CN117987593A - 用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物及试剂盒 - Google Patents

用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，该组合物包括引物对和与其对应的探针，所述探针分别在5′端第1个碱基和第6个碱基进行荧光标记。本发明还涉及用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒。本发明提供的组合物应用于高危型人乳头瘤病毒16型及18型的检测，具有荧光信号强，灵敏度高的特点，满足了对高危型人乳头瘤病毒16型、18型感染早期人群的检测，避免了因病毒浓度较低的漏检。采用本发明所述的组合物制成的试剂盒具有较强抗干扰能力。

Description

用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物及试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒是一种嗜粘膜和皮肤上皮性病毒，是导致宫颈上皮增生和宫颈癌的主要因素，至今为止，已经鉴定的HPV病毒多达100余种，有30多种可以感染人的生殖道黏膜。宫颈癌的发生和人乳头瘤病毒(以下简称HPV)感染人体有密切的关系，世界卫生组织(WHO)的调查结果显示99.9％的宫颈癌患者可以检测到HPV感染；国际癌症研究协会(IARC)于1995年宣布：HPV感染是宫颈癌的主要原因。在目前发现的30多种可感染人生殖道黏膜的HPV中，一部分极易导致宫颈癌的发生，称为高危型HPV；WHO国际癌症研究中心按照致癌能力的大小将HPV各型别分为三类，其中确切致癌的HPV型别包括HPV16、18型。
目前，关于HPV感染的检测主要可分细胞学检测和HPV核酸检测。与细胞学检查相比，核酸检测具有敏感度高、对操作人员技术要求低、对HPV感染型别具体分型等特点。在中国，目前已有38家公司、75个HPV检测产品获得CFDA注册证，其中有46个产品使用荧光PCR法，11个产品使用PCR-反向点杂交法(包括基因芯片法)，6个产品使用杂交捕获法，剩下的产品使用的方法为：酶切信号放大法、支链DNA信号扩增法、恒温扩增荧光法、流式杂交法、表面等离子谐振法、半导体测序法等。现有的应用于高危型人乳头瘤病毒16型及18型的检测荧光信号弱，灵敏度不高。
发明内容
本发明提供一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物及试剂盒，应用于高危型人乳头瘤病毒16型及18型的检测，具有荧光信号强，灵敏度高的特点。
本发明的具体技术方案如下：
一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，该组合物包括引物对和与其对应的探针，所述探针分别在5′端第1个碱基和第6个碱基进行荧光标记。
优选的，所述探针采用如下(1)或(2)中的方法进行标记：
(1)在5′端第1个碱基用ROX标记，5′端第6个碱基上标记FAM；
(2)分别在5′端第1个碱基和第6个碱基标记HEX。
优选的，所述引物对和与其对应的探针用于扩增高危型人乳头瘤病毒的E1区。
优选的，所述探针包括HPV16型探针或/和HPV18型探针，HPV16型探针序列如SEQID NO.05所示：TGGTTTTATGTAGAGGCTGTAG，HPV18型探针序列如SEQ ID NO.06所示：TGTAATGTATACAACAATCAGGCAG。
优选的，所述引物对包括HPV16型引物对或/和HPV18型引物对，HPV16型引物对如SEQ ID NO.01所示：TACGGGATGTAATGG，SEQ ID NO.02所示：TCATTATCATTTACTATA；HPV18型引物对如SEQ ID NO.03所示：ACAGTAGTGATACTG，SEQ ID NO.04所示：TTCCTCCGCTTCCT。
一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，包括前面所述的组合物。
进一步的，所述试剂盒还包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品；所述缓冲液包括如下组分：118.42mM Tris-HCl、52.63mM KCl、6.58mM MgCl2、0.66mMdNTPs。
优选的，所述探针的浓度为0.04μM，引物对中每条引物的浓度为0.07～0.08μM。
本发明提供的组合物应用于高危型人乳头瘤病毒16型及18型的检测，具有荧光信号强，灵敏度高的特点，满足了对高危型人乳头瘤病毒16型、18型感染早期人群的检测，避免了因病毒浓度较低的漏检。采用本发明所述的组合物制成的试剂盒具有较强抗干扰能力。
附图说明
图1为本发明实施例2阳性对照品的测试结果图；
图2为本发明实施例2阴性对照品的测试结果图；
图3为本发明实施例5新型荧光标记方法的灵敏度测试结果图；
图4为本发明实施例5常规荧光标记方法的灵敏度测试结果图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明未提及部分均为现有技术。
本发明公开了一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，该组合物包括引物对和与其对应的探针，所述探针分别在5′端第1个碱基和第6个碱基进行荧光标记。
进一步的，所述探针采用如下(1)或(2)中的方法进行标记：
(1)在5′端第1个碱基用ROX标记，5′端第6个碱基上标记FAM；
(2)分别在5′端第1个碱基和第6个碱基标记HEX。
进一步的，所述引物对和与其对应的探针用于扩增高危型人乳头瘤病毒的E1区。
进一步的，所述探针包括HPV16型探针或/和HPV18型探针，HPV16型探针序列如SEQID NO.05所示：TGGTTTTATGTAGAGGCTGTAG，HPV18型探针序列如SEQ ID NO.06所示：TGTAATGTATACAACAATCAGGCAG。
进一步的，所述引物对包括HPV16型引物对或/和HPV18型引物对，HPV16型引物对如SEQ ID NO.01所示：TACGGGATGTAATGG，SEQ ID NO.02所示：TCATTATCATTTACTATA；HPV18型引物对如SEQ ID NO.03所示：ACAGTAGTGATACTG，SEQ ID NO.04所示：TTCCTCCGCTTCCT。
本发明提供的用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，该组合物包括的引物对和与其对应的探针优选有以下三种类型：(1)HPV16型探针和HPV16型引物对；(2)HPV18型探针和HPV18型引物对；(3)HPV16型探针和HPV16型引物对，HPV18型探针和HPV18型引物对。
本发明还公开了一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，包括前面所述的组合物。所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，还包括缓冲液、热启动DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品；所述缓冲液包括如下组分：118.42mM Tris-HCl、52.63mM KCl、6.58mM MgCl2、0.66mM dNTPs。
本发明公开的试剂盒可用于高危型HPV16、18型分型检测，所述高危型HPV16、18型分型检测试剂盒基于荧光定量PCR技术原理，根据人乳头瘤病毒基因的E1区为靶区域，设计HPV16、18亚型特异性引物和探针用于扩增对应的核酸片段，并分别以HEX、ROX荧光标记相应亚型。探针采用高特异性的TaqMan探针，可与对应的核酸片段进行结合，并在Taq酶外切酶活性作用下发生水解，产生荧光信号，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可得到实时扩增曲线。
所述扩增引物包括HPV16、18亚型对应的引物对序列，所述引物对序列包括SEQ IDNO.01至SEQ ID NO.04所示。
所述扩增探针包括HPV16、18亚型对应的探针序列，所述探针序列包括SEQ IDNO.05至SEQ ID NO.06所示。
在上述技术方案中，在探针5′端第1个碱基用HEX或ROX中的一种进行标记；其中，探针5′端第1个碱基用HEX标记时，其5′端第6个碱基用HEX进行标记；探针5′端第1个碱基用ROX标记时，其5′端第6个碱基用FAM进行标记。
在上述技术方案中，所述高危型HPV16、18型分型检测试剂盒适用的样本DNA，包括利用Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种提取的女性宫颈脱落细胞DNA。
本发明还公布了一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：将检测试剂盒的盒内试剂与样本DNA混合、装入PCR扩增管，然后置于荧光PCR仪器上进行PCR扩增，PCR扩增的扩增程序为95℃2分钟；95℃10秒钟60℃30秒钟，42个循环；最后4-16℃保持。
具体来说，首先针对上述HPV16、18型在其对应的E1区域中的高保守区设计特异性引物对和探针。引物对和探针设计采用Ologo7.0软件，每条引物Tm值接近60℃，扩增产物的长度范围为100-150bp，每条探针Tm值接近68℃，并对每对引物和探针进行扩增测试并优化，直至得到曲线平滑、信号值较高的扩增曲线。再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。
上述探针采用荧光染料标记的具体方法为：(1)在探针5′端第1个碱基用ROX标记，5′端第6个碱基上标记FAM。通过碱基位置，使得供体荧光分子(FAM)与受体荧光分子(ROX)靠近，产生FRET现象，从而使得ROX荧光效率提升8-10倍，而作为供体的荧光分子FAM并不影响ROX的发射波长。(2)对于标记HEX的探针，分别在探针5′端第1个碱基和第6个碱基同时标记HEX，这种双HEX荧光的标记方法与普通单HEX荧光的标记方法相比，效率可提高2-3倍。为了使整个体系背景荧光保持一致，需要使FRET的程度尽量接近一致，而第6位是荧光效率最高的位置，所以本发明所有中间荧光均选择标记在5′端第6位碱基，如表1所示，粗体和下划线标记的碱基分别为5′端第1和第6位荧光标记的碱基。
引物对序列、探针序列、荧光标记、其对应编号以及扩增系统中各条引物浓度如表1。
表1本发明的引物探针信息
注：加粗字体的为5′端荧光标记的碱基，下划线的为中间荧光标记的碱基，对应的荧光素为对应相同的加粗或下划线标记。
扩增采用聚合酶链式反应，反应可在一定的缓冲体系中进行，缓冲液组分为：118.42mM Tris-HCl、52.63mM KCl、6.58mM MgCl2、0.66mM dNTPs。反应所需的DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰，每个扩增体系(25μL)需要2.5U至5U的DNA聚合酶。本发明的扩增体系除了引物混合物、反应缓冲液和热启动DNA聚合酶之外，还包括阳性对照品和阴性对照品。
本发明提供的试剂盒以人β-globin基因设计的特异性引物和探针作为内标(IC)，通过检测内源性的β-globin基因来监测样本的扩增检测过程，避免假阴性结果。本发明的引物混合物除了检测HPV16、18型的引物对和探针外，还包括了一组检测人类基因组β-globin的引物对和探针，所述引物对序列(5′-3′)如SEQ ID NO.07所示：GCTTACATTTGCTTCTGACA、SEQ ID NO.08所示：AGTAACGGCAGACTTCTCC；探针序列(5′-3′)如SEQ ID NO.09所示：CY5-ACTAGCAACCTCAAACAGACACC-BHQ)。
本发明提供的试剂盒具有较大的退火温度范围，扩增体系在各种荧光PCR仪上(如：ABI7500、SLAN、Rocgene等)采用以下的扩增程序可以得到较好的结果。采用新型荧光标记方法，检测信号更强，扩增时间、循环相应比传统方法减少。相同引物，常规方法标记的探针用量更多。本发明的扩增程序：预变性95℃2分钟；95℃10秒钟60℃30秒钟，42个循环；最后4-16℃保持。
本发明中的模板DNA为女性宫颈脱落细胞DNA，通过各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法和Chelex100纯化等方法提取的DNA均可以得到较好的结果。本试剂盒具有较强抗干扰能力，样本中含以下浓度范围内的干扰物质不影响正常扩增。血红蛋白(≤200g/L)、白细胞(≤50/HPF)、粘蛋白(≤0.9mg/mL)、益康唑(≤100mg/mL)、壬苯醇醚栓(≤20mg/mL)、保妇康栓(≤1000mg/mL)、制霉菌素阴道泡腾片(≤1万IU/mL)和人体润滑剂(≤0.5g/mL)。
实施例1高危型HPV16、18型分型检测试剂盒的制备
1.高危型HPV16、18型分型检测体系专用引物对、探针
对HPV16、18型分别设计扩增引物对和探针，引物对探针序列、引物对探针浓度及荧光标记方式如表1所示。此外，本试剂盒选择人类基因组β-globin作为内标，其引物探针信息如下，所述引物对序列(5′-3′)如SEQ ID NO.07所示：GCTTACATTTGCTTCTGACA、SEQ IDNO.08所示：AGTAACGGCAGACTTCTCC；探针序列(5′-3′)如SEQ ID NO.09所示：：CY5-ACTAGCAACCTCAAACAGACACC-BHQ)。
2.高危型HPV16、18型分型检测体系的制备
试剂盒包含以下成分：
阳性对照品、阴性对照品所含质粒为对应检测靶区域截取的800bp的片段，浓度为20000copies/mL，购至生工生物工程(上海)股份有限公司。热启动DNA聚合酶购至南京诺唯赞生物科技有限公司。
下表为PCR Mix的组分：
每25μL的PCR扩增体系如下：
组分 加量(μL)
PCR Mix 19
Taq DNA聚合酶 1
DNA模板 5
实施例2高危型HPV16、18型分型检测试剂盒的应用
1.阳性对照品扩增
将20μL由实施例1制备的PCR Mix、Taq DNA聚合酶与5μL阳性对照品配制成混合液，混匀后短暂离心，将PCR反应液放置到荧光PCR仪(本次使用的机型为ABI7500)中进行PCR扩增。
PCR扩增程序：预变性95℃2分钟；95℃10秒钟60℃30秒钟，42个循环；最后4-16℃保持。
扩增结束后，用7500Software进行数据分析，其检测结果如图1所示，HPV16、HPV18及IC扩增曲线清晰，呈标准S型曲线，荧光本底无明显波动。
2.阴性对照品扩增
将20μL由实施例1制备的PCR Mix、Taq DNA聚合酶与5μL阴性对照品配制成混合液，混匀后短暂离心，将PCR反应液放置到荧光PCR仪(本次使用的机型为ABI7500)中进行PCR扩增。
PCR扩增程序：预变性95℃2分钟；95℃10秒钟60℃30秒钟，42个循环；最后4-16℃保持。
扩增结束后，用7500Software进行数据分析，其检测结果如图2所示，IC扩增曲线清晰，呈标准S型曲线，荧光本底无明显波动，无非特异扩增出现。
实施例3高危型HPV16、18型分型检测试剂盒的抗干扰能力评估
1.内源性干扰物质测试
选取不同浓度的血红蛋白、白细胞、粘蛋白进行内源性干扰物质测试，按照实施例2的加样配制PCR反应液，并按照PCR扩增程序扩增。每个浓度的内源性干扰物质中添入阳性对照品，重复测试20次，测试结果如表3所示，高危型HPV16、18型分型检测试剂盒对不高于200g/L的血红蛋白、不高于50/HPF的白细胞、不高于0.9mg/mL的粘蛋白均有较好的耐受能力
表3高危型HPV16、18型分型检测试剂盒的抗内源性干扰物质评估
2.外源性干扰物质测试
选取不同浓度的益康唑、壬苯醇醚栓、保妇康栓、制霉菌素阴道泡腾片、人体润滑剂进行外源性干扰物质测试，按照实施例2的加样配制PCR反应液，并按照PCR扩增程序扩增。每个浓度的外源性干扰物质中添入阳性对照品，重复测试20次，测试结果如表4所示，高危型HPV16、18型分型检测试剂盒对不高于100mg/mL的益康唑、不高于20mg/mL的壬苯醇醚栓、不高于1000mg/mL的保妇康栓、不高于1万IU/mL的制霉菌素阴道泡腾片、不高于0.5g/mL的人体润滑剂均有较好的耐受能力
表4高危型HPV16、18型分型检测试剂盒的抗外源性干扰物质评估
实施例4高危型HPV16、18型分型检测试剂盒与市售试剂盒比较
1.样本及市售试剂盒信息
150例HPV临床样本，由湖南省妇幼保健院和济南市第二妇幼保健院提供。通过使用核酸提取试剂盒(磁珠法)进行DNA的提取，提取试剂盒购至南京市基蛋生物科技股份有限公司。
市售试剂盒为人乳头瘤病毒(HPV)16型、18型核酸测定试剂盒(荧光PCR法)，国械注准20153400078，购至上海之江生物科技股份有限公司。
2.样本检测
按照实施例2的加样配制PCR反应液，并按照PCR扩增程序扩增。市售试剂盒根据其说明书操作。检测结果如表5所示，经过数据统计，本发明的试剂盒与市售的试剂盒相比，阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，总符合率为100％。
表5与市售试剂盒检测结果的阴阳性比较
实施例5本发明与常规标记方法扩增体系的灵敏度比较
选择HPV国家参考品进行灵敏度比较，参考品批号为370060-201901，购至中国食品药品检定研究院。HPV国家参考品通过梯度稀释获得以下浓度2000、1000、400、200copies/mL。按照实施例2的方法进行操作，每种浓度样本重复检测20次，本发明荧光标记方法(即新型荧光标记方法)与每条探针只标记一个荧光的常规荧光标记方法的灵敏度检测结果如下表6所示。
表6新型标记方法与常规标记方法的灵敏度比较结果
本发明荧光标记的灵敏度可达200copies/mL，扩增曲线如下图3所示。而常规荧光标记的灵敏度只能达到2000copies/mL，扩增曲线如下图4所示。
本发明荧光标记的试剂盒灵敏度高，明显高于市售的高危型HPV核酸检测试剂盒，具体数据参见表7所示。
表7.与市面上主流的高危型HPV核酸检测试剂盒灵敏度对比
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，其特征在于该组合物包括引物对和与其对应的探针，所述探针分别在5′端第1个碱基和第6个碱基进行荧光标记。
2.根据权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，其特征在于，所述探针采用如下(1)或(2)中的方法进行标记：
(1)在5′端第1个碱基用ROX标记，5′端第6个碱基上标记FAM；
(2)分别在5′端第1个碱基和第6个碱基标记HEX。
3.根据权利要求1所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，其特征在于，所述引物对和与其对应的探针用于扩增高危型人乳头瘤病毒的E1区。
4.根据权利要求1至3任一项所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，其特征在于，所述探针包括HPV16型探针或/和HPV18型探针，HPV16型探针序列如SEQ ID NO.05所示：TGGTTTTATGTAGAGGCTGTAG，HPV18型探针序列如SEQ ID NO.06所示：TGTAATGTATACAACAATCAGGCAG。
5.根据权利要求4所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的组合物，其特征在于，所述引物对包括HPV16型引物对或/和HPV18型引物对，HPV16型引物对如SEQ ID NO.01所示：TACGGGATGTAATGG，SEQ ID NO.02所示：TCATTATCATTTACTATA；HPV18型引物对如SEQ IDNO.03所示：ACAGTAGTGATACTG，SEQ ID NO.04所示：TTCCTCCGCTTCCT。
6.一种用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至5任一项所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、阳性对照品和阴性对照品；所述缓冲液包括如下组分：118.42mMTris-HCl、52.63mM KCl、6.58mM MgCl2、0.66mM dNTPs。
8.根据权利要求6或7所述的用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针的浓度为0.04μM，引物对中每条引物的浓度为0.07～0.08μM。
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