CN112063749A - 用于鉴定单纯疱疹病毒的引物探针组合以及荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定单纯疱疹病毒引物探针组合以及荧光定量PCR试剂盒。本发明提供的引物探针组合包括引物探针组甲和引物探针组乙；引物探针组甲由引物对甲和探针甲组成；引物对甲由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示单链DNA分子组成；探针甲如SEQ ID NO：3所示；引物探针组乙由引物对乙和探针乙组成；引物对乙由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示单链DNA分子组成；探针乙如SEQ ID NO：6所示；探针甲中的荧光基团和探针乙中的荧光基团不相同。本发明对于单纯疱疹病毒检测领域具有重大的应用推广价值，对于单纯疱疹病毒引起的疾病的防控，具有重大意义。

Description

用于鉴定单纯疱疹病毒的引物探针组合以及荧光定量PCR试 剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴定单纯疱疹病毒的引物探针组合以及荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Viruses，HSV)属疱疹病毒科，病毒颗粒直径约180nm，人类是单纯疱疹病毒唯一的自然宿主。单纯疱疹病毒为DNA病毒。

根据生物化学、生物学、流行病学等差别，目前，单纯疱疹病毒被分为两个血清型，即单纯疱疹病毒I型(HSV-1)和单纯疱疹病毒II型(HSV-2)。HSV的基因组DNA约152kb，包括34个基因，编码100多个多肽。其中具有11种包膜糖蛋白，gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM。

HSV-1主要引起生殖器以外(也有例外)的皮肤、黏膜和器官感染，感染后在三叉神经节的感觉神经细胞中潜伏。HSV-1感染的临床表现为牙龈和咽颊部成群疱疹，发热、咽喉痛，破溃后形成溃疡，此外还可引起脑炎、皮肤疱疹性湿疹。HSV-2主要引起生殖器及腰以下的皮肤疱疹，感染后多潜伏在腰骶背根神经节的感觉神经细胞内。HSV-2感染男性表现为阴茎的水泡性溃疡损伤，HSV-2感染女性表现为宫颈、外阴、阴道的水泡性溃疡损伤，并发症包括生殖器外损伤和无菌性脑膜炎，还可能与宫颈癌的高发有关。HSV-2通过性接触传播，或由母亲的生殖器感染传递给新生儿。新生儿感染疱疹病毒具有高发病率(1/2000～1/5000)和高死亡率，因此在孕产妇中开展HSV感染状况检测具有重要意义。当确诊孕妇感染HSV时，可以通过剖宫产来防止感染的发生。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定单纯疱疹病毒引物探针组合以及荧光定量PCR试剂盒。

本发明保护一种引物探针组合，包括引物探针组甲和引物探针组乙；

引物探针组甲由特异引物对甲和探针甲组成；特异引物对甲由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成；所述探针甲的核苷酸序列如SEQID NO：3所示；

引物探针组乙由特异引物对乙和探针乙组成；特异引物对乙由SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子组成；所述探针乙的核苷酸序列如SEQID NO：6所示；

所述探针甲的一个末端修饰有荧光基团，另一个末端修饰有荧光淬灭基团；

所述探针乙的一个末端修饰有荧光基团，另一个末端修饰有荧光淬灭基团；

所述探针甲中的荧光基团和所述探针乙中的荧光基团不相同。

所述引物探针组合还包括引物探针组丙；引物探针组丙由特异引物对丙和探针丙组成；特异引物对丙由SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子组成；所述探针丙的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述探针丙的一个末端修饰有荧光基团，另一个末端修饰有荧光淬灭基团；所述探针丙中的荧光基团与所述探针甲中的荧光基团以及所述探针乙中的荧光基团均不相同。

所述引物探针组合具体由所述引物探针组甲和所述引物探针组乙组成。

所述引物探针组合具体由所述引物探针组甲、所述引物探针组乙和所述引物探针组丙组成。

所述引物探针组合的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

(a)鉴定单纯疱疹病毒；

(b)鉴别单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型；

(c)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒；

(d)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型。

本发明还保护以上任一所述引物探针组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

(a)鉴定单纯疱疹病毒；

(b)鉴别单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型；

(c)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒；

(d)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型。

本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述引物探针组合；

所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

(a)鉴定单纯疱疹病毒；

(b)鉴别单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型；

(c)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒；

(d)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型。

所述试剂盒还包括HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。HSV PCR反应液A中含有引物探针组合中的所有引物和探针；HSV PCR反应液B中含有Taq DNA聚合酶和UDG酶。

HSV PCR反应液A的组成：10×PCR Buffer、MgCl₂、dNTP/dUTP Mix、牛血清白蛋白(BSA)、HSV-1-F、HSV-1-R、HSV-1-P、HSV-2-F、HSV-2-R和HSV-2-P，余量为水。

HSV PCR反应液A的组成：10×PCR Buffer、MgCl₂、dNTP/dUTP Mix、牛血清白蛋白(BSA)、HSV-1-F、HSV-1-R、HSV-1-P、HSV-2-F、HSV-2-R、HSV-2-P、GAPDH-F、GAPDH-R和GAPDH-P，余量为水。

HSV PCR反应液B的组成：Taq DNA聚合酶和UDG酶。0.63μL HSV PCR反应液B中，TaqDNA聚合酶的含量为3U，UDG酶的含量为0.06U。

27.37μL HSV PCR反应液A、0.63μL HSV PCR反应液B和2μL模板溶液组成30μL反应体系。30μL反应体系中，各个组分的浓度为：1×PCR Buffer、4mM MgCl₂、0.6mM dNTP/dUTP、4g/100ml BSA、0.1μM HSV-1-F、0.1μM HSV-1-R、0.1μM HSV-1-P、0.2μM HSV-2-F、0.2μMHSV-2-R、0.2μM HSV-2-P、0.1μM GAPDH-F、0.1μM GAPDH-R、0.1μM GAPDH-P。

27.37μL HSV PCR反应液A、0.63μL HSV PCR反应液B和2μL模板溶液组成30μL反应体系。30μL反应体系中，各个组分的浓度为：1×PCR Buffer、4mM MgCl₂、0.6mM dNTP/dUTP、4g/100ml BSA、0.1μM HSV-1-F、0.1μM HSV-1-R、0.1μM HSV-1-P、0.2μM HSV-2-F、0.2μMHSV-2-R、0.2μM HSV-2-P。

所述试剂盒还包括记载有如下检测方法的载体：

反应体系(30μL)：27.37μL HSV PCR反应液A、0.63μL HSV PCR反应液B、2μL模板溶液；

反应程序参数见表1。

所述试剂盒还包括记载有如下判断标准的载体：

对于人临床样本来说：CY5通道的Ct＜45，代表样本可信；HEX通道Ct≤37判断为HSV-1阳性，HEX通道Ct＝45或无Ct值判断为HSV-1阴性，HEX通道37＜Ct＜45判断为检测灰区(应复检一次，若复检37＜Ct＜45判断为HSV-1阳性，否则判断为HSV-1阴性)；FAM通道Ct≤37判断为HSV-2阳性，FAM通道Ct＝45或无Ct值，判断为HSV-2阴性，FAM通道37＜Ct＜45判断为检测灰区(应复检一次，若复检37＜Ct＜45判断为HSV-2阳性，否则判断为HSV-2阴性)。

本发明还保护所述引物探针组甲。所述引物探针组甲的功能为鉴定单纯疱疹病毒I型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述的引物探针组甲；所述试剂盒的功能为鉴定单纯疱疹病毒I型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型。所述试剂盒还包括所述的引物探针组丙。

本发明还保护所述的引物探针组甲在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定单纯疱疹病毒I型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型。

本发明还保护所述引物探针组乙。所述引物探针组乙的功能为鉴定单纯疱疹病毒II型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒II型。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述的引物探针组乙；所述试剂盒的功能为鉴定单纯疱疹病毒II型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒II型。所述试剂盒还包括所述的引物探针组丙。

本发明还保护所述的引物探针组乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定单纯疱疹病毒II型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒II型。

以上按任一所述待测样本为生物样本或来源于生物的样本。所示来源于生物的样本包括但不限于生物的代谢物样本、生物的分泌物样本等。

由于培养法的困难和血清学方法的滞后，需寻找更灵敏更快速的方法。

本发明中，采用荧光定量PCR(Taqman探针)检测单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型，具有特异性强(对其他病原体不存在非特异性的扩增)、灵敏度高(最低拷贝数为100copies/μL)、准确性高(可达100％)、快速、定量准确等优点。并且，由于采用了多重荧光定量PCR，极大的提高检测的效率，并且节省了样本量。Ct值方差小于5％，对高、低两个浓度的参考品均具有很高的精密性，每批试剂批内变异系数小于5％，连续三批试剂批间变异系数小于5％。本发明对于单纯疱疹病毒检测领域具有重大的应用推广价值，对于单纯疱疹病毒引起的疾病的防控，具有重大意义。

附图说明

图1为实施例3的步骤一的扩增曲线。

图2为实施例3的步骤二的扩增曲线。

图3为实施例3的步骤三的扩增曲线。

图4为实施例4的步骤二的扩增曲线。

图5为实施例5的扩增曲线。

图6为实施例6的步骤一的扩增曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均自常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中，采用DU730核酸蛋白分析仪测定质粒的浓度，换算成拷贝数。NoCt代表无扩增曲线。

实施例1、引物、探针以及标准品质粒的制备

一、引物、探针的制备

经过引物探针的设计与筛选，以及效果比较验证，获得引物探针组甲和引物探针组乙。

引物探针组甲的靶基因为HSV-1的UL27基因(编码的蛋白质的序列号：AER37611.1)。引物探针组甲由HSV-1-F(上游引物)、HSV-1-R(下游引物)和HSV-1-P(探针)组成。

HSV-1-F(SEQ ID NO：1)：5’-GTTGGGAACTTGGGTGTAGTT-3’；

HSV-1-R(SEQ ID NO：2)：5’-GGAACACAAGGCCAAGAAGA-3’；

HSV-1-P(SEQ ID NO：3)：5’-HEX-ATGACCATGTCGGTGACCTTGGC-BHQ1-3’。

引物探针组乙的靶基因为HSV-2的UL27基因(编码的蛋白质的序列号：ATD86764.1)。引物探针组乙由HSV-2-F(上游引物)、HSV-2-R(下游引物)和HSV-2-P(探针)组成。

HSV-2-F(SEQ ID NO：4)：5’-CGGTGGTCTCCATGTTGTT-3’；

HSV-2-R(SEQ ID NO：5)：5’-CACCGCTACTCCCAGTTTATG-3’；

HSV-2-P(SEQ ID NO：6)：5’-FAM-TGTCGATCACCTCCTCGAAGGGAA-BHQ1-3’。

引物探针组丙的靶基因为人GAPDH基因(作为内参基因)。引物探针组丙由GAPDH-F(上游引物)、GAPDH-R(下游引物)和GAPDH-P(探针)组成。

GAPDH-F(SEQ ID NO：7)：5’-GGAGTGAGTGGAAGACAGAATG-3’；

GAPDH-R(SEQ ID NO：8)：5’-GAGGGACACAAGGTTACCATATAC-3’；

GAPDH-P(SEQ ID NO：9)：5’-CY5-AACTAGGATGGTGTGGCTCCCTTG-BHQ1-3’。

引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

HEX、FAM、CY5均为荧光基团。BHQ1为荧光淬灭基团。

二、标准品质粒的制备

将SEQ ID NO：10中第2-221位核苷酸所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒甲。将SEQ ID NO：11中第2020-2214位核苷酸所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒乙。将SEQ ID NO：12中第2180-2380位核苷酸所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒丙。

实施例2、检测方法的建立

一、获取样本

1、男性生殖道样本的采集(采用方法①或方法②)：①用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，然后取尿道分泌物，将分泌物置入无菌玻璃管，用无菌棉球将管口塞紧；②用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，然后用细小棉拭子伸入快尿道约2-4cm，略捻拭子取出分泌物(应略带黏膜)，将棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将管口塞紧，密闭。

2、女性生殖道样本的采集：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭子采取宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将管口塞紧，密闭。

3、女性尿道样本的采集(采用方法①或方法②)：①用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，然后取尿道分泌物，将分泌物置入无菌玻璃管，用无菌棉球将管口塞紧；②用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，然后用细小棉拭子伸入快尿道约2-4cm，略捻拭子取出分泌物(应略带黏膜)，将棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将管口塞紧，密闭。

4、疱疹溃疡部位疱疹液的采集：用刮片刮取溃疡病灶处的脱落细胞，置于无菌玻璃管，密闭。

采集样本应立即送检，如当天不能检测时在2-8℃保存不应超过24小时，-15至-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存。应该避免反复冻融，冻存样本解冻后应充分混匀。

二、提取样本的总DNA，即为模板溶液。

三、PCR扩增

反应体系(30μL)：27.37μL HSV PCR反应液A、0.63μL HSV PCR反应液B、2μL模板溶液。

HSV PCR反应液A的组成：10×PCR Buffer、25mM MgCl₂、dNTP/dUTP Mix、牛血清白蛋白(BSA)、HSV-1-F、HSV-1-R、HSV-1-P、HSV-2-F、HSV-2-R、HSV-2-P、GAPDH-F、GAPDH-R和GAPDH-P，余量为水。10×PCR Buffer(Mg²⁺free)：宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为9151AM。25mM MgCl₂为10×PCR Buffer配套产品。dNTP/dUTP Mix：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为B300578。

HSV PCR反应液B的组成：Taq DNA聚合酶和UDG酶。0.63μL HSV PCR反应液B中，TaqDNA聚合酶的含量为3U，UDG酶的含量为0.06U。Taq DNA聚合酶(产品规格为5U/μl)：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为B500010。UDG酶(产品规格为2U/μl)：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为B110042。

30μL反应体系中，由HSV PCR反应液A提供的各个组分的浓度为：1×PCR Buffer、4mM MgCl₂、0.6mM dNTP/dUTP、4g/100ml BSA、0.1μM HSV-1-F、0.1μM HSV-1-R、0.1μM HSV-1-P、0.2μM HSV-2-F、0.2μM HSV-2-R、0.2μM HSV-2-P、0.1μM GAPDH-F、0.1μM GAPDH-R、0.1μM GAPDH-P。对于dNTP/dUTP来说，0.6mM指的是总浓度，dATP/dCTP/dGTP在30μL反应体系中的浓度均为0.12mM，dUTP在30μL反应体系中的浓度为0.24mM。

反应在荧光PCR仪上进行。反应程序参数见表1。

表1

对于人临床样本来说：CY5通道的Ct＜45，代表样本可信；HEX通道Ct≤37判断为HSV-1阳性，HEX通道Ct＝45或无Ct值判断为HSV-1阴性，HEX通道37＜Ct＜45判断为检测灰区(应复检一次，若复检37＜Ct＜45判断为HSV-1阳性，否则判断为HSV-1阴性)；FAM通道Ct≤37判断为HSV-2阳性，FAM通道Ct＝45或无Ct值，判断为HSV-2阴性，FAM通道37＜Ct＜45判断为检测灰区(应复检一次，若复检37＜Ct＜45判断为HSV-2阳性，否则判断为HSV-2阴性)。

实施例3、灵敏度

一、灵敏度的确定

将标准品质粒甲和标准品质粒乙混合，用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液Ⅰ和标准品溶液Ⅱ。标准品溶液Ⅰ中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为100Copies/μL。标准品溶液Ⅱ中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为10Copies/μL。

分别将标准品溶液Ⅰ和标准品溶液Ⅱ作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增。进行10次重复试验。采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

扩增曲线见图1(A对应标准品溶液Ⅰ，B对应标准品溶液Ⅱ)。Ct值结果见表2。在10次重复实验中，质粒浓度为10Copies/μL时存在较高的不被检出情况，即为不稳定检出。质粒浓度为100Copies/μL时全部能检出，表明100Copies/μL浓度为稳定检出浓度。因此，灵敏度为100Copies/μL。

表2

二、灵敏度的稳定性

将标准品质粒甲和标准品质粒乙混合，用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液。标准品溶液中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为100Copies/μL。

将标准品溶液作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增。进行10次重复试验。采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

Ct值结果见表3。扩增曲线见图2。

表3

序号	HSV-1检测通道	HSV-2检测通道
			1	33.77	32.20
2	33.21	33.03
			3	33.04	32.72
4	32.97	32.27
			5	33.50	33.09
6	33.43	32.64
			7	33.54	33.15
8	34.18	32.74
			9	33.66	32.21
10	33.25	33.15

三、分析灵敏度

分别制备3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。

将标准品质粒甲和标准品质粒乙混合，用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液。标准品溶液中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为100Copies/μL。

将标准品溶液作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。每个批次进行10次重复试验。采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

Ct值结果见表4。分析灵敏度为100Copies/μL，检测结果符合Ct≤37。某一批次时的扩增曲线见图3。

表4

实施例4、特异性

分别制备3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。

一、引物探针组甲和引物探针组乙组合的特异性

N2样本、N3样本、N4样本和N6样本均为医院提供的灭活的人临床样本(N2样本：沙眼衣原体阳性临床样本；N3样本：解脲脲原体阳性临床样本；N4样本：淋球菌阳性临床样本；N6样本：人乳头瘤病毒阳性临床样本)。N5样本：白色念珠菌(中国食品发酵工业研究院有限公司)。人临床样本为患者的生殖道分泌物或患病部位疱疹液。人临床样本，均已经医院确诊，均已获取患者的知情同意。

按照实施例2的步骤二和步骤三进行操作。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

将水作为阴性对照。将标准品溶液作为阳性对照(将标准品质粒甲、标准品质粒乙和标准品质粒丙混合，用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液；标准品溶液中，标准品质粒甲、标准品质粒乙和标准品质粒丙的浓度均为10000Copies/μL)。

Ct值结果见表5、表6和表7(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。结果表明，对沙眼衣原体、解脲脲原体、淋球菌、白色念珠菌和人乳头瘤病毒均无交叉反应，具有很高的特异性。

表5

N2样本

N3样本

N4样本

N5样本

N6样本

阳性对照

阴性对照

HSV-1检测通道

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

26.32

NoCt

HSV-2检测通道

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

25.72

NoCt

内参基因检测通道

26.68

27.60

24.65

NoCt

24.76

26.55

NoCt

表6

N2样本

N3样本

N4样本

N5样本

N6样本

阳性对照

阴性对照

HSV-1检测通道

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

26.44

NoCt

HSV-2检测通道

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

26.05

NoCt

内参基因检测通道

25.97

26.98

24.54

NoCt

24.65

25.89

NoCt

表7

N2样本

N3样本

N4样本

N5样本

N6样本

阳性对照

阴性对照

HSV-1检测通道

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

26.38

NoCt

HSV-2检测通道

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

NoCt

25.86

NoCt

内参基因检测通道

26.23

27.41

24.28

NoCt

24.12

26.34

NoCt

二、引物探针组甲和引物探针组乙各自的特异性

样本为医院提供的灭活的人临床样本(P1样本：HSV-1阳性临床样本；P2样本：HSV-1阳性临床样本；P3样本：HSV-2阳性临床样本；P4样本：HSV-2阳性临床样本)。人临床样本为患者的生殖道分泌物或患病部位疱疹液。人临床样本，均已经医院确诊，均已获取患者的知情同意。

按照实施例2的步骤二和步骤三进行操作。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

Ct值结果见表8、表9和表10(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。结果表明，P1样本和P2样本均HSV-1检测通道阳性且HSV-2检测通道阴性，P3样本和P4样本均HSV-1检测通道阴性且HSV-2检测通道阳性，即引物探针组甲和引物探针组乙彼此之间不存在非特异性扩增。某一批次时的扩增曲线见图4。

表8

	HSV-1检测通道	HSV-2检测通道
			P1样本	27.87	NoCt
P2样本	26.06	NoCt
			P3样本	NoCt	25.28
P4样本	NoCt	26.36

表9

	HSV-1检测通道	HSV-2检测通道
			P1样本	27.31	NoCt
P2样本	28.57	NoCt
			P3样本	NoCt	26.24
P4样本	NoCt	25.39

表10

	HSV-1检测通道	HSV-2检测通道
			P1样本	27.62	NoCt
P2样本	25.87	NoCt
			P3样本	NoCt	25.35
P4样本	NoCt	25.71

实施例5、准确性

分别制备3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。

将标准品质粒甲和标准品质粒乙混合，用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液。标准品溶液中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为10⁴Copies/μL。

将标准品溶液作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。每个批次进行10次重复试验。采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

Ct值结果见表11。结果表明，具有很高的准确性。某一批次时的扩增曲线见图5。

表11

实施例6、精密性

分别制备3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。

采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

将标准品质粒甲和标准品质粒乙混合，用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液P3。标准品溶液P3中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为10⁴Copies/μL。将标准品溶液P3作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。每个批次进行20次重复试验。

将标准品质粒甲用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液S1。标准品溶液S1中，标准品质粒甲的浓度为10²Copies/μL。将标准品质粒乙用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液S2。标准品溶液S2中，标准品质粒乙的浓度为10²Copies/μL。分别将标准品溶液S1和标准品溶液S2作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增(标准品溶液S1采用HSV-1检测通道。标准品溶液S2采用HSV-2检测通道)。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。每个批次进行20次重复试验。

一、批内不精密性

标准品溶液P3作为模板溶液的Ct值结果以及批内不精密性指标的结果见表12。

分别将标准品溶液S1和标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值结果以及批内不精密性指标的结果见表13。某一批次时的扩增曲线见图6。

表12

表13

二、批间不精密性

根据三个批次的Ct值均值，计算连续三批的批间不精密性，结果见表14。

表14

结果表明，对高、低两个浓度的参考品均具有很高的精密性，每批试剂批内变异系数小于5％，连续三批试剂批间变异系数小于5％。

实施例7、干扰物质

对于本发明的检测目标物来说，临床样本为生殖道分泌物或患病部位疱疹液，样本中潜在的一些物质可能会对检测结果产生影响，故需要对其评估。

取市售干粉血红蛋白，用PBS缓冲液溶解，得到血红蛋白浓度为5mg/ml的血红蛋白溶液。

取实施例4中的P1样本，与血红蛋白溶液等体积混合，得到P1N样本。按照实施例2的步骤二和步骤三进行操作。进行10次重复试验。

取实施例4中的P1样本，与PBS缓冲液等体积混合，得到P1D样本。按照实施例2的步骤二和步骤三进行操作。

取实施例4中的P3样本，与血红蛋白溶液等体积混合，得到P3N样本。按照实施例2的步骤二和步骤三进行操作。进行10次重复试验。

取实施例4中的P3样本，与PBS缓冲液等体积混合，得到P3D样本。按照实施例2的步骤二和步骤三进行操作。

将水作为阴性对照。

采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

Ct值结果见表15。结果表明，具有很好的重复性和稳定性，即临床样本中带有血红蛋白对检测效果无干扰影响。

表15

实施例8、适用机型

分别制备3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。

将标准品质粒甲和标准品质粒乙混合，用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液P3。标准品溶液P3中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为10⁴Copies/μL。将标准品溶液P3作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。每个批次进行20次重复试验。

将标准品质粒甲用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液S1。标准品溶液S1中，标准品质粒甲的浓度为10²Copies/μL。将标准品质粒乙用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液S2。标准品溶液S2中，标准品质粒乙的浓度为10²Copies/μL。分别将标准品溶液S1和标准品溶液S2作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增(标准品溶液S1采用HSV-1检测通道。标准品溶液S2采用HSV-2检测通道)。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。每个批次进行20次重复试验。

分别采用实施例4中的N2样本、N3样本、N4样本、N5样本、N6样本，按照实施例2的步骤二和步骤三进行操作。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。每个批次进行20次重复试验。

一、采用上海宏石Slan 96S型荧光PCR仪

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值、标准差以及变异系数的结果见表16、表17和表18(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值以及批间不精密性指标的结果见表19。

N2样本、N3样本、N4样本、N5样本、N6样本的检测结果均为阴性。

表16

表17

表18

表19

二、采用上海宏石Slan 48S型荧光PCR仪

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值、标准差以及变异系数的结果见表20、表21和表22(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值以及批间不精密性指标的结果见表23。

N2样本、N3样本、N4样本、N5样本、N6样本的检测结果均为阴性。

表20

表21

表22

表23

三、采用西安天隆TL988IV型荧光PCR仪

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值、标准差以及变异系数的结果见表24、表25和表26(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值以及批间不精密性指标的结果见表27。

N2样本、N3样本、N4样本、N5样本、N6样本的检测结果均为阴性。

表24

表25

表26

表27

四、采用Applied Biosystems 7500 FAST Real-Time PCR System

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值、标准差以及变异系数的结果见表28、表29和表30(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值以及批间不精密性指标的结果见表31。

N2样本、N3样本、N4样本、N5样本、N6样本的检测结果均为阴性。

表28

表29

表30

表31

五、采用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值、标准差以及变异系数的结果见表32、表33和表34(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值以及批间不精密性指标的结果见表35。

N2样本、N3样本、N4样本、N5样本、N6样本的检测结果均为阴性。

表32

表33

表34

表35

六、采用Roche

480Real-Time PCR System

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值、标准差以及变异系数的结果见表36、表37和表38(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。

标准品溶液P3作为模板溶液、标准品溶液S1作为模板溶液、标准品溶液S2作为模板溶液的Ct值均值以及批间不精密性指标的结果见表39。

N2样本、N3样本、N4样本、N5样本、N6样本的检测结果均为NoCt。

表36

表37

表38

表39

对比例、

引物探针组D1的靶基因为HSV-1的糖蛋白D基因(靶序列位于MH925774.1)。引物探针组D1由HSV-1-DF(上游引物)、HSV-1-DR(下游引物)和HSV-1-DP(探针)组成。

HSV-1-DF：5’-GGGAGGCAACTGTGCTATC-3’；

HSV-1-DR：5’-CGCTGAAGCTGTCATAGTAGTT-3’；

HSV-1-DP：5’-HEX-ACGGTCATGGAGTACACCGAATGC-BHQ1-3’。

引物探针组D2的靶基因为HSV-2的糖蛋D基因(靶序列位于MH899846.1)。引物探针组D2由HSV-2-DF(上游引物)、HSV-2-DR(下游引物)和HSV-2-DP(探针)组成。

HSV-2-DF：5’-CAGGTAATCCAGATCGCCATAC-3’；

HSV-2-DR：5’-GGCATCTATGGATGAAGCAGATA-3’；

HSV-2-DP：5’-FAM-AAACACAAAGGCGATGATGGACGC-BHQ1-3’。

引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

将SEQ ID NO：13中第2-170位核苷酸所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒D1。将SEQ ID NO：14中第700-857位核苷酸所示的DNA分子插入pMD18-T载体，得到标准品质粒D2。

一、分析灵敏度

分别制备3个批次的HSV PCR反应液C(与HSV PCR反应液A的差别仅在于：用引物探针组D1代替引物探针组甲，用引物探针组D2代替引物探针组乙)和HSV PCR反应液B。

将标准品质粒D1和标准品质粒D2混合，用TE缓冲液悬浮，得到标准品溶液。标准品溶液中，标准品质粒D1和标准品质粒D2的浓度均为100Copies/μL。

将标准品溶液作为模板溶液，按照实施例2的步骤三进行PCR扩增。分别采用3个批次的HSV PCR反应液C和HSV PCR反应液B。每个批次进行10次重复试验。采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

Ct值结果见表40。分析灵敏度大于100Copies/μL，较实施例3的灵敏度低。

表40

二、特异性

分别制备3个批次的HSV PCR反应液C(与HSV PCR反应液A的差别仅在于：用引物探针组D1代替引物探针组甲，用引物探针组D2代替引物探针组乙)和HSV PCR反应液B。

分别采用实施例4中的N2样本、N3样本、N4样本、N5样本、N6样本，按照实施例2的步骤二和步骤三进行操作。分别采用3个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B。采用上海宏石Slan-96P型荧光PCR仪。

Ct值结果见表41、表42和表43(每个表对应一个批次的HSV PCR反应液A和HSV PCR反应液B)。结果表明，对解脲脲原体和人乳头瘤病毒交叉反应严重，特异性不足。

表41

	N2样本	N3样本	N4样本	N5样本	N6样本
						HSV-1检测通道	NoCt	NoCt	NoCt	NoCt	NoCt
HSV-2检测通道	NoCt	29.21	NoCt	NoCt	35.14

表42

	N2样本	N3样本	N4样本	N5样本	N6样本
						HSV-1检测通道	NoCt	NoCt	NoCt	NoCt	NoCt
HSV-2检测通道	NoCt	28.17	NoCt	NoCt	33.68

表43

	N2样本	N3样本	N4样本	N5样本	N6样本
						HSV-1检测通道	NoCt	NoCt	NoCt	NoCt	NoCt
HSV-2检测通道	NoCt	30.04	NoCt	NoCt	31.51

SEQUENCE LISTING

<110> 北京康美天鸿生物科技有限公司

<120> 用于鉴定单纯疱疹病毒的引物探针组合以及荧光定量PCR试剂盒

<130> GNCYX192027

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gttgggaact tgggtgtagt t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ggaacacaag gccaagaaga 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgaccatgt cggtgacctt ggc 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cggtggtctc catgttgtt 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

caccgctact cccagtttat g 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

tgtcgatcac ctcctcgaag ggaa 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

ggagtgagtg gaagacagaa tg 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

gagggacaca aggttaccat atac 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

aactaggatg gtgtggctcc cttg 24

<210> 10

<211> 2715

<212> DNA

<213> Herpes Simplex Viruses

<400> 10

tcacaggtcg tcctcgtcgg cgtcaccgtc tttgttggga acttgggtgt agttggtgtt 60

gcggcgcttg cgcatgacca tgtcggtgac cttggcgctg agcagcgcgc tcgtgccctt 120

cttcttggcc ttgtgttccg tgcgctccat ggccgacacc agggccatgt accgtatcat 180

ctccctggcc tcggctagct tggcctcgtc aaagtcgccg ccctcctcgc cctccccgga 240

cgcgtccggg ttggtggggt tcttgagctc cttggtggtt agcgggtaca gggccttcat 300

ggggttgctc tgcagccgca tgacgtagcg aaaggcgaag aaggccgccg ccaggccggc 360

caggaccaac agacccacgg ccagcgcccc aaaggggttg gacatgaagg aggacacgcc 420

cgacacggcc gataccacgc cgcccacgat gcccatcacc accttgccga ccgcgcgccc 480

caggtcgccc atcccctcga agaacgcgcc caggcccgcg aacatggcgg cgttggcgtc 540

ggcgtggatg accgtgtcga tgtcggcaaa gcgcaggtcg tgcagctggt tgcggcgctg 600

gacctccgtg tagtccagca ggccgctgtc cttgatctcg tggcgggtgt acacctccag 660

ggggacaaac tcgtgatcct ccagcatggt aatgttgagg tcgatgaagg tgctgacggt 720

ggtgatgtcg gcgcggctca gctggtggga gtacgcgtac tcctcgaagt acacgtagcc 780

cccaccgaag gtgaagtagc gccggtgtcc cacggtgcac ggctcgatcg catcgcgcgt 840

cagccgcagc tcgttgttct cccccagctg cccctcgacc aacgggccct ggtcttcgta 900

ccgaaagctg accagggggc ggctgtagca ggccccgggc cgcgagctga tgcgcatcga 960

gttttggacg atcacgttgt ccgcggcgac cggcacgcac gtggagacgg ccatcacgtc 1020

gccgagcatc cgcgcgctca cccgccggcc cacggtggcc gaggcgatgg cgttggggtt 1080

cagcttgcgg gcctcgttcc acagggtcag ctcgtgattc tgcaactcgc accacgcgat 1140

ggcaacgcgg cccaacatat cgttgacatg gcgctgtatg tggttgtacg taaactgcag 1200

ccgggcgaac tcgatggagg aggtggtctt gatgcgctcc acggacgcgt tggcgctggc 1260

cccgggcggc gggggcgtgg ggtttggggg cttgcggctc tgctctcgga ggtgttcccg 1320

cacatacagc tccgcgagcg tgttgctgag aaggggctgg tacgcgatca gaaagccccc 1380

attggccagg tagtactgcg gctggcccac cttgatgtgc gtcgcgttgt acctgcgggc 1440

gaagatgcgg tccatggcgt cgcgggcgtc cttgccgatg cagtccccca ggtccacgcg 1500

cgagagcggg tactcggtca ggttggtggt gaaggtggtg gatatggcat cggaggagaa 1560

tcggaaggag ccgccgtact cggagcgcag catctcgtcc acctcctgcc acttggtcat 1620

ggtgcagacc gacgggcgct ttggcaccca gtcccaggcc acggtgaact tgggggtcgt 1680

gagcagattc cgggtggtcg gcgccgtggc ccgggccttg gtggtgaggt cgcgcgcgta 1740

gaagccgtcg acctgcttga agcggtcggc ggcgtagctg gtgtgttcgg tgtgcgatcc 1800

ctcccggtag ccgtaaaacg gggacatgta cacaaagtcg ccagtcgcca gcacaaactc 1860

gtcgtacggg tacaccgagc gcgcgtccac ctcctcgacg atgcagttta ccgtcgtccc 1920

gtaccggtgg aacgcctcca cccgcgaggg gttgtacttg aggtcggtgg tgtgccagcc 1980

ccggctcgtg cgggtcgcgg cattggccgg tttcagctcc atgtcggtct cgtggtcgtc 2040

ccggtgaaac gcggtggtct ccaggttgtt gcgcacgtac ttggccgtgg accgacagac 2100

ccccttggcg ttgatcttgt cgatcacctc ctcgaagggg acgggggcgc ggtcctcaaa 2160

gatccccata aactgggagt agcggtggcc gaaccacacc tgcgaaacgg tgacgtcttt 2220

gtagtacatg gtggccttga acttgtacgg ggcgatgttc tccttgaaga ccaccgcgat 2280

gccctccgtg tagttctgac cctcgggccg ggtcgggcag cggcgcggct gctcgaactg 2340

caccaccgtg gcgcccgtgg ggggtgggca cacgtaaaag tttgcatcgg tgttctccgc 2400

cttgatgtcc cgcaggtgct cgcgcagggt ggcgtggccc gcggcgacgg tcgcgttgtc 2460

gccggcgggg cgtggcggcg ttgggttttt cggttttttg ttcttcttcg gtttcgggtc 2520

ccccgttggg gcggcgccaa gggcgggcgg cgccggagtg gcagggcccc cgttcgccgc 2580

ctgggtcgcg gccgcgaccc caggcgtgcc gggggaactc ggagccgccg acgccaccag 2640

gacccccagc gtcaacccca agagcgccca tacgacgaac caccggcacc cccgcgcggg 2700

ggcgccctgg cgcat 2715

<210> 11

<211> 2706

<212> DNA

<213> Herpes Simplex Viruses

<400> 11

ttagagctcg tcttcgtctc cggcctcgtc ctcgttgtgg agcggagagt acctggcttt 60

gttgcgcttg cgcagaacca tgttggtgac cttggagctg agcagggcgc tcgtgccctt 120

ctttctggcc ttgtgttccg tgcgctccat ggccgacacc aaagccatat atcggatcat 180

ttctcgggcc tcggccaact tggcctcgtc aaacccgccc ccctccgcgc cttcctcccc 240

ctccccgccc acgcccccgg ggtcggaagt cttgagttcc ttggtggtga gcggatacag 300

ggccttcatg ggattgcgtt gcagttgcag gacgtagcgg aaggcgaaga aggccgcgac 360

caggccggcc aggaccagca gccccacggc aagcgccccg aaggggttgg acataaagga 420

ggacacgccc gagacggccg acaccacgcc ccccactact cccatgacga ccttgccgac 480

cgcgcgcccc aagtccccca tcccctcgaa gaacgcgcac agccccgcga acatggcggc 540

gttggcgtcg gcgcggatga ccgtgtcgat gtcggcaaag cgcaggtcgt gcagctggtt 600

gcggcgctgg acctccgtgt agtccagcag gccgctgtcc ttgatctcgt ggcgcgtgta 660

gacctccagg ggcacaaact cgtggtcctc cagcatggtg atgttcaggt cgatgaaggt 720

gctgacggtg gtgacgtcgg cgcgactcag ctggtgagag tacgcgtact cctcgaagta 780

cacgtagccc ccgccgaaga tgaagtagcg ccggtggccc acggtgcacg gctcgagcgc 840

gtcgcgggtg aggcgcagct cgttgttctc gcccagctgc ccctcgatca gcgggccctg 900

gtcttcgtac cgaaagctga ccagggggcg gctgtagcac gtccccggcc gcgagctgac 960

gcgcatcgag ttctgcacga tcacgttgtc cggggcgacg ggcacgcacg tggagacggc 1020

catgacgtct ccgagcatgc gcgcgctcac ccgccggccg acggtggcgg aggcgatggc 1080

gttggggttg agcttgcggg cctcgttcca gagagtcagc tcgtggttct gcagctcgca 1140

ccacgcgacg gcgatgcgcc ccagcatgtc gttcacgtgg cgctgtatgt ggttatacgt 1200

aaactgcagc cgggcgaact cgatcgagga ggtggtcttg atgcgctcca cggacgcgtt 1260

ggcgctgggc gcctcccgca gtggcgcggg cgtggcattc cggggcttgc ggtcctgctc 1320

ccgcatgtac tcccgcacgt acagctcggc gagcgtgttg ctgaggaggg gctggtacgc 1380

gatgaggaag ccccccgtgg ccaggtagta ctgcggctgg cccaccttga tgtgcgtggc 1440

gttgtacttg cgcgcaaaca tgcggtcgat ggcctcgcgg gcatcccggc cgatgcagtc 1500

gcccaggtcg acgcgcgaga gcgagtactg ggtcaggttg gtggtgaagg tggtcgagat 1560

agcgtcggag gagaagcgga aggagccgcc gtactcggcg cggagcatct cgtccacctc 1620

ctgccacttg gtcatggtgc agaccgccgg tcgcttcggc acccagtccc aggccacggt 1680

aaacttgggg gtcgtcagca agttgcgggt cgtcggcgac gtggcccggg ccttcgtggt 1740

gaggtcgcgc gcgtagaagc cgtcgacctg cttgaagcgg tcggcggcgt agctggtgtg 1800

ctcggtgtgc gacccctccc ggtagccgta aaacggggac atgtacacaa agtcgcccgt 1860

cgccagcaca aactcatcgt acgggtacac cgaccgcgcg tccacctcct cgacgatgca 1920

gttgaccgtc gtgccgtacc gatggaacgc ctccacccgc gaggggttgt acttgaggtc 1980

ggtggtgtgc cacccccggc tcgtgcgcgt ggcgaccttc gccggcttga gctccatgtc 2040

ggtctcgtgg tcgtcccggt gaaacgcggt ggtctccatg ttgttccgca cgtacttggc 2100

cgtggagcgg cagaccccct tggcgttaat cttgtcgatc acctcctcga agggaacggg 2160

ggcgcggtcc tcgaatatcc ccataaactg ggagtagcgg tggccgaacc acacctgcga 2220

cacggtcacg tctttgtagt acatggtggc cttgaatttg tacggggcga tgttctcctt 2280

gaagaccacc gcgatgccct ccgtgtagtt ctgcccctcc gggcgcgtcg ggcagcggcg 2340

cggctgctca aactgcacca ccgtggcgcc cgtcgggggc gggcacacgt aaaactgggc 2400

atcggcgttc tcgaccttga tttcccgcag gtgcgcgcgc agcgtggcgt ggccggcggc 2460

gacggtcgcg ttggcgtcgg ggggcggggt cgcctcgggc cgcttaggcg gctttttggt 2520

tttccgcttc cgggccttgg tggtcgcggg gctcgggacg gggggcggct gggaggcggg 2580

acccccgttc gccgcgacgg tcgcggccac gccgcccgag gcgcgggggg ccgccggggc 2640

cgccgacgcc accgcggcca ccagcgcccc cacgaccagc gcgcaaatca agcccccccc 2700

gcgcat 2706

<210> 12

<211> 3855

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

gctctctgct cctcctgttc gacagtcagc cgcatcttct tttgcgtcgc caggtgaaga 60

cgggcggaga gaaacccggg aggctaggga cggcctgaag gcggcagggg cgggcgcagg 120

ccggatgtgt tcgcgccgct gcggggtggg cccgggcggc ctccgcattg caggggcggg 180

cggaggacgt gatgcggcgc gggctgggca tggaggcctg gtgggggagg ggaggggagg 240

cgtgtgtgtc ggccggggcc actaggcgct cactgttctc tccctccgcg cagccgagcc 300

acatcgctca gacaccatgg ggaaggtgaa ggtcggagtc aacgggtgag ttcgcgggtg 360

gctggggggc cctgggctgc gaccgccccc gaaccgcgtc tacgagcctt gcgggctccg 420

ggtctttgca gtcgtatggg ggcagggtag ctgttccccg caaggagagc tcaaggtcag 480

cgctcggacc tggcggagcc ccgcacccag gctgtggcgc cctgtgcagc tccgcccttg 540

cggcgccatc tgcccggagc ctccttcccc tagtccccag aaacaggagg tccctactcc 600

cgcccgagat cccgacccgg acccctaggt gggggacgct ttctttcctt tcgcgctctg 660

cggggtcacg tgtcgcagag gagcccctcc cccacggcct ccggcaccgc aggccccggg 720

atgctagtgc gcagcgggtg catccctgtc cggatgctgc gcctgcggta gagcggccgc 780

catgttgcaa ccgggaagga aatgaatggg cagccgttag gaaagcctgc cggtgactaa 840

ccctgcgctc ctgcctcgat gggtggagtc gcgtgtggcg gggaagtcag gtggagcgag 900

gctagctggc ccgatttctc ctccgggtga tgcttttcct agattattct ctggtaaatc 960

aaagaagtgg gtttatggag gtcctcttgt gtcccctccc cgcagaggtg tggtggctgt 1020

ggcatggtgc caagccggga gaagctgagt catgggtagt tggaaaagga catttccacc 1080

gcaaaatggc ccctctggtg gtggcccctt cctgcagcgc cggctcacct cacggccccg 1140

cccttcccct gccagcctag cgttgacccg accccaaagg ccaggctgta aatgtcaccg 1200

ggaggattgg gtgtctgggc gcctcgggga acctgccctt ctccccattc cgtcttccgg 1260

aaaccagatc tcccaccgca ccctggtctg aggttaaata tagctgctga cctttctgta 1320

gctgggggcc tgggctgggg ctctctccca tcccttctcc ccacacacat gcacttacct 1380

gtgctcccac tcctgatttc tggaaaagag ctaggaagga caggcaactt ggcaaatcaa 1440

agccctggga ctagggggtt aaaatacagc ttcccctctt cccacccgcc ccagtctctg 1500

tcccttttgt aggagggact tagagaaggg gtgggcttgc cctgtccagt taatttctga 1560

cctttactcc tgccctttga gtttgatgat gctgagtgta caagcgtttt ctccctaaag 1620

ggtgcagctg agctaggcag cagcaagcat tcctggggtg gcatagtggg gtggtgaata 1680

ccatgtacaa agcttgtgcc cagactgtgg gtggcagtgc cccacatggc cgcttctcct 1740

ggaagggctt cgtatgactg ggggtgttgg gcagccctgg agccttcagt tgcagccatg 1800

ccttaagcca ggccagcctg gcagggaagc tcaagggaga taaaattcaa cctcttgggc 1860

cctcctgggg gtaaggagat gctgcattcg ccctcttaat ggggaggtgg cctagggctg 1920

ctcacatatt ctggaggagc ctcccctcct catgccttct tgcctcttgt ctcttagatt 1980

tggtcgtatt gggcgcctgg tcaccagggc tgcttttaac tctggtaaag tggatattgt 2040

tgccatcaat gaccccttca ttgacctcaa ctacatggtg agtgctacat ggtgagcccc 2100

aaagctggtg tgggaggagc cacctggctg atgggcagcc ccttcatacc ctcacgtatt 2160

cccccaggtt tacatgttcc aatatgattc cacccatggc aaattccatg gcaccgtcaa 2220

ggctgagaac gggaagcttg tcatcaatgg aaatcccatc accatcttcc aggagtgagt 2280

ggaagacaga atggaagaaa tgtgctttgg ggaggcaact aggatggtgt ggctcccttg 2340

ggtatatggt aaccttgtgt ccctcaatat ggtcctgtcc ccatctcccc cccaccccca 2400

taggcgagat ccctccaaaa tcaagtgggg cgatgctggc gctgagtacg tcgtggagtc 2460

cactggcgtc ttcaccacca tggagaaggc tggggtgagt gcaggagggc ccgcgggagg 2520

ggaagctgac tcagccctgc aaaggcagga cccgggttca taactgtctg cttctctgct 2580

gtaggctcat ttgcaggggg gagccaaaag ggtcatcatc tctgccccct ctgctgatgc 2640

ccccatgttc gtcatgggtg tgaaccatga gaagtatgac aacagcctca agatcatcag 2700

gtgaggaagg cagggcccgt ggagaagcgg ccagcctggc accctatgga cacgctcccc 2760

tgacttgcgc cccgctccct ctttctttgc agcaatgcct cctgcaccac caactgctta 2820

gcacccctgg ccaaggtcat ccatgacaac tttggtatcg tggaaggact catggtatga 2880

gagctgggga atgggactga ggctcccacc tttctcatcc aagactggct cctccctgcc 2940

ggggctgcgt gcaaccctgg ggttgggggt tctggggact ggctttccca taatttcctt 3000

tcaaggtggg gagggaggta gaggggtgat gtggggagta cgctgcaggg cctcactcct 3060

tttgcagacc acagtccatg ccatcactgc cacccagaag actgtggatg gcccctccgg 3120

gaaactgtgg cgtgatggcc gcggggctct ccagaacatc atccctgcct ctactggcgc 3180

tgccaaggct gtgggcaagg tcatccctga gctgaacggg aagctcactg gcatggcctt 3240

ccgtgtcccc actgccaacg tgtcagtggt ggacctgacc tgccgtctag aaaaacctgc 3300

caaatatgat gacatcaaga aggtggtgaa gcaggcgtcg gagggccccc tcaagggcat 3360

cctgggctac actgagcacc aggtggtctc ctctgacttc aacagcgaca cccactcctc 3420

cacctttgac gctggggctg gcattgccct caacgaccac tttgtcaagc tcatttcctg 3480

gtatgtggct ggggccagag actggctctt aaaaagtgca gggtctggcg ccctctggtg 3540

gctggctcag aaaaagggcc ctgacaactc ttttcatctt ctaggtatga caacgaattt 3600

ggctacagca acagggtggt ggacctcatg gcccacatgg cctccaagga gtaagacccc 3660

tggaccacca gccccagcaa gagcacaaga ggaagagaga gaccctcact gctggggagt 3720

ccctgccaca ctcagtcccc caccacactg aatctcccct cctcacagtt gccatgtaga 3780

ccccttgaag aggggagggg cctagggagc cgcaccttgt catgtaccat caataaagta 3840

ccctgtgctc aacca 3855

<210> 13

<211> 420

<212> DNA

<213> Herpes Simplex Viruses

<400> 13

ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac accgaatgct 60

cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg aactactatg 120

acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc cccgcgtttg 180

agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag attacacagt 240

ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg cgcatccccc 300

cgtcagcctg cctctccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac agcatcggga 360

tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcaccgtcgc cgtatacagc ttgaagatcg 420

<210> 14

<211> 1020

<212> DNA

<213> Herpes Simplex Viruses

<220>

<221> misc_feature

<222> (318)..(318)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 14

ctgtgggtct gcgccaccgg cctggtcgtc cgcggcccca cggtcagtct ggtctcagac 60

tcactcgtgg atgccggggc cgtggggccc cagggctttg tggaagagga cctgcgtgtt 120

ttcggggagc ttcattttgt gggggcccag gtcccccaca caaactacta cgacggcacc 180

atcgagctgt ttcactaccc cctggggaac cactgccccc gcgttgtaca cgtggtcacg 240

ctgaccgcat gcccccgccg ccccgccgtg gcgttcacct tgtgtcgctc gacgcaccac 300

gcccacagcc ccgcctancc gaccctggag ctgggtctgg cgcggcagcc gcttctgcgg 360

gttcgaacgg caacgcgcga ctatgccggt ctgtatgtcc tgcgcgtatg ggtcggcagc 420

gcgacgaacg ccagcctgtt tgttttgggg gtggcgctct ctgccaacgg gacgtttgtg 480

tataacggct cggactacgg ctcctgcgat ccggcgcagc ttcccttttc ggccccgcac 540

ctgggaccct cgagcgtata cacccccgga gcctcccgac ccacccctcc acggacaacg 600

acatccccgt cctccccccg agacccgacc cccgcccccg gggacacagg gacgcccgcg 660

cccgcgagcg gcgagagagc cccgcccaat tccacgcgat cggccagcga atcgagacac 720

aggctaaccg tagcccaggt aatccagatc gccataccgg cgtccatcat cgcctttgtg 780

tttctgggca gctgtatctg cttcatccat agatgccagc gccgatacag gcgcccccgc 840

ggccagattt acaaccccgg gggcgtttcc tgcgcggtca acgaggcggc catggcccgc 900

ctcggagccg agctgcgatc ccacccaaac acccccccca aaccccgacg ccgttcgtca 960

tcgtccacga ccatgccttc cctaacgtcg atagctgagg aatcggagcc aggtccagtc 1020

Claims (10)

1.引物探针组合，包括引物探针组甲和引物探针组乙；

引物探针组甲由特异引物对甲和探针甲组成；所述特异引物对甲由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成；所述探针甲的核苷酸序列如SEQID NO：3所示；

引物探针组乙由特异引物对乙和探针乙组成；所述特异引物对乙由SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子组成；所述探针乙的核苷酸序列如SEQID NO：6所示；

所述探针甲的一个末端修饰有荧光基团，另一个末端修饰有荧光淬灭基团；

所述探针乙的一个末端修饰有荧光基团，另一个末端修饰有荧光淬灭基团；

所述探针甲中的荧光基团和所述探针乙中的荧光基团不相同。

2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于：所述引物探针组合还包括引物探针组丙；引物探针组丙由特异引物对丙和探针丙组成；所述特异引物对丙由SEQ ID NO：7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：8所示的单链DNA分子组成；所述探针丙的核苷酸序列如SEQID NO：9所示；所述探针丙的一个末端修饰有荧光基团，另一个末端修饰有荧光淬灭基团；所述探针丙中的荧光基团与所述探针甲中的荧光基团以及所述探针乙中的荧光基团均不相同。

3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

(a)鉴定单纯疱疹病毒；

(b)鉴别单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型；

(c)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒；

(d)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型。

4.一种试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物探针组合；

所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：

(a)鉴定单纯疱疹病毒；

(b)鉴别单纯疱疹病毒I型和单纯疱疹病毒II型；

(c)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒；

(d)鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括HSV PCR反应液A和HSVPCR反应液B；HSV PCR反应液A中含有引物探针组合中的所有引物和探针；HSV PCR反应液B中含有Taq DNA聚合酶和UDG酶。

6.引物探针组甲或引物探针组乙；

引物探针组甲由特异引物对甲和探针甲组成；特异引物对甲由SEQ ID NO：1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：2所示的单链DNA分子组成；所述探针甲的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示；所述探针甲的一个末端修饰有荧光基团，另一个末端修饰有荧光淬灭基团；

引物探针组乙由特异引物对乙和探针乙组成；特异引物对乙由SEQ ID NO：4所示的单链DNA分子和SEQ ID NO：5所示的单链DNA分子组成；所述探针乙的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；所述探针乙的一个末端修饰有荧光基团，另一个末端修饰有荧光淬灭基团。

7.一种试剂盒，包括权利要求6所述的引物探针组甲；所述试剂盒的功能为鉴定单纯疱疹病毒I型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型。

8.权利要求6所述的引物探针组甲在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定单纯疱疹病毒I型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒I型。

9.一种试剂盒，包括权利要求6所述的引物探针组乙；所述试剂盒的功能为鉴定单纯疱疹病毒II型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒II型。

10.权利要求6所述的引物探针组乙在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为鉴定单纯疱疹病毒II型或鉴定待测样本中是否含有单纯疱疹病毒II型。

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