RU2808238C1 - Способ, композиция и набор для флуоресцентной количественной пцр и их применение - Google Patents
Способ, композиция и набор для флуоресцентной количественной пцр и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808238C1 RU2808238C1 RU2022130380A RU2022130380A RU2808238C1 RU 2808238 C1 RU2808238 C1 RU 2808238C1 RU 2022130380 A RU2022130380 A RU 2022130380A RU 2022130380 A RU2022130380 A RU 2022130380A RU 2808238 C1 RU2808238 C1 RU 2808238C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pcr
- fluorescent
- amplification
- quenching
- quenching group
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 91
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims abstract description 77
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims abstract description 61
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 42
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 31
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000013589 supplement Substances 0.000 abstract 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 67
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 67
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 53
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 35
- 238000013461 design Methods 0.000 description 25
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 6
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 5-carboxytetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C([O-])=O YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LIFHMKCDDVTICL-UHFFFAOYSA-N 6-(chloromethyl)phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C(CCl)=NC3=CC=CC=C3C2=C1 LIFHMKCDDVTICL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- AFWTZXXDGQBIKW-UHFFFAOYSA-N C14 surfactin Natural products CCCCCCCCCCCC1CC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)O1 AFWTZXXDGQBIKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241001451790 Korana Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000010460 detection of virus Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- -1 nucleic acid acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000004915 pus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- NJGWOFRZMQRKHT-UHFFFAOYSA-N surfactin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC1CC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)O1 NJGWOFRZMQRKHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJGWOFRZMQRKHT-WGVNQGGSSA-N surfactin C Chemical compound CC(C)CCCCCCCCC[C@@H]1CC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O1 NJGWOFRZMQRKHT-WGVNQGGSSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ флуоресцентной количественной ПЦР. Смешивают пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда и реагента для ПЦР амплификации. Проводят флуоресцентную количественную ПЦР. При этом флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы. В смесь вносят дополнительную добавку, и дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина. Раскрыт способ одноэтапной флуоресцентной количественной ПЦР. Смешивают агент для высвобождения образца, дополнительную добавку, пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда, реагент для ПЦР амплификациии и образец. Проводят флуоресцентную количественную ПЦР. При этом флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы. Способ не включает этапов очистки и/или экстракции нуклеиновой кислоты. Дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина. Представлена композиция для флуоресцентной количественной ПЦР, содержащая пару из прямого и обратного праймеров, флуоресцентный зонд и реагент для ПЦР амплификации, где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы, где композиция содержит дополнительную добавку, представляющую собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина. Также представлен набор для флуоресцентной количественной ПЦР, содержащий указанную композицию. Изобретение позволяет улучшить чувствительность ПЦР и уменьшить количество ложноотрицательных результатов. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 12 табл., 5 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области молекулярно-биологической детекции, и в частности, к области флуоресцентной количественной ПЦР-детекции.
Предшествующий уровень техники
Технология полимеразной цепной реакции нуклеиновых кислот (ПЦР) представляет собой технологию молекулярной биологии, используемую для амплификации определенных фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК/РНК), так что количество фрагментов гена увеличивается в десятки тысяч раз. Ее основной принцип заключается в том, что праймер с флуоресцентным зондом связывается и гибридизуется с комплементарной последовательностью в одноцепочечной ДНК-матрице с образованием частичной двойной цепи, а синтез ДНК осуществляется под действием ДНК-полимеразы. Связывание праймера c флуоресцентным зондом с одноцепочечной ДНК-матрицей основано на принципе спаривания оснований: спаривание оснований следует принципу спаривания оснований Уотсона-Крика G (гуанин): C (цитозин), A (аденин): T (тимин)/U (урацил). ПЦР широко используется в медицинской диагностике, научных исследованиях, биоинженерии, сельском хозяйстве и других дисциплинах. Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР) — это метод измерения общего количества продуктов после каждого цикла ПЦР с использованием флуоресцентных химических веществ в реакциях амплификации нуклеиновых кислот. Это также метод количественного анализа определенной последовательности ДНК в образце, подлежащем тестированию, с помощью внутреннего или внешнего эталонного метода. Для количественной ПЦР детекцию в реальном времени выполняют в процессе ПЦР посредством флуоресцентных сигналов во время процесса ПЦР амплификации. Поскольку существует линейная зависимость между значением Ct матрицы и исходным числом копий матрицы в экспоненциальном периоде ПЦР-амплификации, оно становится основой для количественного определения. Флуоресцентные индикаторы для кПЦР детекции в основном делятся на две категории: одна - это флуоресцентные зонды, такие как зонды Taqman и зонды молекулярных маяков; а вторая - это флуоресцентные красители, которые могут связываться с двухцепочечной ДНК, такие как SYBR Green и Eva Green.
Еще в 1970-х годах ученый Korana выдвинул идею амплификации нуклеиновых кислот in vitro. В 1983 году американский ученый Kery Mullis вдохновился идеей амплификации нуклеиновых кислот in vitro, когда он изучал методы секвенирования нуклеиновых кислот: использование пробирок для имитации естественного процесса репликации ДНК in vivo. При обеспечении ряда подходящих условий, включая ДНК-матрицу, праймеры с флуоресцентным зондом, ДНК-полимеразу, подходящую буферную систему, температуру и время для денатурации, восстановления и удлинения ДНК, молекула ДНК с известными последовательностями на обоих концах может быть амплифицирована в геометрической прогрессии. Такая технология амплификации ДНК in vitro претерпела ряд последующих оптимизаций и улучшений и была успешно применена в первом в мире патенте на изобретение по ПЦР, патенте США 4683202, в 1987 году.
С тех пор, с использованием и продвижением технологии ПЦР в клинических и научных исследованиях, последующие патенты продолжали обогащать и оптимизировать детали технологии ПЦР. В 1992 году Higuchi et al. впервые предложили использовать метод динамической ПЦР и метод закрытого сбора флуоресценции для детекции и анализа количества генов-мишеней, то есть технологию количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени. Флуоресцентный количественный ПЦР-анализ в реальном времени можно использовать для количественного анализа путем определения количества амплифицированных продуктов (интенсивности флуоресценции меченого продукта), которое напрямую связано с количеством исходного гена-мишени. Значение номера цикла Ct (порогового цикла), при котором повышенный сигнал флуоресценции амплифицированного продукта достигает логарифмической фазы, имеет отрицательную линейную зависимость от логарифма исходного числа копий матрицы, то есть количество циклов амплификации, необходимое для удвоения начального разведения матрицы для достижения той же логарифмической фазы интенсивности флуоресценции увеличивается на один цикл (Ct). Повышенный сигнал амплифицированного продукта можно отображать с помощью флуоресцентного красителя ДНК продукта, такого как Sybr Green I, или выявлять с помощью флуоресцентного зонда с гасящей группой, такого как зонд Taqman. Зонды с группами гашения флуоресценции включают флуоресцентно-меченые зонды, гидролизованные ферментом Taq в технологии кПЦР, и зонды MGB, повышающие эффективность связывания на основе гидролизованных флуоресцентных зондов. Разнообразные типы зондов последовательной гибридизации, такие как гибридизационные зонды со структурой стебель-петля, зонды с двумя гибридизациями (FRET) и другие новые зонды, имеют сходные применения, но все они имеют большие ограничения в области применения, и чувствительность этих зондов все еще необходимо повысить.
Кроме того, при использовании клинических тестов часто возникают ложноотрицательные результаты из-за низкой чувствительности метода детекции. В частности, ген ORF1ab SARS-CoV-2 легко пропустить из-за низкой чувствительности метода детекции вследствие низкого уровня его экспрессии.
Поэтому в данной области техники существует потребность в способе и продукте, которые позволяют улучшить чувствительность ПЦР и уменьшить количество ложноотрицательных результатов.
Изложение сущности изобретения
Ввиду вышеизложенного, в первом аспекте настоящее изобретение предлагает способ флуоресцентной количественной ПЦР, включающий:
1) смешивание пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда и реагента для ПЦР амплификации; и
2) проведение флуоресцентной количественной ПЦР,
где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, в которых первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и отстоит от первой гасящей группы на 10-15 нуклеотидов.
С помощью метода флуоресцентной количественной ПЦР по настоящему изобретению фоновые сигналы в флуоресцентной количественной ПЦР могут быть уменьшены, и, кроме того, может быть улучшена чувствительность ПЦР, может быть уменьшено количество ложноотрицательных результатов при детекции, а также может быть улучшена эффективность амплификации флуоресцентной количественной ПЦР.
Без ограничения какой-либо теорией, отметим, что одна гасящая группа не полностью гасит флуоресценцию флуорофора, что приводит к более высокому фоновому сигналу. Использование флуоресцентного зонда по настоящему изобретению, имеющего две гасящих группы, как определено выше, дополнительно успешно снижает фоновые сигналы, не влияя на ход реакции, тем самым повышая чувствительность ПЦР и увеличивая эффективность ПЦР амплификации.
В предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает смешивание дополнительной добавки, а дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, додецилсульфата натрия и антибиотика Проклина.
Дополнительная добавка по настоящему изобретению может дополнительно взаимодействовать с флуоресцентным зондом, имеющим две гасящих группы, так что чувствительность дополнительно улучшается, а результат детекции становится более точным.
В некоторых конкретных вариантах осуществления дополнительная добавка, используемая в настоящем изобретении, имеет значение рН от 7,0 до 8,8, и более предпочтительно реагент для ПЦР амплификации, используемый в настоящем изобретении, имеет значение рН 7,5.
В конкретном варианте осуществления дополнительная добавка представляет собой формамид, ДСН и Проклин 300, которые имеют конечную концентрацию от 0,01% до 0,05% (об./об.) после добавления к реакционному раствору ПЦР.
Кроме того, флуоресцентный зонд имеет длину 18-35 п.н. и более предпочтительно флуоресцентный зонд имеет длину 22-28 п.н.
Кроме того, флуоресцентный зонд имеет значение Tm 55-70°С, и более предпочтительно флуоресцентный зонд имеет значение Tm 65-70°С.
Кроме того, второй флуоресцентный зонд имеет содержание GC, не превышающее 60%.
Гасящие группы могут быть выбраны из BHQ1, BHQ2 и MGB, но не ограничиваются ими.
В конкретном варианте осуществления первая гасящая группа и вторая гасящая группа представляют собой одну и ту же гасящую группу. Как первую, так и вторую гасящую группы можно пометить с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.
Флуоресцентный зонд также имеет флуоресцентную группу, и флуоресцентная группа может быть выбрана из FAM, HEX, ROX, VIC, CY5, 5-TAMRA, TET, CY3 и JOE, но не ограничивается ими.
«Количественная флуоресцентная ПЦР», упомянутая в настоящем изобретении, представляет собой способ измерения общего количества продуктов после каждого цикла полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием флуоресцентных химических веществ в реакциях амплификации нуклеиновых кислот. Это также метод количественного анализа конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в подлежащем тестированию образце с помощью внутреннего или внешнего эталонного метода.
«Реагент для ПЦР амплификации», упомянутый в настоящем изобретении, относится к реагенту, используемому для детекции флуоресцентной количественной амплификации нуклеиновых кислот в реальном времени. Специалистам в данной области техники понятно, что реагент для амплификации кПЦР обычно содержит ДНК-полимеразу, дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфат), буфер для ПЦР, и т.д. Например, когда объектом детекции является РНК, реагент может дополнительно включать обратную транскриптазу. Нетрудно понять, что специалисты в данной области техники могут определить состав и концентрацию реагента для ПЦР амплификации в соответствии с конкретными потребностями (такими как тип и содержание образцов).
Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ одноэтапной количественной флуоресцентной ПЦР, включающий:
1) смешивание высвобождающего образец агента, пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда, реагента для ПЦР амплификации, и образца; и
2) проведение флуоресцентной количественной ПЦР,
где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, в которых первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и отстоит от первой гасящей группы на 10-15 нуклеотидов; и
способ не включает этапов очистки и/или экстракции нуклеиновой кислоты.
«Высвобождающий образец агент», упомянутый в настоящем изобретении, относится к химическому реагенту, который может высвобождать нуклеиновую кислоту в образце и может использоваться для ПЦР без необходимости очистки и/или экстракции нуклеиновой кислоты, такой как сильнокислотный или основной химический реагент. Пример высвобождающего образец агента может включать один или несколько из 0,01-0,5 ммоль/л сурфактина, 100-200 ммоль/л калия хлорида, 50-200 ммоль/л лития хлорида, триэтаноламина лаурилсульфата, имеющего отношение массы к объему от 0,1% до 1%, Nonidet P-40 (NP-40) с объемным отношением от 0,1% до 1%, натрия додецилсульфоната с отношением массы к объему от 0,01% до 2%, этанола с объемным отношением 0,05-1%, и другие компоненты. Однако настоящее изобретение не ограничивается этим.
«Одноэтапный способ», упомянутый в настоящем изобретении, относится к технологии высвобождения и амплификации нуклеиновых кислот без экстракции (EFNART). Технология относится к прямой детекции амплификации нуклеиновой кислоты в образце непосредственно с помощью высвобождающего нуклеиновую кислоту агента с сильными щелочными свойствами и высоко совместимой системы амплификации без необходимости экстракции нуклеиновой кислоты или очистки образца.
Использование способа по настоящему изобретению позволяет улучшить чувствительность «одноэтапного метода», устранить недостатки низкой чувствительности и неточных результатов детекции «одноэтапного метода» и избежать возникновения ложноотрицательных результатов. Кроме того, использование одноэтапного метода также экономит время, завершает детекцию нуклеиновой кислоты за очень короткое время и повышает эффективность детекции (например, предоставление пациентам точных результатов диагностики и планов лечения как можно раньше, а также играет ключевую роль в предотвращении распространения основных инфекционных заболеваний).
«Образец», упомянутый в настоящем изобретении, относится к веществу, содержащему подлежащую тестированию нуклеиновую кислоту. Образец может включать, помимо прочего, животные и растительные клетки, бактерии, вирусы, грибы и т.д., а также жидкости организма, ткани, органы и т.д., содержащие их.
В частности, образцы, упомянутые в настоящем изобретении, представляют собой слизь, мокроту, гной и мочу и т.д., и поскольку такие образцы необходимо сохранять в консервирующем растворе, содержащем некоторые мешающие вещества, такие как антибиотики и поверхностно-активные вещества, чувствительность обычно низкая, когда используется метод детекции без экстракции нуклеиновых кислот.
В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию для флуоресцентной количественной ПЦР, включающую пару из прямого и обратного праймеров, флуоресцентный зонд и реагент для ПЦР-амплификации;
при этом флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, в которых первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и отстоит от первой гасящей группы на 10-15 нуклеотидов.
Кроме того, композиция также включает дополнительную добавку, и дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, додецилсульфата натрия и антибиотиков Проклина.
В некоторых конкретных вариантах осуществления дополнительная добавка, используемая в композиции, имеет значение рН от 7,5 до 8,8, и более предпочтительно реагент для ПЦР амплификации, используемый в настоящем изобретении, имеет значение рН 8,5.
В конкретном варианте осуществления дополнительная добавка представляет собой ДСН и Проклин 300, которые имеют конечную концентрацию от 0,01% до 0,05% (об./об.) после добавления к реакционному раствору ПЦР.
Кроме того, флуоресцентный зонд имеет длину 18-35 п.н., и более предпочтительно флуоресцентный зонд имеет длину 22-28 п.н.
Кроме того, флуоресцентный зонд имеет значение Tm 55-70°С и, более предпочтительно, флуоресцентный зонд имеет значение Tm 55-70°С.
Кроме того, флуоресцентный зонд имеет содержание GC не более 60%.
Гасящие группы могут быть выбраны из BHQ1, BHQ2 и MGB, но не ограничиваются ими.
В конкретном варианте осуществления первая гасящая группа и вторая гасящая группа представляют собой одну и ту же гасящую группу.
Флуоресцентный зонд также имеет флуоресцентную группу, и флуоресцентная группа может быть выбрана из FAM, HEX, ROX, VIC, CY5, 5-TAMRA, TET, CY3 и JOE, но не ограничивается ими.
В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение вышеупомянутой композиции для приготовления набора для флуоресцентной количественной ПЦР.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает использование вышеупомянутой композиции для приготовления набора для одноэтапной количественной флуоресцентной ПЦР.
В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор для флуоресцентной количественной ПЦР, включающий указанную выше композицию.
Краткое описание чертежей
Фигуры 1-6 показывают результаты детекции SARS-CoV-2 композицией по настоящему изобретению и композицией из сравнительных примеров.
Подробное описание изобретения
Далее настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления и примеры, и из них можно более ясно представить преимущества и различные эффекты настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что эти конкретные варианты осуществления и примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, а не для его ограничения.
Пример 1. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящих группы по настоящему изобретению, улучшает чувствительность ПЦР.
Чтобы оценить применение способа конструирования зонда с двойным гашением в настоящем изобретении, исследовали его влияние на ПЦР. Метод двойного гашения с зондом по настоящему изобретению сравнивали с зондом, имеющим одну гасящую группу в реагенте для ПЦР амплификации. Исходя из того, что последовательности праймеров и компоненты амплификации не изменялись, была исследована детекция нуклеиновых кислот в слабоположительных образцах с использованием различных конструкций зондов в одной и той же системе ПЦР амплификации. Метод сравнения заключался в использовании клинически диагностированного положительного образца с низкой концентрацией респираторно-синцитиального вируса (RSV) для детекции, и один и тот же образец был подвергнут анализу 10 раз для проверки эффективности положительной детекции образца. Конкретные компоненты каждой группы показаны в Таблице 1.
Таблица 1. Специфические компоненты различных схем конструкции зонда
| Схема амплификации 1 из настоящего изобретения | Схема амплификации 2 из настоящего изобретения | Контрольная схема амплификации | |
| Последовательность прямого праймера | GCAAATATGGAAACATACGTGAACA | ||
| Последовательность обратного праймера | RGATGAYTGGAACATRGGCACC | ||
| Последовательность зонда Taqman | 5'-FAM-CAGCWGCTGTGTAT(T- BHQ1)GTGGAGCCYTCG TGA-3'-BHQ1 |
5'-FAM-CAGCWGCTGTGT ATGT(T- BHQ1)GGAGCCY TCGTGA-3'- BHQ1 |
5'-FAM-CAGCWGCTGTGTA TGTGGAGCCYTCG TGA-3'-BHQ1 |
| Доза прямого праймера | 10 пмоль | ||
| Доза обратного праймера | 10 пмоль | ||
| Доза зонда | 5 пмоль | ||
| Mg2+ | 2 пмоль | ||
| дНТФ | 2 пмоль | ||
| Смесь ферментов | 4 мкл | ||
| ПЦР буфер | 24,65 мкл | ||
| Доза образца | 20 мкл | ||
| Общий объем реакции | 50 мкл | ||
В упомянутых выше сравнительных экспериментах исследовали конструкцию зонда с двойным гашением, особенно сравнивали конструкции в различных положениях основания и зонда, имеющего одну гасящую группу. Результаты испытаний показывают (Таблица 2), что конструкции зондов схемы амплификации 1 и схемы амплификации 2 по настоящему изобретению могут значительно повысить эффективность детекции образцов с низкой концентрацией RSV по сравнению с традиционной сравнительной схемой амплификации без двойного гашения. Однако при сравнении способов амплификации 1 и 2 по настоящему изобретению, несмотря на то, что вторая гасящая группа сконструирована на другой основе, почти нет разницы во влиянии на эффективность детекции амплификации, и нет существенной разницы в эффективности детекции из 10 образцов. Экспериментальные результаты этой группы показывают, что при размещении двух гасящих групп на одном и том же зонде размещение в разных положениях не имеют существенной разницы в эффективности детекции.
Таблица 2. Сравнительные результаты амплификации различных процедур амплификации для 10 образцов нуклеиновых кислот с низкой концентрацией
| Схема амплификации 1 из настоящего изобретения | 35,14 | 35,65 | 34,98 | 36,02 | 36,54 | 3579 | 35,15 | 36,74 | 36,54 | 35,27 |
| Схема амплификации 2 из настоящего изобретения | 35,15 | 35,31 | 35,69 | 36,46 | 36,93 | 35,82 | 35,25 | 36,47 | 36,75 | 35,46 |
| Схема амплификации контроля | 38,84 | 38,18 | 38,12 | Нет Ct | Нет Ct | 37,89 | 37,95 | 38,86 | Нет Ct | 39,12 |
Пример 2. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящие группы и дополнительные добавки по настоящему изобретению, улучшает чувствительность ПЦР
Для оценки применения зонда двойного гашения и его компонентов реагента для ПЦР амплификации (0,02% формамида (об./об.), 0,03% ДСН (масс./об.) и 0,01% Проклина 300 (об./об.)) согласно настоящему изобретению тот же принцип конструкции зонда использовали для сравнения и модификации конструкции флуоресцентного зонда для респираторно-синцитиального вируса (RSV), и исходя из того, что последовательность оснований зонда оставалась неизменной, детекцию нуклеиновой кислоты в слабоположительных образцах в той же самой системе ПЦР амплификации выполняли с использованием схемы двойной группы гашения по настоящему изобретению и стандартной конструкции зонда (специфическая последовательность зонда для 5'-FAM-3'-BHQ1). Метод сравнения представлял собой пошаговое градиентное разведение клинически диагностированного положительного образца RSV: 10-кратное разведение (1:9, об./об.), 100-кратное разведение (1:99, об./об.), 1000-кратное разведение (1:999, об./об.) и 10000-кратное разведение (1:9999, об./об.). Метод детекции представлял собой метод детекции прямой амплификации образца без экстракции нуклеиновой кислоты. Принятый метод представлял собой прямую амплификацию образца в системе образец: агент для разделения образца: реакционный раствор для количественной ПЦР = 10:10:30 (об./об./об.) с общим объемом 50 мкл. Процедура амплификации показана в Таблице 3. Конкретные компоненты каждой группы показаны в Таблице 4.
Таблица 3. Процедура детекции амплификации нуклеиновой кислоты, принятая в настоящем изобретении.
| Этап | Температура | Время | Номер циклов |
| Обратная транскрипция | 50 °С | 30 мин | 1 |
| Пре-денатурация | 95 °С | 1 мин | 1 |
| Денатурация | 95 °С | 15 сек | 40-45 |
| Отжиг, удлинение и сбор данных флуоресценции | 60 °С | 30 сек |
Таблица 4. Специфические компоненты различных схем конструкции зонда
Результаты сравнения в Таблице 5 показывают, что для дополнительных компонентов в системе ПЦР амплификации по настоящему изобретению чувствительность амплификации образца RSV без экстракции значительно улучшается. Исходя из того, что последовательность праймера для зонда и основные компоненты системы ПЦР амплификации остаются неизменными, оптимизация схемы модификации гашения зонда значительно улучшает способность детекции нуклеиновых кислот.
Таблица 5. Схема сравнения чувствительности детекции, основанная на градиентном разбавлении образца.
| Схема конструкции с зондом из настоящего изобретения | Схема конструкции обычного флуоресцентного зонда | |
| Значение Ct детекции образца RSV | Значение Ct детекции образца RSV | |
| 10-кратное разведение образца | 29,64 | 31,89 |
| 100-кратное разведение образца | 32,89 | 35,32 |
| 1,000-кратное разведение образца | 36,07 | 38,03 |
| 10,000-кратное разведение образца | 39,46 | Нет Ct |
Пример 3. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящие группы и дополнительные добавки по настоящему изобретению, улучшает чувствительность ПЦР
Чтобы оценить схему конструкции праймера-зонда и применение дополнительных компонентов (формамида, ДСН и Проклина 300) в настоящем изобретении, был проведен сравнительный анализ реакции с праймером-зондом и добавкой для ПЦР по настоящему изобретению и обычной 3'-концевой одиночной гасящей группой (BHQ1) без схемы праймера-зонда по настоящему изобретению. Метод сравнения заключался в использовании трех образцов нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 (образец 01, образец 02 и образец 03), которые были клинически диагностированы как положительные, для проведения сравнительного теста в виде 45 мкл раствора реакции ПЦР + 5 мкл образца нуклеиновой кислоты. Процедура обнаружения флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени показана в Таблице 3. Конкретные компоненты каждой группы показаны в Таблице 6.
Таблица 6. Конкретные компоненты различных схем конструкции зонда
Из результатов сравнения амплификации на Фигурах 1-6 и в Таблице 7, исходя из той же дозы матрицы нуклеиновой кислоты и дозировки праймера и зонда, только из-за изменения режима мечения зонда и необходимых дополнительных компонентов, между ними значительно улучшается эффективность амплификации, особенно гена ORF 1ab на основе FAM канала. Таким образом, способ модификации зонда по настоящему изобретению имеет очевидные преимущества в улучшении чувствительности детекции реагентов на основе нуклеиновых кислот.
Таблица 7. Сравнение результатов эффектов амплификации схемы настоящего изобретения и контрольной схемы на трех образцах нуклеиновых кислот
Результаты сравнения в Таблице 7 показывают, что при модификации зонда и дополнительных компонентов в настоящем изобретении чувствительность ПЦР значительно повышается. Детектирующая способность набора отрицательно коррелирует со значением порогового цикла (Ct), то есть при одной и той же концентрации чем меньше значение Ct, тем выше детекционная способность; чем больше значение Ct, тем ниже детекционная способность; а «Нет Ct» означает отсутствие амплификации. Модификация зонда и добавки в настоящем изобретении позволяют значительно улучшить способность к детекции нуклеиновых кислот, но для разных образцов существуют различия между образцами в эффекте улучшения от ПЦР-добавок.
Пример 4. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящие группы, и дополнительные добавки по настоящему изобретению улучшают чувствительность одноэтапной ПЦР.
В процессе диспансеризации респираторные образцы являются высоко инфекционными, например, SARS-CoV-2, SARS, коронавирус MERS и др., а также распространенные вирусы гриппа А и В, все из которых являются высоко патогенными. Таким образом, завершение детекции вируса в очень короткие сроки позволяет предоставить пациентам результаты диагностики и планы лечения как можно раньше. Схема зонда с двойным гашением и соответствующих дополнительных компонентов ПЦР амплификации в настоящем изобретении также может быть использована в применении для быстрой детекции образцов. Основные особенности процедуры включают два основных аспекта: оба представляют собой прямую амплификацию образцов без обработки нуклеиновой кислоты и, соответственно: (1) учитывая отсутствие выделения и очистки нуклеиновой кислоты, прямую инактивацию собранных образцов с использованием агента для высвобождения образца с функцией инактивации, и высвобождение нуклеиновой кислоты в вирусе, а также использование соответствующих компонентов реагента для ПЦР амплификации для прямой детекции амплификации; и (2) применение процедуры обратной транскрипции и процедуры ПЦР амплификации за очень короткое время для завершения детекции вируса и получения результата детекции в течение 15-35 минут. Способ детекции представлял собой способ детекции прямой амплификации без экстракции нуклеиновой кислоты из образца. Принятый способ представлял собой прямую амплификацию образца в системе образец: агент для разделения образца: реакционный раствор для количественной ПЦР = 10:10:30 (об./об./об.) с общим объемом 50 мкл. Чтобы сравнить эффекты детекции при быстрой детекции и обычной детекции, в этой экспериментальной схеме были использованы условия реакции по настоящему изобретению при процедуре быстрой амплификации и обычной процедуре амплификации, а также схема конструкции обычного зонда при обычной процедуре амплификации для сравнения эффективности детекции образцов нуклеиновой кислоты с низкой концентрацией и отрицательных образцов SARS-CoV-2.
Таблица 8. Одноэтапная ПЦР и обычная ПЦР в схеме настоящего изобретения
Таблица 9. Результаты сравнения амплификации различных процедур амплификации для 10 образцов с низкой концентрацией нуклеиновой кислоты
| Схема из настоящего изобретения, обычная амплификация | 32,42 | 32,46 | 32,59 | 31,76 | 32,77 | 32,92 | 31,83 | 32,74 | 32,09 | 32,40 |
| Схема из настоящего изобретения, быстрая амплификация | 33,15 | 32,84 | 32,16 | 32,56 | 32,98 | 33,23 | 33,75 | 32,47 | 32,95 | 32,63 |
| Контрольная схема, обычная амплификация | 35,84 | 36,18 | 36,28 | 35,98 | 36,32 | 35,45 | 36,74 | 36,12 | 36,29 | 36,83 |
| Контрольная схема, быстрая амплификация | 38,84 | 39,18 | Нет Ct |
Нет Ct |
Нет Ct |
Нет Ct |
38,74 | 39,42 | Нет Ct | Нет Ct |
Как видно из результатов детекции 10 образцов с низкой концентрацией, все образцы с низкой концентрацией были выявлены с использованием схемы из настоящего изобретения. Кроме того, результат детекции, полученный с использованием раствора для быстрой амплификации, не отличался от результата, полученного при использовании обычной процедуры амплификации. Таким образом, экспериментальные результаты доказывают, что схема детекции амплификации, основанная на конструкции зонда с двойным гашением, может использоваться как в обычной процедуре амплификации кПЦР, так и в быстрой процедуре амплификации кПЦР, и нет существенной разницы между двумя разными процедурами амплификации. Схему по настоящему изобретению можно использовать для быстрой детекции вирусов. В контрольной схеме были приняты традиционная конструкция зонда и состав реакции без двойной гасящей группы по настоящему изобретению, и в обычной процедуре амплификации были выявлены все 10 образцов, но значения Ct амплификации были уменьшены. Однако в процедуре быстрой амплификации только четыре из 10 образцов были обнаружены как положительные, поэтому способность к детекции была явно низкой. Следовательно, результаты сравнения показывают, что схему настоящего изобретения можно использовать для экспресс-диагностики нуклеиновых кислот РНК-вирусов.
Пример 5. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящие группы и дополнительные добавки по настоящему изобретению, улучшают чувствительность ПЦР
Чтобы оценить применение зонда двойного гашения и его реагирующих компонентов для ПЦР амплификации (формамида, ДСН и Проклина 300) в настоящем изобретении, тот же принцип конструкции зонда использовали для сравнения и модификации конструкции флуоресцентного зонда для респираторного аденовируса (ADV), и исходя из того, что последовательность оснований зонда осталась неизменной, определение нуклеиновой кислоты в слабоположительных образцах в одной и той же системе ПЦР амплификации проводили путем сравнения схем амплификации из схемы с двойной гасящей группой по настоящему изобретению и контрольной схемы.
Конструкции четырех схем (как показано в Таблице 11):
- схема из настоящего изобретения: реагент для амплификации, содержащий флуоресцентный зонд двойного гашения и дополнительные компоненты;
- контрольная схема 1: обычный реагент для амплификации, содержащий только флуоресцентный зонд с двойным гашением;
- контрольная схема 2: реагент для амплификации, содержащий флуоресцентный зонд с одинарным гашением и добавку;
- контрольная схема 3: обычный реагент для амплификации, содержащий только флуоресцентный зонд с одинарным гашением.
Способ сравнения представлял собой пошаговое градиентное разведение клинически диагностированного положительного образца ADV: 10-кратное разведение (1:9, об./об.), 100-кратное разведение (1:99, об./об.) и 1000-кратное разведение (1:999, об./об.). Метод детекции представлял собой метод детекции прямой амплификации без экстракции нуклеиновой кислоты для образца. Принятый метод представлял собой прямую амплификацию образца в схеме образец: агент для разделения образца: реакционный раствор для количественной ПЦР = 10:10:30 (об./об./об.) с общим объемом 50 мкл. Процедура амплификации показана в Таблице 10.
Таблица 10. Процедура детекции амплификации нуклеиновой кислоты, принятая в настоящем изобретении.
Таблица 11. Специфические компоненты различных схем конструкции зонда
Результаты сравнения в Таблице 12 показывают, что наблюдается значительное улучшение чувствительности амплификации образца ADV без экстракции, а эффективность амплификации по настоящему изобретению является наилучшей и явно превосходит схемы, основанные на обычной конструкции флуоресцентного зонда и обычных компонентах реагентов для ПЦР амплификации.
Кроме того, результаты сравнения в Таблице 12 также доказывают, что оптимизационный эффект добавок на две гасящие группы значительно лучше, чем на одну гасящую группу. В системе двойного гашения увеличение значения Ct добавкой больше 1 (при разнице на порядок, разница в 1 в значении Ct эквивалентна разнице в однократное количество матрицы), а в системе с одной гасящей группой увеличение значения Ct за счет добавки составляет менее 0,5 (фактически эквивалентно отсутствию увеличения).
Таблица 12. Сравнение чувствительности раствора для детекции на основе градиентного разбавления образца.
Claims (15)
1. Способ флуоресцентной количественной ПЦР, включающий:
1) смешивание пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда и реагента для ПЦР амплификации; и
2) проведение флуоресцентной количественной ПЦР;
где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы, также в смесь на стадии (1) вносят дополнительную добавку, и дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина.
2. Способ по п.1, где дополнительной добавкой является формамид, ДСН и Проклин 300, которые имеют конечную концентрацию от 0,01 до 0,05% (об./об.) после добавления к реакционному раствору ПЦР.
3. Способ одноэтапной флуоресцентной количественной ПЦР, включающий:
1) смешивание агента для высвобождения образца, дополнительной добавки, пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда, реагента для ПЦР амплификациии и образца; и
2) проведение флуоресцентной количественной ПЦР,
при этом флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы; и
где способ не включает этапов очистки и/или экстракции нуклеиновой кислоты, и
где дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина.
4. Композиция для флуоресцентной количественной ПЦР, содержащая пару из прямого и обратного праймеров, флуоресцентный зонд и реагент для ПЦР амплификации,
где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы, где композиция содержит дополнительную добавку, представляющую собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина.
5. Композиция по п.4, в которой дополнительной добавкой является формамид, ДСН и Проклин 300, которые имеют конечную концентрацию от 0,01 до 0,05% (об./об.) после добавления к реакционному раствору ПЦР.
6. Набор для флуоресцентной количественной ПЦР, содержащий композицию по любому из пп.4, 5.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010649826.6 | 2020-07-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2808238C1 true RU2808238C1 (ru) | 2023-11-28 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2508407C9 (ru) * | 2012-10-10 | 2014-05-20 | Елена Андреевна Чирясова | Способ количественной оценки терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека с помощью полимеразной цепной реакции и дуплекс-специфического анализа, наборы синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов для осуществления этого способа |
| CN107236815A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-10-10 | 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 | 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法 |
| RU2725862C1 (ru) * | 2019-09-03 | 2020-07-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2508407C9 (ru) * | 2012-10-10 | 2014-05-20 | Елена Андреевна Чирясова | Способ количественной оценки терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека с помощью полимеразной цепной реакции и дуплекс-специфического анализа, наборы синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов для осуществления этого способа |
| CN107236815A (zh) * | 2017-07-18 | 2017-10-10 | 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 | 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法 |
| CN108300772A (zh) * | 2017-07-18 | 2018-07-20 | 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 | 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法 |
| RU2725862C1 (ru) * | 2019-09-03 | 2020-07-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ количественной оценки вирионов вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной для кривых реакции амплификации в режиме реального времени |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230035871A1 (en) | Method, composition and kit for fluorescent quantitative pcr, and use thereof | |
| CN110551846B (zh) | 一种用于非洲猪瘟病毒核酸快速检测的Cpf1试剂盒及其检测方法 | |
| CN111560482B (zh) | 基于CRISPR/Cas和核酸试纸的检测方法和人乳头瘤病毒检测试剂盒 | |
| CN111020064A (zh) | 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒 | |
| CN111621604A (zh) | 一种新型冠状病毒核酸检测引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
| WO2023109032A1 (zh) | 一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用 | |
| CN107988325A (zh) | 虾肝肠胞虫（ehp）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN111020031A (zh) | 序列特异性阻断剂结合特定pcr程序检测肿瘤基因突变的方法 | |
| WO2023025259A1 (zh) | 检测微小rna的方法和试剂盒 | |
| CN113584224B (zh) | 基于lamp技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN107988427A (zh) | 对虾肝胰腺细小病毒（hpv）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN113862393A (zh) | 一种快速检测格特隐球菌的方法 | |
| CN113046452B (zh) | 一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用 | |
| CN111455094B (zh) | 检测深部感染真菌的组合物、试剂盒、用途及其方法 | |
| RU2808238C1 (ru) | Способ, композиция и набор для флуоресцентной количественной пцр и их применение | |
| CN114507706B (zh) | 基于酶dna修复级联驱动荧光团编码/去编码的生物传感器及其在端粒酶检测中的应用 | |
| WO2013049822A2 (en) | Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv) | |
| CN114250273A (zh) | 用于核酸检测的组合物 | |
| US20120082995A1 (en) | Method for quantitative pcr amplification of deoxyribonucleic acids from a sample containing pcr inhibitors | |
| US20210214809A1 (en) | One-step detection kit for molecular diagnostics of sars-cov-2 virus | |
| CN113151570B (zh) | 一种基于lna修饰的环介导等温扩增lamp技术及其在念珠菌快速检测中的应用 | |
| CN116064965B (zh) | 恒温扩增检测猴痘病毒的组合物、试剂盒及其用途 | |
| KR102499837B1 (ko) | 유행성궤양증후군 검출용 조성물 및 이의 검출방법 | |
| CN118685526B (zh) | 用于诊断肺癌基因甲基化的pcr引物探针组合、试剂盒及其应用 | |
| CN118028543B (zh) | 用于检测奥密克戎病毒变异株的组合物、试剂盒及其用途 |