测来自个体的生物样品中HSV-1和/或HSV-2的存在或不存在的方法。此类方法通常包括进行至少一个循环步骤，其包括扩增步骤和染料-结合步骤。通常，所述扩增步骤包括使样品与多对HSV-1/2引物接触，如果样品中存在HSV-1和/或HSV-2核酸分子，则产生一种或多种HSV-1/2扩增产物，并且所述染料-结合步骤包括使HSV-1/2扩增产物与双链DNA结合染料接触。此类方法还包括检测双链DNA结合染料结合至扩增产物中的存在或不存在，其中结合的存在表明样品中存在HSV-1/2，并且其中结合的不存在表明样品中不存在HSV-1/2。代表性双链DNA结合染料是溴化乙锭。此外，此类方法还可以包括确定HSV-1/2扩增产物与双链DNA结合染料之间的解链温度，其中所述解链温度证实HSV-1和/或HSV-2的存在或不存在。
在进一步实施方案中，提供了用于检测HSV-1和/或HSV-2的一种或多种核酸的存在或不存在的试剂盒。所述试剂盒可以包括对于扩增HSV-1 Pol和HSV-1 TK基因目标和HSV-2 TK和HSV-2 gB基因目标特异性的多组HSV-1和HSV-2寡核苷酸引物；和对于检测HSV-1 Pol和HSV-1 TK扩增产物和HSV-2 TK和HSV-2 gB扩增产物特异性的多个可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针。
在某些实施方案中，所述试剂盒包括用于扩增HSV-1 Pol基因目标的引物组，其包含具有包含SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；用于扩增HSV-1 TK基因目标的引物组，其包含具有包含SEQ ID NO:4和5的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；用于扩增HSV-2 TK基因目标的引物组，其包含具有包含SEQ ID NO:7和8的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；用于扩增HSV-2 gB基因目标的引物组，其包含具有包含SEQ ID NO:10和11的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；和用于检测HSV-1 Pol扩增产物的可检测的HSV-1寡核苷酸探针，其具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-1 TK扩增产物的可检测的HSV-1寡核苷酸探针，其具有包含SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-2 TK扩增产物的可检测的HSV-2寡核苷酸探针，其具有包含SEQ ID NO:9的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-2 gB扩增产物的可检测的HSV-2寡核苷酸探针，其具有包含SEQ ID NO:12的核酸序列或其互补序列。
在一个方面，试剂盒可以包括已用供体和相应的受体荧光部分标记的寡核苷酸探针，或可以包括用于标记探针的荧光部分。在某些方面，受体荧光部分是猝灭剂。该试剂盒还可包括核苷三磷酸、核酸聚合酶和核酸聚合酶功能所需的缓冲液。该试剂盒还可包括关于使用寡核苷酸引物、寡核苷酸探针和荧光部分检测样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的存在或不存在的包装说明书和使用说明书。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是举例说明性的，并且不意图是限制性的。
本发明的一个或多个实施方案的细节在下文附图和说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点根据附图和详述和权利要求是显而易见的。
附图简述
图1A显示使用在HSV-1 TK-C区域运作良好的引物的实验的PCR生长曲线。图1B显示使用在HSV-2 TK-C区域运作良好的引物的实验的PCR生长曲线。
图2显示针对HSV TK-C区域的PCR产物的凝胶电泳。
图3A显示使用针对HSV-1 TK-B区域的引物的实验的PCR生长曲线。图3B显示使用针对HSV-2 TK-B区域的引物的实验的PCR生长曲线。
图4显示针对HSV TK-B区域的PCR产物的凝胶电泳。
图5显示三次HSV-1测定(Pol-B、TK-A和TK-C)的生长曲线，10个vp (病毒颗粒)/PCR。
图6显示三次HSV-2测定(gB3、Pol-B和TK-C)的生长曲线，10个vp(病毒颗粒)/PCR。
图7显示通过Probit分析的三次独立HSV-1测定(Pol-B、TK-A和TK-C)的测定分析灵敏度。
图8显示通过Probit分析的三次独立HSV-2测定(gB3、Pol-B和TK-C)的测定分析灵敏度。
图9A和9B显示在两种目标存在的情况下与通用PCR引物的目标竞争。
图10A和10B显示在两种目标存在的情况下与单一通用PCR引物的目标竞争。
图11A和11B显示在两种目标存在的情况下与类型特异性PCR引物的目标竞争。
图12A和12B显示用HSV-1质粒的双重目标HSV-1/2测定的交叉反应性分析。
图13A和13B显示用HSV-2质粒的双重目标HSV-1/2测定的交叉反应性分析。
图14显示用其他密切相关的疱疹病毒的HSV-1/2测定的交叉反应性的表格。
发明详述
通过核酸扩增诊断HSV-1和/或HSV-2感染提供了用于快速且准确检测病毒感染的方法。本文描述了用于检测样品中的HSV-1/2的实时测定。提供了用于检测HSV-1/2的引物和探针，以及含有此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比较用于检测HSV-1/2的实时PCR增加的灵敏度，以及改善的实时PCR特征包括样品污染(containment)和扩增产物的实时检测，使得这种技术用于在临床实验室中常规诊断HSV-1/2感染的实施可行。
所述方法可包括进行至少一个循环步骤，其包括使用多对引物(包括HSV-1 Pol引物、HSV-1 TK引物、HSV-2 TK引物和HSV-2 gB引物)从样品扩增HSV-1 Pol和HSV-1 TK核酸分子基因目标的一个或多个部分和HSV-2 TK和HSV-2 gB核酸分子基因目标的一个或多个部分。如本文使用的“HSV-1 Pol引物”、“HSV-1 TK引物”、“HSV-2 TK引物”和“HSV-2 gB引物”是指对分别编码HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK、和HSV-2 gB的核酸序列特异性退火并在合适条件下起始由其的合成的寡核苷酸引物。所讨论的HSV-1和HSV-2引物各自对分别HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK和HSV-2 gB目标核酸分子内或邻近的目标退火，使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于各自目标的核酸序列。产生HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK和HSV-2 gB扩增产物中的一种或多种，条件是样品中存在HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK和HSV-2 gB核酸中的一种或多种，因此，HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK和HSV-2 gB扩增产物中的一种或多种的存在表明样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的存在。扩增产物应含有与HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK、和HSV-2 gB的一种或多种可检测的探针互补的核酸序列。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤，其中使样品与HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK、和HSV-2 gB的一种或多种可检测的探针接触，用于检测样品中HSV-1和/或HSV-2的存在或不存在。
HSV-1/2检测方法的实施方案能够检测和区分单一PCR管中的HSV-1和HSV-2病毒类型两者，另外，利用用于目标探测的双重目标方法。这种双重目标方法提供了某些优势。例如，HSV-1/2引物和探针结合位点处的未知突变可以存在，使得可能潜在地损害HSV-1/2检测测定性能。为了尽可能减少本发明的实施方案中的此类风险，选择两个独立的基因区域作为HSV-1和HSVI-2病毒类型中每种的PCR目标，即，用于HSV-1的HSV-1 Pol 和HSV-1 TK以及用于HSV-2的HSV-2 TK和HSV-2 gB。因为两个单独基因区域中的引物和探针结合位点同时发生未知突变的机会相当低，所以目前要求保护的双重目标HSV-1/2检测方法的测定性能是不太可能受未知突变负面影响。
此处所述的方法可以同时检测HSV-1和HSV-2二者，和在单一PCR反应中区分它们。所述方法可以利用病毒类型特异性引物和探针，当HSV-1和HSV-2两者共存于单一样品、但具有不同的病毒滴度时，这可避免目标竞争。不仅在HSV-1和HSV-2病毒类型之间，而且与其他密切相关的疱疹病毒之间，用于检测HSV-1/2的引物和探针都不具有交叉反应性。此外，在本HSV-1/2检测方法的实施方案中使用的双重目标方法可以尽可能减少由于引物和探针结合位点处的未知突变引起的对测定性能的潜在负面影响。
如本文使用的术语“扩增”是指合成与模板核酸分子(例如HSV-1 DNA Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK、和HSV-2 gB核酸分子)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性，在低于引物解链温度的温度下使引物对模板核酸退火，并且由引物酶促延长，以生成扩增产物。扩增通常要求脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如Platinum® Taq)和用于聚合酶的最佳活性的合适缓冲液和/或辅因子(例如MgCl2和/或KCl)的存在。
术语“引物”在本文中如本领域技术人员已知的使用，并且是指寡聚化合物，主要是寡核苷酸，但也指修饰的寡核苷酸，其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3'-末端提供游离3'-OH基团，在那里更多的“核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶与之结合，建立3'至5'磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸盐。因此，除了可能用于预期功能外，在根据本发明的“引物”、“寡核苷酸”或“探针”之间不存在基本差异。
术语“杂交”是指一种或多种探针对扩增产物的退火。杂交条件通常包括低于探针的解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。
术语“5' 至3' 外切核酸酶活性”是指通常与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5'末端去除。
术语“热稳定的聚合酶”是指其为热稳定的聚合酶，即该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且当处于升高的温度经历实现双链模板核酸变性所需的时间时，不会不可逆地变性。通常，合成在每个引物的3'末端处起始，并且沿着模板链以5’ 至 3’方向前进。热稳定的聚合酶已从下述中分离：黄栖热菌(Thermus fiavus)、红栖热菌(T. ruber)、嗜热栖热菌(T. thermophilus)、水生栖热菌(T. aquaticus)、乳栖热菌(T. lacteus)、红色栖热菌(T. rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)。然而，并非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中，条件是补充该酶。
术语“其互补序列(complement thereof)”是指与给定核酸是相同长度且准确互补的核酸。
当就核酸而言使用时，术语“延伸”或“延长”是指当另外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸内时。例如，核酸任选通过掺入核苷酸的生物催化剂进行延伸，所述生物催化剂例如通常在核酸的3'末端处添加核苷酸的聚合酶。
在两个或更多个核酸序列的背景下，术语“相同的”或 “同一性”百分比是指当例如如使用技术人员可用的序列比较算法之一或通过目视检查测量的，就最大对应性比较且比对时，其为相同或具有其为相同的指定核苷酸百分比的两个或更多个序列或子序列。适合于测定序列同一性和序列相似性百分比的示例性算法是BLAST程序，其在例如下述中描述：Altschul等人(1990) “Basic local alignment search tool” J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish等人(1993) “Identification of protein coding regions by database similarity search” Nature Genet. 3:266-272, Madden等人(1996) “Applications of network BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul 等人(1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 和Zhang等人(1997) “PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation” Genome Res. 7:649-656。
在寡核苷酸背景下的“修饰的核苷酸”是指其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸替换为给寡核苷酸提供所需性质的不同核苷酸的改变。可以在本文描述的寡核苷酸中取代的示例性修饰的核苷酸包括例如C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮杂-2-脱氧黄苷、吡唑嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基 Ribo-U、2'-0-甲基 Ribo-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可以在本发明的寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或是本领域另外已知的。在某些实施方案中，相对于相应未修饰的寡核苷酸的解链温度，修饰的核苷酸取代修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步举例说明，在本发明的一些实施方案中，某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如最小化引物二聚体形成等)，增加预期目标扩增子的得率，等等。这些类型的核酸修饰的实例在例如美国专利号6,001,611中描述。
HSV-1和HSV-2 核酸和寡核苷酸
本发明提供了通过扩增，例如，HSV-1 Pol和HSV-1 TK核酸序列，以及HSV-2 TK和HSV-2 gB核酸序列中的一个或多个的部分来检测HSV-1和/或HSV-2的方法。来自HSV-1和/或HSV-2的核酸序列是可获得的(参见，例如，GenBank登录号：HSV-1 Pol的M10792；HSV-1 TK的J02224；HSV-2 TK的HQ123137；和HSV-2 gB的HM011358)。具体地，扩增和检测HSV-1 Pol和HSV-1 TK核酸分子目标和HSV-2 TK和HSV-2 gB核酸分子目标的引物和探针由本发明的实施方案提供。
对于HSV-1和/或HSV-2的检测，提供了扩增HSV-1聚合酶和HSV-1 TK核酸序列和HSV-2 TK和HSV-2 gB核酸分子的引物和探针。除了本文例举那些之外的HSV-1/2核酸也可以用于检测样品中的HSV-1/2。例如，功能变体可以通过本领域技术人员使用常规方法针对特异性和/或灵敏度进行评估。代表性功能变体可以包括例如本文公开的HSV-1/2核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。
更具体而言，本发明的寡核苷酸的实施方案各自包括具有选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12的序列的核酸，其基本上相同的变体，其中该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12之一，或SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12的互补序列和变体具有至少例如80%、90%或95%的序列同一性。
表I: HSV-1 DNA聚合酶引物和探针
表II: HSV-1 HSV-1胸苷激酶引物和探针
表III: HSV-2 HSV-1胸苷激酶引物和探针
表IV: HSV-2糖蛋白B引物和探针
在本发明的一个实施方案中，使用上述四组HSV-1和/或HSV-2引物和探针，以便提供在怀疑含有HSV-1/2的生物样品中HSV-1和/或HSV-2的检测。所述引物和探针组可包含对于HSV-1 Pol和HSV-1 TK核酸序列和还有HSV-2 TK和HSV-2 gB核酸序列特异性的引物和探针或由其组成，所述引物和探针包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的核酸序列或由其组成。在本发明的另一个实施方案中，用于HSV-1和HSV-1目标的引物和探针包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的任一引物的功能活性变体或由其组成。
SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的引物和/或探针中的任何的功能活性变体可以通过在本发明的方法中使用引物和/或探针进行鉴定。SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12的任何的引物和/或探针的功能活性变体与这样的引物有关，与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12的各自序列相比较，所述引物在本发明的方法或试剂盒中提供相似或更高的特异性和灵敏度。
通过一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，诸如在SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12的各自序列的5'末端和/或3'末端处的一个或多个核苷酸添加、缺失或取代，变体可以例如与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12的序列不同。如上所详述，引物(和/或探针)可以是化学修饰的，即引物和/或探针可以包含修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)随后是修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)通过一些修饰而不同于天然“核苷酸”，但仍由碱基或碱基样化合物、呋喃戊糖或呋喃戊糖样化合物、磷酸酯部分或磷酸酯样部分、或其组合组成。例如，“标记”可结合至“核苷酸”的碱基部分，由此获得“修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可替换为例如7-脱氮杂嘌呤，由此同样获得“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。以如上文对于“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式，“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)通过一些修饰不同于天然核苷。
扩增编码HSV-1 Pol和HSV-1 TK核酸序列和HSV-2 TK和HSV-2 gB核酸序列的核酸分子，例如编码HSV-1 Pol和HSV-1 TK、HSV-2 TK和HSV-2 gB的可替代部分的核酸的寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物，可以使用例如计算机程序诸如OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.)进行设计。当设计待用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于合适大小的扩增产物以利于检测(例如通过电泳)，关于一对引物成员相似的解链温度，和每个引物的长度(即，引物需要足够长来以序列特异性退火且起始合成，但不是如此长，使得保真度在寡核苷酸合成期间减少)。通常，寡核苷酸引物是长度8 – 50个核苷酸(例如，长度8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸)。
除了一组引物以外，本发明的方法还可以使用一种或多种探针，以便检测HSV-1和/或HSV-2的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其通过设计或选择而含有特定核苷酸序列，这允许其在限定的预定严格性下与“目标核酸”，在本文情况下，与HSV-1和/或HSV-2(目标)核酸特异性(即优先)杂交。“探针”可以被称为“检测探针”，意指它检测目标核酸。
本发明的一些实施方案中，所述HSV-1和/或HSV-2探针可以用至少一种荧光标记进行标记。在一个实施方案中，HSV-1和/或HSV-2探针可以用供体荧光部分例如荧光染料和相应的受体荧光部分例如猝灭剂进行标记。
在一个实施方案中，所述探针包含荧光部分或由其组成，且所述核酸序列包含SEQ ID NO:3、6、9和12或由其组成(无标记显示)。
设计待用作杂交探针的寡核苷酸可以类似于引物设计的方式进行。本发明的实施方案可以使用单个探针或一对探针用于检测扩增产物。取决于实施方案，使用的探针可以包含至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。与引物一样，探针通常具有相似的解链温度，并且每个探针的长度必须足以使序列特异性杂交发生，但不如此长，使得保真度在合成期间减少。寡核苷酸探针通常是长度15 - 30(例如16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
本发明的构建体可以包括各自含有HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK和HSV-2 gB核酸分子(例如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12)中的一种的载体。本发明的构建体可以用作例如对照模板核酸分子。适合于在本发明中使用的载体是商购可得的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法产生。HSV-1和/或HSV-2核酸分子可以例如通过化学合成、由HSV-1和HSV-2直接克隆、或通过PCR扩增而获得。
除了HSV-1和/或HSV-2核酸分子(例如含有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、和12中的一个或多个序列的核酸分子)以外，适合于在本发明的方法中使用的构建体通常还包括用于选择所需构建体和/或转化体的可选标记(例如抗生素抗性基因)的编码序列、和复制起点。载体系统的选择通常取决于几个因素，包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、可选择性、可诱导性和易于回收。
本发明含有HSV-1和/或HSV-2核酸分子的构建体可以在宿主细胞中繁殖。如本文使用的术语宿主细胞意欲包括原核生物和真核生物，例如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可以包括大肠杆菌(E. coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母诸如酿酒酵母(S. cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S. pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，哺乳动物细胞诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，昆虫细胞和植物细胞诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)。本发明的构建体可以使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术引入宿主细胞内。例如，磷酸钙沉淀、电穿孔、热休克、脂转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是用于将核酸引入宿主细胞内的常见方法。此外，裸露DNA可以直接递送给细胞(参见例如，美国专利号5,580,859和5,589,466)。
聚合酶链式反应(PCR)
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规PCR技术。PCR通常采用两个寡核苷酸引物，其与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合。在本发明的实施方案中有用的引物包括能够充当在所述HSV-1/2核酸序列(例如SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、和11)内的核酸合成起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化，或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率，引物优选是单链的，但引物可以是双链的。首先将双链引物变性，即处理以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的，则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成，包括物理、化学或酶促方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至它占优势地变性(例如大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性)。用于使模板核酸变性必需的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度和变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常范围为约90℃ - 约105℃一段时间，所述时间取决于反应特征例如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒 - 4分钟(例如1分钟 - 2分钟30秒，或1.5分钟)。
如果双链模板核酸通过加热变性，则允许反应混合物冷却至促进每个引物对其在所述HSV-1/2核酸分子上的目标序列退火的温度。用于退火的温度通常是约35℃ - 约65℃(例如约40℃ - 约60℃；约45℃ - 约50℃)。退火时间可以是约10秒 – 约1分钟(例如约20秒 – 约50秒；约30秒 – 约40秒)。随后将反应混合物调整至在其下聚合酶的活性得到促进或最佳化的温度，即足以使延伸从退火引物发生，以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以由对核酸模板退火的每个引物合成延伸产物，但不应如此高，以便使来自其互补模板的延伸产物变性(例如用于延伸的温度通常范围为约40℃ - 约80℃(例如约50℃ - 约70℃；约60℃)。延伸时间可以是约10秒 – 约5分钟(例如约30秒 – 约4分钟；约1分钟 – 约3分钟；约1分钟30秒 – 约2分钟)。
PCR测定可以采用HSV-1/2核酸诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸无需纯化；它可以是复杂混合物的较小部分，诸如人细胞中含有的HSV-1/2核酸。HSV-1/2核酸分子可以通过常规技术从生物样品中提取，所述常规技术诸如Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Persing等人(编), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.)中所述的那些。核酸可以得自许多(any number of)来源诸如质粒，或天然来源包括细菌、酵母、病毒、细胞器，或高等生物诸如植物或动物。
寡核苷酸引物(例如SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8、10、和11)与PCR试剂在诱导引物延伸的反应条件下组合。例如，链延伸反应通常包括50 mM KCl、10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、15 mM MgCl2、0.001%(w/v)明胶、0.5-1.0 µg变性模板DNA、50 pmol每个寡核苷酸引物、2.5 U Taq聚合酶和10％DMSO)。反应通常含有150 - 320 µM的每种dATP、dCTP、dTTP、dGTP，或其一种或多种类似物。
新近合成的链形成可以在反应的以后步骤中使用的双链分子。链分离、退火和延长步骤可以根据需要重复多次，以产生所需数量的对应于目标HSV-1/2核酸分子的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。循环步骤(即变性、退火和延伸)优选重复至少一次。对于在检测中的使用，循环步骤数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的目标序列。通常，循环步骤重复至少约20次，但可以重复多达40、60或甚至100次。
荧光共振能量转移 (FRET)
FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于下述概念：当供体荧光部分和相应的受体荧光部分置于彼此一定距离内时，能量转移在两个荧光部分之间发生，其可以显现或另外检测和/或定量。当供体通过光辐射用合适波长激发时，供体通常将能量转移给受体。受体通常用不同波长再发射以光辐射形式的转移能量。
在一个实例中，寡核苷酸探针可以含有供体荧光部分和相应的猝灭剂，其消散以除光以外形式的转移能量。当探针完整时，能量转移通常在两个荧光部分之间发生，使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间，与扩增产物结合的探针通过例如Taq聚合酶的5’ 至 3’外切核酸酶活性切割，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于这个目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂包括BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、Iowa Black™, (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa)、BlackBerry™猝灭剂650 (BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)。
在另一个实例中，各自含有荧光部分的两个寡核苷酸探针可以在特定位置处与扩增产物杂交，所述特定位置通过寡核苷酸探针与HSV-1/2目标核酸序列的互补性决定。在寡核苷酸探针在合适位置处与扩增产物核酸杂交后，生成FRET信号。杂交温度可以范围为约35℃到约65℃，约10秒到约1分钟。
荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(含有合适的二色镜和滤器用于监控在特定范围上的荧光发射)、光子计数光电倍增系统或荧光计进行。起始能量转移的激发可以用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光导纤维光源或对于所需范围中的激发适当过滤的其他高强度光源进行。
如本文就供体和相应的受体荧光部分使用的，“相应的”是指具有重叠供体荧光部分的激发光谱的发射光谱的受体荧光部分。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长大至少100 nm。相应地，有效的非辐射性能量转移可以在两者之间产生。
荧光供体和相应的受体部分通常就下述进行选择：(a)高效率福斯特能量转移；(b)大的最终斯托克斯位移(>100 nm)；(c)发射尽可能远地进入可见光谱的红色部分内的位移(>600 nm)；和(d)发射向高于通过在供体激发波长处的激发产生的拉曼水荧光发射波长的位移。例如，可以选择供体荧光部分，其具有接近激光线的最大激发(例如氦-镉442 nm或氩488 nm)、高消光系数、高量子产率、及其荧光发射与相应受体荧光部分的激发光谱的良好重叠。可以选择相应的受体荧光部分，其具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠、和在可见光谱的红色部分中的发射(>600 nm)。
可以在FRET技术中与多个受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、萤光黄VS、4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸芪-2,2’-二磺酸衍生物。取决于使用的供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二乙撑三胺五乙酸酯、或镧系元素离子(例如铕或铽)的其他螯合物。供体和受体荧光部分可以例如得自Molecular Probes(Junction City, Oreg.)或Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.)。
供体和受体荧光部分可以经由接头臂结合至合适的探针寡核苷酸。每个接头臂的长度是重要的，因为接头臂将影响供体和受体荧光部分之间的距离。用于本发明目的的接头臂长度是从核苷酸碱基到荧光部分以埃(Å)表示的距离。通常而言，接头臂是约10 Å – 约25 Å。接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂结合至特定核苷酸碱基，以及用于将荧光部分结合至接头臂的方法。
受体荧光部分诸如LC Red 640-NHS-酯可以与C6-亚磷酰胺(可得自ABI (Foster City, Calif.)或Glen Research (Sterling, Va.))组合，以产生例如LC Red 640-亚磷酰胺。频繁使用的将供体荧光部分例如荧光素偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的，例如来自Glen Research或ChemGene (Ashland, Mass.)的荧光素-CPG's)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，诸如来自BioGenex (San Ramon, Calif.)的荧光素-CPG)、或在寡核苷酸合成后需要荧光素-NHS-酯偶联的3’-氨基-CPGs。
单纯疱疹病毒1和/或2的检测
本发明提供了用于检测生物或非生物样品中HSV-1和/或HSV-2的存在或不存在的方法。由本发明提供的方法避免样品污染、假阴性和假阳性的问题。该方法包括进行至少一个循环步骤和FRET检测步骤，所述循环步骤包括使用多对HSV-1 Pol、HSV-1 TK、HSV-2 TK和HSV-2 gB引物从样品中扩增HSV-1和/或HSV-2目标核酸分子的部分。进行多个循环步骤，优选在热循环仪中。本发明的方法可以使用HSV-1和HSV-2引物和探针进行，以检测HSV-1和/或HSV-2的存在，并且HSV-1和/或HSV-2的检测指示样品中HSV-1和/或HSV-2的存在。
如本文描述的，扩增产物可以使用利用FRET技术的标记的杂交探针进行检测。一个FRET形式利用TaqMan®技术，以检测扩增产物的存在或不存在，并且因此检测HSV-1和/或HSV-2的存在或不存在。TaqMan®技术利用由两个荧光部分标记的一个单链杂交探针。当第一荧光部分用合适波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针与目标DNA(即扩增产物)结合，并且在后续延长期过程中通过Taq聚合酶的5’至 3’外切核酸酶活性降解。因此，激发的荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间分离。因此，在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后，可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。例如，ABI PRISM® 7700序列检测系统(Applied Biosystems)使用TaqMan®技术，并且适合于进行本文描述的方法用于检测样品中HSV-1和/或HSV-2的存在或不存在。
与FRET结合的分子信标也可以用于使用本发明的实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用由第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂，并且荧光标记通常位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。由于在探针内的二级结构形成，当探针在溶液中时，两个荧光部分处于空间接近。在与目标核酸(即扩增产物)杂交后，探针的二级结构被破坏，并且荧光部分变得彼此分离，使得在用合适波长的光激发后，可以检测到第一荧光部分的发射。
另一个常见形式的FRET技术利用两个杂交探针。每个探针可以由不同荧光部分标记，并且通常设计为在目标DNA分子(例如扩增产物)中彼此紧密接近杂交。供体荧光部分例如荧光素在470 nm处通过LightCycler®仪器的光源激发。在FRET期间，荧光素将其能量转移给受体荧光部分诸如LightCycler®-Red 640 (LC Red 640)或LightCycler®-Red 705 (LC Red 705)。受体荧光部分随后发出更长波长的光，其通过LightCycler®仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分处于直接局部接近时，并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，有效的FRET才可发生。发出信号的强度可以与原始目标DNA分子数目(例如HSV1/2基因组数目)关联。如果发生HSV-1/2目标核酸的扩增，并且产生扩增产物，则杂交步骤导致基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。
通常，FRET的存在指示样品中HSV-1和/或HSV-2的存在，并且FRET的不存在指示样品中HSV-1和/或HSV-2的不存在。然而，不足够的样本收集、运送延迟、不合适的运送条件或特定收集拭子的使用(海藻酸钙或铝轴(aluminum shaft))都是可以影响测试结果的成功和/或准确度的条件。使用本文公开的方法，在例如45个循环步骤内的FRET检测指示HSV-1和/或HSV-2感染。
可以在实践本发明的方法中使用的代表性生物样品包括但不限于皮肤拭子、鼻拭子、伤口拭子、血培养、皮肤和软组织感染。生物样品的收集和贮存方法是本领域技术人员已知的。生物样品可以进行处理(例如通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)，以释放HSV-1/2核酸，或在一些情况下，生物样品可以直接与PCR反应组分和合适的寡核苷酸接触。
解链曲线分析是可以包括在循环概况中的另外步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实，所述解链温度定义为在其下一半DNA双链体已分离成单链的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子具有比具有丰富A和T核苷酸的那些更高的Tm。通过检测在其下丧失信号的温度，可以测定探针的解链温度。类似地，通过检测在其下生成信号的温度，可以测定探针的退火温度。来自HSV-1和/或HSV-2扩增产物的HSV-1和HSV-2探针的解链温度可以证实样品中HSV-1和/或HSV-2的存在或不存在。
在每个热循环运行内，同样使对照样品循环。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针来扩增HSV-1/2核酸对照模板(除所述目标基因的扩增产物以外)。阳性对照样品还可扩增例如含有HSV-1/2核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可以在内部(例如在样品内)或在分开的样品运行中与患者样品并行扩增。每个热循环仪运行也可包括阴性对照，其例如缺乏HSV-1/2模板DNA。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指示剂。因此，对照反应可以容易地测定例如引物以序列特异性退火且起始延长的能力，以及探针以序列特异性杂交和FRET发生的能力。
在一个实施方案中，本发明的方法包括避免污染的步骤。例如，利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法在美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述，以减少或消除一个热循环仪运行和下一个之间的污染。
与FRET技术结合的常规PCR方法可以用于实践本发明的方法。在一个实施方案中，使用LightCycler®仪器。下述专利申请描述如在LightCycler®技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。
LightCycler®可以使用PC工作站进行操作，并且可以利用Windows NT操作系统。当机器将毛细管顺次置于光学单位上时，可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时展示荧光信号。荧光采集时间是10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤后，可以对于所有样品不断更新荧光相对于循环数目的定量显示。生成的数据可以保存用于进一步分析。
作为FRET的替代，扩增产物可以使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如SYBR® Green或SYBR® Gold (Molecular Probes))进行检测。在与双链核酸相互作用后，此类荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发出荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料诸如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。
应当理解本发明的实施方案并不受一种或多种商购可得仪器的配置限制。
制品/试剂盒
本发明的实施方案还提供了检测HSV-1和/或HSV-2的制品或试剂盒。制品可以包括用于检测HSV-1和/或HSV-2的引物和探针，连同合适的包装材料。用于检测HSV-1和/或HSV-2的代表性引物和探针能够与HSV-1和/或HSV-2目标核酸分子杂交。此外，该试剂盒还可包括合适包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料，例如固体支持物、缓冲液、酶和DNA标准品。设计引物和探针的方法在本文中公开，并且提供了扩增HSV-1和/或HSV-2目标核酸分子和与HSV-1和/或HSV-2目标核酸分子杂交的引物和探针的代表性实例。
本发明的制品还可包括一种或多种荧光部分用于标记探针，或可替代地，可以标记由试剂盒供应的探针。例如，制品可以分别包括供体和/或受体荧光部分用于标记HSV-1和/或HSV-2探针。合适的FRET供体荧光部分和相应的受体荧光部分的实例在上文提供。
制品还可含有包装说明书或包装标签，在其上具有关于使用HSV-1和/或HSV-2引物和探针检测样品中的HSV-1和/或HSV-2的指导。制品可以另外包括用于进行本文公开的方法的试剂(例如缓冲液、聚合酶、辅因子、或预防污染的试剂)。此类试剂可以对于本文描述的商购可得的仪器之一是特异性的。
本发明的实施方案还将在下述实施例中描述，所述实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
实施例
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，其真正范围在随附权利要求中记载。
实施例 I
HSV PCR 目标区域的确定和 HSV 引物和探针的设计
HSV-1在1988年完全测序(McGeoch,等人, J. Gen. Virol. 1988 Jul;69 ( Pt 7):1531-74)，且HSV-2在1998年测序 (Dolan, 等人, J. Virol. 1998 Mar;72(3):2010-21)。两种最接近的疱疹病毒共有相同的基因组结构和基因数目。HSV-1具有68.3% G+C含量，而HSV-2具有稍高的70.4% G+C含量。然而，它们的非编码区(RL和RS; ~72-80%)具有比编码区(UL和US; ~64-69%)高得多的G+C含量百分比。两种病毒类型之间的同源序列在区域间变化。例如，RL和RS区域具有更多样的序列，而UL和US区域共有高同源序列(83％)。
存在许多标准用于选择PCR目标区域。首先，理想的是，在目标区域中具有平衡的G+C含量(〜50％)，使得它们易于结合PCR引物，以及扩增，特别是当PCR热循环条件被固定在相对低的温度下时。其次，优选具有比较大数目的公共域中可得的公开目标序列，以达到最大测定包容性。第三，根据测定要求，当需要测定覆盖不同的基因型或株系时，应当选择高同源区，同时当需要测定区分不同的基因型或株系时，应当使用低同源区。
新的HSV PCR测定需要扩增HSV-1和HSV-2类型两者，且在单一PCR反应中区分它们。因此，PCR靶向基因或区域应当具有G+C含量的低百分比，由于HSV-1/2基因组中G+C含量的高百分比，这是不容易找到的。此外，目标基因或区域中病毒类型之间的序列同源性应当低，它允许设计类型特异性引物和探针而无交叉反应性。不幸的是，尽管HSV基因组中的一些基因或区域具有G+C%含量的低百分比，但它们在两种病毒类型之间总是共有高同源性序列。因此，当选择HSV PCR目标时，应当考虑两个要求之间的小心平衡。基于那些考虑，选择三种HSV基因作为PCR目标基因，糖蛋白B (gB, UL27)、DNA聚合酶(Pol, UL30)和胸苷激酶(TK, UL23)。那些基因位于UL区域。
虽然三种目标基因具有G+C含量的相对低百分比，但所述G+C含量没有均匀地分布在它们的序列中。因此，由于两种病毒类型之间的高序列同源性，仔细检查两种HSV病毒类型的整个基因序列的潜在PCR目标区域。此外，避免具有G或C段的区域，因为存在潜在的引物交叉反应性和寡核苷酸合成的技术难度。
二级结构可以影响扩增效率。因此，在建议PCR条件下使用PCR建模程序(Visual OMPTM, DNA Software, Inc., 334 East Washington Street, Ann Arbor, Michigan 48104)模拟所有选择区域的潜在二级结构形成。一些区域，诸如gB5、Pol-C、TK-A和TK-B，具有广泛的发夹结构，这可能对扩增造成潜在的困难。
选择三种HSV基因中的潜在PCR目标区域后，小心设计PCR引物和探针。存在两种不同的方法来设计引物和探针来在单一PCR反应中扩增两种HSV类型和区分它们。一种是对于每种HSV病毒类型设计完全独立和特异性的PCR引物和探针。这种方法的优点在于，PCR扩增和检测对于每种类型是非常特异的。但是，它需要PCR反应中多得多的引物，这对于双重目标PCR测定尤其如此。另一种方法是设计通用引物以扩增两种病毒类型，但具有病毒类型特异性探针来检测和区分两种病毒类型。这种方法需要较少的PCR引物，但可引起目标竞争问题。当设计HSV引物和探针时，使用两种方法。
设计和评估总共超过160个引物和探针。对于病毒类型特异性方法，只要可能，在存在病毒类型之间的最多错配的位置设计引物和探针，同时对于通用引物方法，引物位于两种病毒类型之间的同源序列下，且探针位于异源序列下。为了尽可能提高区分HSV-1和HSV-2的能力，引物的错配位于3'末端附近，而探针中的错配位于报道分子和猝灭剂染料之间。设计新的引物和探针通过手动过程进行，以便尽可能提高病毒类型之间引物和探针下错配的数目。为了提高扩增特异性，将烷基诸如叔丁基-苄基部分添加至一个或多个核苷酸(通常为引物的3'末端处或附近的A或C核苷酸)。为了便于鉴定HSV-1和HSV-2，用不同的荧光报道染料(对于HSV-1为FAM，且对于HSV-2为HEX)以及非荧光猝灭剂染料BHQ-2或RDQ-2标记病毒特异性探针。
实施例 II
HSV 引物和探针的筛选
在每个区域中设计多个引物和探针，并且使用从培养和热灭活的HSV病毒提取的全长基因组DNA在干净系统中筛选和评估它们中的所有。此外，先前的HSV测定用作对照。用于选择引物和探针的标准包括早期Ct值、高荧光增加和没有非特异性扩增的特异性PCR扩增产物。图1A和1B呈现选择在HSV TK-C区域中运作良好的引物的实例，而图3A和3B呈现选择没有在非成功的HSV TK-B区域中运作良好的引物的实例。
如图1A中显示，对于HSV-1 TK-C区域，F6-R5引物组合(F6:SEQ ID NO:4；R5:SEQ ID NO:5)比F6-R6引物组合(F6:SEQ ID NO:4; R6:SEQ ID NO:13)和对照运作更好。如图1B中显示，对于HSV-2，F5-R6组合(F5:SEQ ID NO:7；R6:SEQ ID NO:8)比F6-R6组合(F6:SEQ ID NO:14；R6:SEQ ID NO:8)运作更好。图2显示针对HSV TK-C区域的PCR产物的凝胶电泳。箭头表明具有正确大小的扩增产物。针对HSV-1的F6-R5 (F6:SEQ ID NO:4；R5:SEQ ID NO:5)和针对HSV-2的F5-R6 (F5:SEQ ID NO:7；R6:SEQ ID NO:8)引物组合产生清晰且正确大小产物，而其他引物组合显示多种非特异性产物。
使用图3A中显示的针对HSV-1 TK-B区域的引物进行进一步实验。图3B显示使用针对HSV-2 TK-B的引物的PCR生长曲线实验。对于HSV-1 TK-B区域(图3A)和HSV-2(图3B)，无一引物组合运作比对照更好(对于HSV-1，F7:SEQ ID NO:15；R3:SEQ ID NO:16；R4:SEQ ID NO:17。对于HSV-2，F4:SEQ ID NO:18；R3:SEQ ID NO:19；R4:SEQ ID NO:20)。图4显示针对HSV TK-B区域的PCR产物的凝胶电泳。箭头表明具有正确大小的扩增产物。对于HSV-1，尽管一些引物组合(F7-R3 (F7:SEQ ID NO:15；R3:SEQ ID NO:16)和F7-R4 (F7:SEQ ID NO:15；R4:SEQ ID NO:17))给出了清楚的单一扩增产物，但它们的生长曲线并不令人满意。对于HSV-2，除了正确大小产物外，存在多种非特异性产物。
在8个区域中的所有引物和探针组合如上所示进行全面评估。选择针对每种HSV-1和HSV-2病毒类型的三个区域中的一种引物和探针组合用于进一步评估测定性能和比较，诸如测定分析灵敏度。然后，最终选择对于每种病毒类型最好的两种组合(对于HSV-1的Pol-B和TK-C；对于HSV-2的gB3和TK-C)用于双重目标HSV测定。图5显示对于HSV-1 Pol-B，F11:SEQ ID NO:1；R8:SEQ ID NO:2；对于HSV-1 TK-A，F2:SEQ ID NO:21；R1:SEQ ID NO:22；和对于HSV-1 TK-C，F6:SEQ ID NO:4；R5:SEQ ID NO:5)的生长曲线。图6显示对于HSV-2 TK-C，F5:SEQ ID NO:7；R6:SEQ ID NO:8；对于HSV-2 Pol-B，F9:SEQ ID NO:23；R6:SEQ ID NO:24；和对于HSV-2 gB3，F7:SEQ ID NO:10；R7:SEQ ID NO:11的生长曲线。
进行独立实验用于分析灵敏度分析。图7显示三次独立HSV-1测定(Pol-B、TK-A和TK-C)的结果。Prob表明概率且vp/PCR表明每次PCR的检测限值，而l95_conc和u95_conc分别是指95％置信下限和95％置信上限。图8显示三次独立HSV-2测定(gB3、Pol-B和TK-C)的结果。Prob表明概率且vp/PCR表明每次PCR的检测限值，而l95_conc和u95_conc分别是指95％置信下限和95％置信上限。
针对HSV-1和HSV-2的4个区域的最终选择与那些区域在计算机芯片上的分析非常一致。例如，在所有8个区域中，最终选择的4个区域具有最低的G+C含量百分比，且比其他区域更少的长发夹二级结构，这使得它们在固定的PCR温度曲线(thermal profile)下非常易进行。
实施例 III
目标竞争
如前面提到，两种不同的方法可以用于设计HSV引物和探针来检测和区分HSV-1和HSV-2病毒。扩增两种病毒目标的通用PCR引物首先在HSV Pol-B区域中设计。病毒类型的区分通过病毒类型特异性探针来实现。然而，在引物评估过程中，发现，当两种病毒目标都存在于单一PCR反应中时，具有较低拷贝数的目标可以被具有较高拷贝数的目标竞争出去。尽管这种现象的原因不清楚，但据推测，通用PCR引物可引起这种不平衡的目标扩增。图9A和9B显示该现象(对于HSV-1和HSV-2 Pol-B，F4:SEQ ID NO:25；R5:SEQ ID NO:26)。当使用通用引物且两种HSV病毒类型都存在于PCR反应中时，具有较低拷贝数(10个病毒颗粒/PCR)的目标被具有较高拷贝数(1000个病毒颗粒/PCR)的另一目标竞争出去。当两个通用引物之一(在这种情况下是反向引物)被病毒类型特异性引物取代时，目标竞争仍然存在，但严重性较低(图10A和10B)(对于HSV-1 Pol-B，F4:SEQ ID NO:27；R8:SEQ ID NO:2。对于HSV-2 Pol-B，F4:SEQ ID NO:27；R6:SEQ ID NO:28)。当两个通用引物被相同区域中的病毒类型特异性引物完全取代时，在那些反应中在最高达10,000倍目标浓度差异没有观察到目标竞争(图11A和11B)(对于HSV-1 Pol-B，F12:SEQ ID NO:29；R8:SEQ ID NO:2。对于HSV-2 Pol-B，F9:SEQ ID NO:23；R6:SEQ ID NO:24)。
在单一PCR反应中检测和区分HSV-1和HSV-2两者而无目标竞争提供了相比于迄今报道的或市场上的其他HSV PCR测定法的优越测定性能。它不仅使用一个反应管和单一样品，而且是灵敏且病毒类型特异性的。作为结果，所有HSV目标扩增引物和检测探针都被设计和选择为病毒类型特异性的。
实施例 IV
交叉反应性
设计病毒类型特异性引物和探针以尽可能提高它们的特异性提出了挑战，这是由于HSV-1和HSV-2之间存在高度序列同源性。已经实施实验以检查引物和探针的潜在交叉反应性。在那些实验中，高浓度的含有相反病毒类型的目标区域的质粒为引物和探针带来了挑战。如图12A和12B中所示，分别含有HSV-1 Pol-B和HSV-1 TK-C区域的两种质粒(经Hind III切割) (pHSV-1 Pol-B-2和pHSV-1 TK-C)由新设计的HSV双重目标测定扩增。如预期，阳性信号只有在FAM通道中观察到(图12A)，而没有在HEX通道中观察到(图12B)。类似地，分别含有HSV-2 gB3和HSV-2 TK-C区域的两种HSV-2质粒(经Hind III切割) (pHSV-2 gB3和pHSV-2 TK-C)由新设计的HSV双重目标测定扩增。如预期，阳性信号只有在HEX(图13B)通道中观察到，而没有在FAM通道中观察到(图13A)。
除HSV-1和HSV-2病毒类型之间的潜在交叉反应性，新设计的双重目标HSV-1/2测定受到高浓度的来自相同家族的其它密切相关的疱疹病毒的挑战。如图14中所示，新的HSV-1/2测定法不具有与其他密切相关的疱疹病毒的交叉反应性。
尽管前述发明已经出于清楚和理解的目的进行相当详细地描述，但本领域技术人员从阅读本公开将清楚的是，可以进行形式和细节的各种改变，而不脱离本发明的真正范围。例如，上述所有技术和设备可以各种组合使用。

Claims (18)

1.检测样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的存在或不存在的方法，所述方法包括：
- 进行扩增步骤，所述扩增步骤包括将样品与多组的HSV-1和HSV-2寡核苷酸引物接触，如果样品中存在任何HSV-1和/或HSV-2核酸，则产生一种或多种扩增产物；
- 进行杂交步骤，所述杂交步骤包括将所述一种或多种扩增产物与多种可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针接触；和
- 检测所述一种或多种扩增产物的存在或不存在，其中所述一种或多种扩增产物的存在表明所述样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的存在，并且其中所述一种或多种扩增产物的不存在表明所述样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的不存在；
其中所述多组HSV-1和HSV-2寡核苷酸引物包含：
- 扩增HSV-1 DNA聚合酶B (HSV-1 Pol)和HSV-1胸苷激酶C (HSV-1 TK)基因目标的至少两个HSV-1寡核苷酸引物组；和
- 扩增HSV-2胸苷激酶C (HSV-2 TK)和HSV-2糖蛋白B (HSV-2 gB)基因目标的至少两个HSV-2寡核苷酸引物组；和
其中所述多个可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针包含：
- 对于HSV-1 Pol和HSV-1 TK扩增产物特异性的至少两个HSV-1寡核苷酸探针；和
- 对于HSV-2 TK和HSV-2 gB扩增产物特异性的至少两个HSV-2寡核苷酸探针。
2.权利要求1的方法，其中：
- 用于扩增HSV-1 Pol基因目标的引物组包含具有包含SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；
- 用于扩增HSV-1 TK基因目标的引物组包含具有包含SEQ ID NO:4和5的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；
- 用于扩增HSV-2 TK基因目标的引物组包含具有包含SEQ ID NO:7和8的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；
- 用于扩增HSV-2 gB基因目标的引物组包含具有包含SEQ ID NO:10和11的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；
- 用于检测HSV-1 Pol扩增产物的可检测的HSV-1寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；
- 用于检测HSV-1 TK扩增产物的可检测的HSV-1寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列；
- 用于检测HSV-2 TK扩增产物的可检测的HSV-2寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:9的核酸序列或其互补序列；且
- 用于检测HSV-2 gB扩增产物的可检测的HSV-2寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:12的核酸序列或其互补序列。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中多个可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针各自用供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记；且其中所述检测步骤包括检测HSV-1和/或HSV-2寡核苷酸探针中的一个或多个的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在，其中荧光的存在或不存在表明样品中HSV-1和/或HSV-2核酸的存在或不存在。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述扩增步骤采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。
5.权利要求3或4中任一项的方法，其中所述供体和受体荧光部分在所述寡核苷酸探针上彼此的不超过5个核苷酸之内。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述HSV-1和/或HSV-2寡核苷酸探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致所述供体和受体荧光部分之间的空间接近。
7.权利要求3-6中任一项的方法，其中所述受体荧光部分是猝灭剂。
8.试剂盒，其用于检测HSV-1和/或HSV-2核酸的存在或不存在，所述试剂盒包含：
- 对于扩增HSV-1 Pol和HSV-1 TK基因目标以及HSV-2 TK和HSV-2 gB基因目标特异性的多组HSV-1和HSV-2寡核苷酸引物；和
- 对于检测HSV-1 Pol和HSV-1 TK扩增产物以及HSV-2 TK和HSV-2 gB扩增产物特异性的多个可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针。
9.权利要求8的试剂盒，其中用于扩增HSV-1 Pol基因目标的引物组包含具有包含SEQ ID NO:1和2的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；用于扩增HSV-1 TK基因目标的引物组包含具有包含SEQ ID NO:4和5的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；用于扩增HSV-2 TK基因目标的引物组包含具有包含SEQ ID NO:7和8的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸；用于扩增HSV-2 gB基因目标的引物组包含具有包含SEQ ID NO:10和11的核酸序列或其互补序列的至少两个寡核苷酸，且
其中用于检测HSV-1 Pol扩增产物的可检测的HSV-1寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:3的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-1 TK扩增产物的可检测的HSV-1寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:6的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-2 TK扩增产物的可检测的HSV-2寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:9的核酸序列或其互补序列；用于检测HSV-2 gB扩增产物的可检测的HSV-2寡核苷酸探针具有包含SEQ ID NO:12的核酸序列或其互补序列。
10.权利要求9的试剂盒，其中所述多个可检测的HSV-1和HSV-2寡核苷酸探针中的每个寡核苷酸探针包含供体荧光部分和相应的受体荧光部分。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述受体荧光部分是猝灭剂。
12.权利要求9-11中任一项的试剂盒，其进一步包含核苷三磷酸、核酸聚合酶和对于所述核酸聚合酶的功能必需的缓冲液。
13.寡核苷酸，其包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的核酸序列或其互补序列。
14.权利要求13的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。
15.权利要求13或14中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个保守修饰的变化。
16.权利要求13-15中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸。
17.权利要求13-16中任一项的寡核苷酸，其进一步包含一个或多个可检测的标记。
18.权利要求13-17中任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个标记部分和/或至少一个猝灭剂部分。
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