CN108330215A

CN108330215A - 一种应用rpa技术检测hpv高危16型的引物及探针组合物

Info

Publication number: CN108330215A
Application number: CN201810479571.6A
Authority: CN
Inventors: 唐乃平; 曾骥孟; 龚剑; 方月; 蒙明慧
Original assignee: Jiangsu Yinuowan Cell Clinic Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Yinuowan Cell Clinic Co Ltd
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2018-05-18
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明公开一种应用RPA技术检测HPV高危16型的引物探针组合物，其中正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明方法根据HPV高危16型基因组序列设计了大量RPA引物和探针，从中筛选出一对可快速有效检测HPV高危16型核酸的引物及探针组合。应用本发明提供的引物对和探针及相应的试剂盒可以对妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的HPV高危16型DNA片段进行快速恒温荧光检测。检测结果可用于HPV高危16型感染的辅助诊断及宫颈癌的早期筛查、宫颈病变的随访、指导疫苗的开发。

Description

一种应用RPA技术检测HPV高危16型的引物及探针组合物

技术领域

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及到一种检测HPV高危16型的引物及探针组合物。即应用重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术快速检测HPV高危16型的引物对、探针和检测方法。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对（bp），分为3个功能区，即早期转录区（E区）、晚期转录区（L区）和非转录区（长控制区，LCR）。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道HPV感染具有普遍性，据统计70%～80%的女性在其一生中会有至少一次的HPV感染，但大多数感染为自限性，超过90％的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。而持续性的高危型HPV感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7%的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在，在这些高危型HPV中，最为常见的是HPV16型，其次为18型。我国一项横跨7个宫颈癌发病率不同地区的19家医院、共纳入1244个病例的中国宫颈癌相关高危型HPV亚型分布多中心研究证实，中国不同区域的宫颈癌及宫颈高度病变都是以感染HPV16/18为主，大约85%的宫颈癌确诊病例属于这两种亚型，且HPV16/18的感染率和致癌率都明显高于其他高危型HPV ( ChenW etal . Human papillomavirus type-distribution in cervical cancer in China :the importance of HPV 16 and 18 . Cancer Causes and Control, 2009, 20:1705-1713 )。

目前核酸检测的主要方法为 PCR 法，常规的 PCR 检测需要特殊的热循环仪以及繁琐的试验程序，难以满足现场或实验室之外其他条件下的检测需要。近年来，一些核酸等温扩增技术逐渐发展起来，这些技术不需要昂贵的热循环PCR 仪，并且可以在短时间内快速大量扩增出目的片段，具有简单、快速、灵敏度高等优点。其中的 RPA 技术更是被称为可以替代传统PCR 的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡聚核苷酸引物)的重组酶、单链 DNA 结合蛋白 (SSB) 和链置换 DNA 聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也具有活性，其最佳反应温度在 37~42℃左右。RPA 技术是模拟了生物体内 DNA复制、基于重组酶聚合酶介导的扩增原理发展而来。它可以在非常短的时间内使目的基因以指数级增长，若配合荧光标记的探针和荧光信号检测仪便可实现对模板扩增的实时监测。RPA技术大大减少了检测时间，简化了反应程序，结合快速核酸提取技术和便携式的实时荧光检测设备后非常适用于现场或田间检测，具有广阔的应用前景。利用 RPA 技术检测HPV高危16型具有极大的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用 RPA 技术检测HPV高危16型的引物及探针组合物及其应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种应用 RPA 技术检测 HPV 高危16型的引物及探针组合物，该组合物中包含引物对和探针，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示，

SEQ ID NO:1：CAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAA

SEQ ID NO:2：CAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTC；

所述探针的序列为（1）~（6）中的任意一种：

（1）探针具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；SEQ ID NO:3：TGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAG；

（2）在所述SEQ ID NO:3的第31位碱基标记FAM发光基团；

（3）在所述SEQ ID NO:3的第34位碱基标记BHQ1淬灭基团；

（4）在所述SEQ ID NO:3的第32位碱基用四氢呋喃替代（THF）；

（5）在所述SEQ ID NO:3的3′末端进行C3修饰；

（6）在所述SEQ ID NO:3的第31位碱基标记FAM发光基团，第34位碱基标记BHQ1淬灭基团，第32位碱基用四氢呋喃替代（THF）及3′末端进行C3修饰，探针HPV16-RPAP具体序列为：TGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA(FAM-dT)(dSp)G(BHQ1-dT)CCAGCTGGACAAG(SpacerC3)。

上述的引物及探针组合物在检测HPV高危16型或制备用于检测HPV高危16型试剂盒中的应用。

一种应用 RPA 技术检测 HPV 高危16型的试剂盒，该试剂盒包含上述的引物及探针组合物。具体的，该试剂盒中还含有PCR技术常用试剂。

上述的试剂盒在检测HPV高危16型中的应用。

一种应用 RPA 技术检测HPV高危16型的方法，提取待检样品中的 DNA 作为模板，采用上述的引物及探针组合物进行荧光快速检测，如果有明显的荧光曲线扩增，则说明所检测样品中含有HPV高危16型核酸。

该方法具体包括以下步骤：在 0.2ml PCR管中加入2×Buffer 12.5μl，10×E-mix2.5μl，dNTP 1μl，50μM的引物各 0.2μl，50μM的TwistAmp exo探针 0.1μl，20×Core-mix1.25μl，EXO酶0.5μl，模板DNA 2μl和dH₂O 3.5μl，涡旋混匀短暂离心后，加入280mM的醋酸镁溶液1.25μl，混匀，将反应管置于RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪中，39℃反应20分钟。

本发明方法根据HPV高危16型基因组序列设计了大量 RPA 引物和探针，从中筛选出一对可快速有效检测HPV高危16型核酸的引物及探针组合。利用该套引物和探针进行快速检测，以医院检验科明确的HPV16型6例宫颈棉拭子提取的核酸DNA为模板均可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如HPV6型、HPV11型、HPV18型、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟菌、白色念珠菌核酸DNA为模板进行反应均没有扩增曲线。该方法准确率高、灵敏度高。

附图说明

图 1 为HPV高危16型特异性检测。

其中，1-6为医院检验科明确的HPV16型6例宫颈棉拭子提取的核酸DNA为模板扩增曲线，7-13分别为HPV6型、HPV11型、HPV18型、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟菌、白色念珠菌和健康人宫颈棉拭子提取的核酸DNA为模板扩增曲线。

图 2 为检测灵敏度试验图，使用HPV高危16型DNA为模板，拷贝数依次从 10⁵到10¹个拷贝时的检测阳性率。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例。

实施例1：检测方法的建立

根据 GenBank 中HPV高危16型基因组序列，设计引物和探针。引物长度约为30-35bp，由于目前没有针对 RPA 的引物设计软件，本发明前期工作过程中设计合成了大量引物，从中筛选出一对灵敏度高且特异性好的引物，引物和探针序列如表1所示。

表1：用于RPA检测HPV高危16型的引物和探针

引物名称	序列5'-3'
		HPV16-RPAF(SEQ ID No.1)	CAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAA
HPV16-RPAR(SEQ ID No.2)	CAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTC
		HPV16-RPAP	TGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGA(FAM-dT)(dSp)G(BHQ1-dT)CCAGCTGGACAAG(Spacer C3)

1.材料与方法

(1) 材料医院明确的6例HPV16型宫颈棉拭子，HPV6型、HPV11型、HPV18型、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟菌、白色念珠菌和健康人宫颈棉拭子。引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成，其他试剂均为进口。

(2)核酸提取取各宫颈棉拭子的生理盐水浸出液200μl，使用Axygen公司的AxyPrep Mag 磁珠法体液病毒DNA/RNA小量试剂盒、AxyPrep 细菌基因组DNA小量制备试剂盒，按照产品说明书提取各种材料中的总核酸。

(3)制备HPV高危16型模板，根据GenBank 中HPV高危16型基因组序列，通过苏州泓迅生物科技股份有限公司合成重组质粒，测定浓度后计算出对应拷贝数，依次从10⁵ 拷贝/μl以10倍梯度稀释至10¹拷贝/μl，-20℃保存。

(4) RPA扩增使用TwistAmp Liquid Exo Kit(TwistDx，Cambridge，UK)试剂盒在25μl反应体系进行RPA试验，首先在 0.2ml PCR管中加入2×Buffer 12.5μl，10×E-mix2.5μl，dNTP 1μl，50μM的引物各0.2μl，50μM的TwistAmp exo探针0.1μl，20×Core-mix1.25μl，EXO酶0.5μl，模板DNA 2μl和dH₂O 3.5μl，涡旋混匀短暂离心后，加入280mM的醋酸镁溶液1.25μl，混匀，将反应管置于RPA扩增检测仪或荧光定量PCR仪中，39℃反应20分钟。以不同种类的棉拭子核酸总核酸为模板进行特异性检测，以不同稀释度的DNA标准为模板进行反应的灵敏性检测。

结果

2.1 特异性

用本发明所设计的引物和探针进行快速检测，以医院检验科明确的HPV16型6例宫颈棉拭子提取的核酸DNA为模板均可以得到明显的扩增曲线，其他病原核酸如HPV6型、HPV11型、HPV18型、单纯疱疹病毒、淋病奈瑟菌、白色念珠菌核酸DNA、健康人宫颈棉拭子等为模板进行反应均没有扩增曲线(如图1所示)。

检测灵敏度

将病毒核酸10倍稀释至多个梯度，每个梯度重复检测10次，使用统计软件计算出结果在模板低至约300个拷贝时有95％的检出可能性，具有较高的灵敏度(如图2所示)。

实施例2：在临床样品中的应用

使用实施例 1 中建立的 RPA 方法对国内 12 份临床疑似病例的宫颈棉拭子样品进行检测。Axygen公司的 AxyPrep Mag 磁珠法体液病毒DNA/RNA小量试剂盒按照产品说明书提取各种材料中的总核酸DNA，然后用RPA方法检测这些样品中是否含有HPV高危16型。同时采用人乳头瘤病毒（HPV）16型、18型核酸测定试剂盒（荧光PCR法）（上海之江生物）试剂盒对12份样品进行平行检测。结果两种检测方法的检测结果一致，12份样品均为HPV高危16型阳性。上述结果表明本发明的引物组和探针及其检测方法所获得的结果与PCR的结果一致，证明本发明的可靠性。

序列表

<110> 江苏医诺万细胞诊疗有限公司

<120> 一种应用RPA技术检测HPV高危16型的引物及探针组合物

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caattaaatg acagctcaga ggaggaggat gaa 33

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caacaaaagg ttacaatatt gtaatgggct c 31

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgacagctca gaggaggagg atgaaataga tggtccagct ggacaag 47

Claims

1.一种应用 RPA 技术检测 HPV 高危16型的引物及探针组合物，其特征在于，该组合物中包含引物对和探针，所述引物对的正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示，

SEQ ID NO:1：CAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAA

SEQ ID NO:2：CAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTC；

所述探针的序列为（1）~（6）中的任意一种：

（1）具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；SEQ ID NO:3：TGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAG；

（2）在所述SEQ ID NO:3的第31位碱基标记FAM发光基团；

（3）在所述SEQ ID NO:3的第34位碱基标记BHQ1淬灭基团；

（4）在所述SEQ ID NO:3的第32位碱基用四氢呋喃替代；

（5）在所述SEQ ID NO:3的3′末端进行C3修饰；

（6）在所述SEQ ID NO:3的第31位碱基标记FAM发光基团，第34位碱基标记BHQ1淬灭基团，第32位碱基用四氢呋喃替代及3′末端进行C3修饰。

2.权利要求1所述的引物及探针组合物在检测HPV高危16型或制备用于检测HPV高危16型试剂盒中的应用。

3.一种应用 RPA 技术检测 HPV 高危16型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物及探针组合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有PCR技术常用试剂。

5.权利要求3或4所述的试剂盒在检测HPV高危16型中的应用。

6.一种应用 RPA 技术检测HPV高危16型的方法，其特征在于，以待检样品中的DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物及探针组合物进行荧光快速检测，如果有明显的荧光曲线扩增，则说明所检测样品中含有HPV高危16型核酸。