CN106048081A - 一种hpv分型检测引物及其检测方法和应用 - Google Patents

一种hpv分型检测引物及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种HPV分型检测引物及其检测方法和应用。分型检测HPV的qPCR引分别由SEQ ID NO:1‑38所示，所述分型检测HPV的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中的应用。本发明提供的引物对以及试剂盒在HPV检测分型特异性、灵敏度都远高于常见的反向点杂交方法，且对环境和操作要求较低，应用广泛。同时本发明还将DNA双链嵌合荧光染料qPCR检测方法应用到HPV分型检测中，并通过扩增曲线及熔解曲线双重分析提高检测特异性，在特异性达到探针法检测水平的同时，极大地降低了成本，对HPV普查的推广和宫颈癌的防治具有重要意义，具有极高的推广应用价值。

Description

一种HPV分型检测引物及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种HPV分型检测引物及其检测方法和应用。
背景技术
人乳头状瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)属于乳头瘤病毒属，是一种特异性感染皮肤或粘膜复层上皮的病毒。HPV是一种双链DNA病毒，基因组大小约为7900对碱基。基因组编码3个功能区，即早期转录区(Early Region，E区)、晚期转录区(Late Region，L区)和上游调控区(LCR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，具有参与病毒DNA的复制、转录、翻译、调控和细胞转化等功能。L区主要有衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2，其功能是编码病毒的衣壳蛋白。LCR含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV基因表达所必需的调控元件，调控病毒的转录与复制。
目前已经确定的HPV类型超过120种，在临床上根据其致癌的风险不同分为高危型和低危型。低危型与性传播疣或尖锐湿疣有关，一般不诱发癌变，常见的低危型为6、11、44、81等；高危型的感染则是子宫颈癌及子宫上皮内瘤变发生的必要条件，常见的高危型有16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68等。另外，有研究显示，除了16和18这两种最常见的高危型之外，其它各种类型的HPV具有明显的地域性差异。非洲较为流行的是HPV45和HPV33，欧洲较为流行的HPV45，南、北美洲是HPV31、33和45。而我国较流行的是58，52和81。
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，全世界每年宫颈癌的新发病例大约500000，是除乳腺癌之外威胁女性生命健康的第二大恶性肿瘤。导致宫颈癌的发病的因素很多，但其中99.7％都与高危型HPV的反复感染有关。因此，HPV普查对于宫颈癌的预防，早期发现及治疗都具有重要的意义。现如今，针对我国宫颈癌高发的实际情况，针对中国育龄妇女人数多、缺乏对HPV感染与宫颈癌发生发展关系认识的现状，专家呼吁，应从源头抓起，由政府牵头尽快完善HPV普查、宫颈癌早诊早治的预防模式。目前，政府虽已在努力开展宫颈癌筛查，但受经费和技术条件限制，每年受益人群有限，相对于中国妇女的庞大基数而言，可谓杯水车薪。
由于HPV至今尚不能在体外培养，又无合适的实验动物，因而对其检测主要依赖于形态学鉴定和分子生物学检测技术。目前已经在临床中应用的HPV检测方法主要包括如下几大类：细胞病理学检查，组织学检查，免疫学检查和分子生物学检查等。
细胞学检查包括传统巴氏涂片(CV)、液基薄层细胞学技术(TCT)、自动细胞学检测系统(CT)等。该方法优点：操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：凹空细胞是HPV感染的主要形态学改变，但由于其他病毒感染及人为因素均有可能造成细胞内出现空泡或凹空样变，而且细胞学检查易受取材、染色及细胞病理医生的主观判断等因素的影响，因此应用细胞病理学检测HPV存在灵敏度低、特异性差、假阴性率和假阳性率高、不能对HPV进行分型。
组织学检查包括肉眼观察；阴道镜观察；组织检查。该方法优点：操作简单，价格低廉，适宜作初步筛查；缺点：准确率低，人员素质要求高，病人痛苦程度大，心里抵触不愿意配合检查。
免疫组化检查包括ELISA，免疫沉淀法等。该方法优点：原理明确，操作相对简单；缺点：血清学检测的对象是抗原和抗体，由于人体对HPV产生免疫应答有一定的迟滞性，所以血清学检测对无免疫应答者和HPV潜伏期感染者会产生漏检。
随着分子生物学技术的发展，通过检测HPV-DNA的方法来鉴别HPV感染类型在临床上的应用越来越广泛。具体可以分为三类：
第一类是直接探针结合法，如有HPV类型特异性探针的Southern印迹和点印迹，原位杂交过滤(FISH)等法，由于其低灵敏度、操作繁琐费时及需要大量纯化的探针，现已很少采用。
第二类是信号放大法，如杂交捕获法和bDNA法。杂交捕获(Hybrid Capture)法是美国Digene公司的检测HPV-DNA的技术，是目前获得美国FDA批准可在临床使用的一种检测HPV-DNA的检测技术，在上述方法中，利用Hybrid Capture的液体杂交和普通引物PCR之后线性探针测试被认为是针对于诊断目的最合适的方法。商业化的Hybrid Capture试剂盒无须PCR扩增即可检出临床样品中的HPV-DNA，并且可区别出高危型和低危型。但是，使用RNA探针可能会影响试剂盒的稳定性，并且也不能排除交叉反应的可能。
第三类方法是基于PCR的靶序列片段扩增技术，应用PCR对特异型HPV靶序列片段进行扩增，用型特异性的寡核苷酸探针鉴别HPV型别。常见的方法有：Amplicor微孔板检测法，反向点杂交法等。等这些基于通用引物PCR的方法，都存在几个缺点，一是经过PCR反应之后，样本需要通过进一步的开盖操作才能完成检测；二是对于多重感染的样本，通用引物具有一定的偏好性，会选择性的放大优势类型，而劣势类型可能会淹没在背景中。
实时荧光定量PCR技术使用的荧光化学方法主要包括双链DNA结合荧光染料发光法和探针法(如TaqMan探针)。双链DNA结合荧光染料发光法主要包括SYBR I染料法和近年兴起的更为敏感的EvaGreen染料法。虽然成本低廉，但是，双链DNA结合荧光染料发光法具有一个显著的缺点，即其特异性非常容易受到非特异性基因扩增和引物二聚体形成的影响，这使得双链DNA结合荧光染料qPCR方法一直无法能够有效地应用于临床检测。探针法qPCR可以有效地解决双链DNA结合荧光染料qPCR非特异性问题，但其最主要的缺点就是探针设计成本太高，无法广泛地应用到像HPV感染这类疾病的筛查之中去。因此，改进和完善成本非常低的双链DNA荧光染料结合定量PCR方法对于许多需要在大众人群中广泛普查的疾病和传染性疾病，尤其是HPV的普查和宫颈癌的防治具有重大意义，对于分子诊断能尽早地应用于广大基层医院也有重要的现实意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种HPV分型检测引物及其检测方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种分型检测HPV的qPCR引物：
特异性的扩增高危型HPV16的引物对为SEQ ID NO:1-2所示；
特异性的扩增高危型HPV18的引物对为SEQ ID NO:3-4所示；
特异性的扩增高危型HPV31的引物对为SEQ ID NO:5-6所示；
特异性的扩增高危型HPV33的引物对为SEQ ID NO:7-8所示；
特异性的扩增高危型HPV35的引物对为SEQ ID NO:9-10所示；
特异性的扩增高危型HPV39的引物对为SEQ ID NO:11-12所示；
特异性的扩增高危型HPV45的引物对为SEQ ID NO:13-14所示；
特异性的扩增高危型HPV51的引物对为SEQ ID NO:15-16所示；
特异性的扩增高危型HPV52的引物对为SEQ ID NO:17-18所示；
特异性的扩增高危型HPV53的引物对为SEQ ID NO:19-20所示；
特异性的扩增高危型HPV56的引物对为SEQ ID NO:21-22所示；
特异性的扩增高危型HPV58的引物对为SEQ ID NO:23-24所示；
特异性的扩增高危型HPV59的引物对为SEQ ID NO:25-26所示；
特异性的扩增高危型HPV66的引物对为SEQ ID NO:27-28所示；
特异性的扩增高危型HPV68的引物对为SEQ ID NO:29-30所示；
或与SEQ ID NO:1-30所示序列同源性达70-90％的序列。
一种分型检测HPV的qPCR引物：
特异性的扩增低危型HPV6的引物对为SEQ ID NO:31-32所示；
特异性的扩增低危型HPV11的引物对为SEQ ID NO:33-34所示；
特异性的扩增低危型HPV44的引物对为SEQ ID NO:35-36所示；
特异性的扩增低危型HPV81的引物对为SEQ ID NO:37-38所示；
或与SEQ ID NO:31-38所示序列同源性达70-90％的序列。
一种分型检测HPV的qPCR引物的应用，所述分型检测HPV的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中的应用。
所述分型检测HPV的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中扩增阳性对照引物对核苷酸序列如SEQ ID NO:39-40所示。
一种HPV检测试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO:1-38所示的特异性扩增HPV的核苷酸序列，及SEQ ID NO:39-40所示对照引物对。
所述试剂盒扩增高危型HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV66或HPV68；扩增低危型HPV6、HPV11、HPV44或HPV81。
所述试剂盒还包括标准品、qPCR反应混合液iTaqTM Universal SYBRGreenSupermix，标准品，超纯水，用于qPCR扩增的八联管及盖子。
其中，标准品为含有相应检测HPV亚型目的片段的质粒和背景DNA混合液，上述标准品由含有目的片段的质粒与背景DNA(不含目的片)按1:300000的质量比混合，含有目的片段的质粒在标准品中的终浓度未107拷贝/微升。
一种HPV检测试剂盒的应用，所述HPV检测试剂盒在检测HPV中的应用。
具体，将待检测的样品经所述HPV检测试剂盒进行扩增，将扩增产物在扩增曲线和熔解曲线的双重数值分析，进而确定待检测的样品的感染类型。
所述扩增产物在扩增曲线的ct值，分3种情况：1.ct值小于30，再由熔解曲线的熔解峰位置进行判定，若熔解峰位置与引物类型的标准峰一致，则为阳性；反之为阴性；2.ct值大于30小于35，再由熔解曲线的熔解峰位置进行判定，若熔解峰位置与引物类型的标准峰一致的基础上，峰型为尖锐陡峭，则为阳性，反之则为阴性；3.ct值大于35为阴性。(对于扩增曲线中ct值35的引物类型，则直接认定为阴性。而当阳性参照的ct值大于35时，说明所提取的样本DNA不合格或反应过程出现问题，需要重新实验)
本发明所具有优点：
(1)本发明引物可对各种类型HPV DNA检测特异性强，采用本发明检测分析方法，解决了DNA结合荧光染料qPCR用于HPV分子诊断时无法区分目的片段与存在的非特异信号扩增和二聚体形成等问题。
(2)本发明能够准确地鉴别15种常见高危型和4种常见低危型HPV感染，为临床诊疗提供可靠指南。
(3)本发明中的每种特异性引物的反应过程均在独立的反应管中进行，体系配制完成后就实现全程闭管，及避免了通用引物在多重感染样本检测中的偏好性，也避免了反复开盖造成的交叉污染。
(4)本发明将双链DNA结合荧光染料与qPCR检测方法相结合，为HPV防治提供了快速准确的分子检测手段，同时大大降低了检验成本，本发明检测方法的成本仅为探针法的20％。
(5)本发明进行灵敏度检测的标准品是用含有目的片段的质粒与人基因组DNA按一定比例混合而成的，既可以准确反应体系中的HPV拷贝数，又与实际样本中提到的DNA类似，可以准确反应本发明的检测灵敏度。而传统测法只用质粒做灵敏度检测标准品，没有将大量的人基因组对检测效率的影响考虑在内。
(6)本发明对环境及操作的要求相对常规qPCR较低，在各种常见轻微污染的情况下，仍然可以准确检测出目标HPV类型。
附图说明
图1为本发明实施例提供的染料法中使用的DNA双链结合染料SYBR与DNA结合示意图；
图2为本发明实施例提供的16型标准品浓度梯度(106-102copies/微升)扩增曲线(左)及计算得到的标准曲线(右)；
图3为本发明实施例提供的18型标准品浓度梯度(107-101copies/微升)扩增曲线(左)及计算得到的标准曲线(右)；
图4为本发明实施例提供的53型标准品浓度梯度(107-101copies/微升)扩增曲线(左)及计算得到的标准曲线(右)；
图5为本发明实施例提供的66型标准品浓度梯度(107-101copies/微升)扩增曲线(左)及计算得到的标准曲线(右)；
图6为本发明实施例提供的44型标准品浓度梯度(107-101copies/微升)扩增曲线(左)及计算得到的标准曲线(右)；
图7为本发明实施例提供的16型标准品熔解峰对应温度标准曲线；
图8为本发明实施例提供的18型标准品熔解峰对应温度标准曲线；
图9为本发明实施例提供的53型标准品熔解峰对应温度标准曲线；
图10为本发明实施例提供的66型标准品熔解峰对应温度标准曲线；
图11为本发明实施例提供的44型标准品熔解峰对应温度标准曲线；
图12为本发明实施例提供的实际检测样品的扩增曲线；
图13为本发明实施例提供的实际检测样品的熔解峰曲线；
图14为16型特异性引物扩增常见21种单独感染的临床样本的扩增曲线(左)和熔解曲线(右)；
图15为45型特异性引物扩增常见21种单独感染的临床样本的扩增曲线(左)和熔解曲线(右)；
图16为6型特异性引物扩增常见21种单独感染的临床样本的扩增曲线(左)和熔解曲线(右)；
图17为81型特异性引物扩增常见21种单独感染的临床样本的扩增曲线(左)和熔解曲线(右)。
图18为HPV53型标准品中质粒的测序结果。
具体实施方式
本发明所提供的引物对以及HPV检测试剂盒，其HPV检测分型特异性、灵敏度都远高于常见的反向点杂交方法，且对环境和操作要求较低，应用广泛。本发明还将DNA双链嵌合荧光染料qPCR检测方法应用到HPV分型检测并通过扩增曲线及熔解曲线双重分析提高检测特异性，在特异性达到探针法检测水平的同时，极大地降低了成本，对HPV普查的推广和宫颈癌的防治具有重要意义，具有极高的推广应用价值。
如下所述仅为本发明具体实施方式之一，目的是可以使本发明更容易理解，但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动所想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
实施例1：引物设计。
通过NCBI上的primer-blast软件针对不同高危型或低危型HPV设计特异性引物，保证引物对与其它HPV类型及人基因组没有同源性。之后将得到的多对引物(平均10对)输入oligo 6软件进行分析，综合考虑引物自匹配、颈环结构、扩增效率及错配情况，分别获得出最优的针对不同高危型或低危型HPV引物对，具体如下
高危型HPV16特异性引物其序列如SEQ ID NO：1～2所示：
SEQ ID NO:1(HPV16F):5’---CAGACGACTATCCAGCGACC---3’；
SEQ ID NO:2(HPV16R):5’---GCAGTGAGGATTGGAGCACT---3’；
高危型HPV18特异性引物其序列如SEQ ID NO：3～4所示：
SEQ ID NO:3(HPV18F):5’---CTGCTACACGACCTGGACAC---3’；
SEQ ID NO:4(HPV18R):5’---CACCGAGAAGTGGGTTGACA---3’；
高危型HPV31特异性引物其序列如SEQ ID NO：5～6所示：
SEQ ID NO:5(HPV31F):5’---TGCAAAGGTCAGTTAACAGAA---3’；
SEQ ID NO:6(HPV31R):5’---GTACACACTCCGTGTGGTGT---3’；
高危型HPV33特异性引物其序列如SEQ ID NO：7～8所示：
SEQ ID NO:7(HPV33F):5’---GCAACAACACGTACCAGCAA---3’；
SEQ ID NO:8(HPV33R):5’---CAGGGCCAGACATAACAGGA---3’；
高危型HPV35特异性引物其序列如SEQ ID NO：9～10所示：
SEQ ID NO:9(HPV35F):5’---AGGTGCGGTATGTTTCAGGA---3’；
SEQ ID NO:10(HPV35R):5’---GCTTTCTTCTACCTCGTTGCAC---3’；
高危型HPV39特异性引物其序列如SEQ ID NO：11～12所示：
SEQ ID NO:11(HPV39F):5’---TAATACAAGGGATTCGGGCACT---3’；
SEQ ID NO:12(HPV39R):5’---AGTAGATGCTGAAGAAGCCACA---3’；
高危型HPV45特异性引物其序列如SEQ ID NO：13～14所示：
SEQ ID NO:13(HPV45F):5’---AGTGTTGTGTAGGGTTGCAC---3’；
SEQ ID NO:14(HPV45R):5’---TGGATGCTGTGTAGTATGCAAG---3’；
高危型HPV51特异性引物其序列如SEQ ID NO：15～16所示：
SEQ ID NO:15(HPV51F):5’---CATGTACGGGTGTATGTGGGTA---3’；
SEQ ID NO:16(HPV51R):5’---AATAGGGACGCCACCGAAAC---3’；
高危型HPV52特异性引物其序列如SEQ ID NO：17～18所示：
SEQ ID NO:17(HPV52F):5’---GTCCTTGGCACAGTAACAACT---3’；
SEQ ID NO:18(HPV52R):5’---TGTGAGTCAGCAGGTCAGTTT---3’；
高危型HPV53特异性引物其序列如SEQ ID NO：19～20所示：
SEQ ID NO:19(HPV53F):5’---AGTATGTAAGGGAGGCAAGTG---3’；
SEQ ID NO:20(HPV53R):5’---CACTTCCTGACCCTATGCTC---3’；
高危型HPV56特异性引物其序列如SEQ ID NO：21～22所示：
SEQ ID NO:21(HPV56F):5’---ATTCCAGGCTTTAGGCGTA---3’；
SEQ ID NO:22(HPV56R):5’---GCAGATACTAATGTTGCAGGTC---3’；
高危型HPV58特异性引物其序列如SEQ ID NO：23～24所示：
SEQ ID NO:23(HPV58F):5’---ATGTGTGTGTATCGTGGAAA---3’；
SEQ ID NO:24(HPV58R):5’---CGCTGTCTTCTAGCTCAATA---3’；
高危型HPV59特异性引物其序列如SEQ ID NO：25～26所示：
SEQ ID NO:25(HPV59F):5’---CCACAGCGTCACAACATTGT---3’；
SEQ ID NO:26(HPV59R):5’---AGGCTCGCAATCCGTCTT---3’；
高危型HPV66特异性引物其序列如SEQ ID NO：27～28所示：
SEQ ID NO:27(HPV66F):5’---TCCTCCAGAGAGTCCTACGC---3’；
SEQ ID NO:28(HPV66R):5’---CCACAGTGGTTGTGTGTGTTG---3’；
高危型HPV69特异性引物其序列如SEQ ID NO：29～30所示：
SEQ ID NO:29(HPV68F):5’---CTTCAGTGGCGTCTACAGCA---3’；
SEQ ID NO:30(HPV68R):5’---TTACAGGCGTGTTCCAAGCA---3’；
低危型HPV6特异性引物其序列如SEQ ID NO：31～32所示：
SEQ ID NO:31(HPV6F):5’---CCATTGTCACTTCCTAATGACCTG---3’；
SEQ ID NO:32(HPV6R):5’---GGTGTTCCCATAGGTGCAGT---3’；
低危型HPV11特异性引物其序列如SEQ ID NO：33～34所示：
SEQ ID NO:33(HPV11F):5’---CCACCTGACACTGGGAAGTC---3’；
SEQ ID NO:34(HPV11R):5’---TTGCATCCGTTAGTGGCTGT---3’；
低危型HPV44特异性引物其序列如SEQ ID NO：35～36所示：
SEQ ID NO:35(HPV44F):5’---GCAGGGCCACAATAATGGTA---3’；
SEQ ID NO:36(HPV44R):5’---GGACTGTGTAGTGGCAGCAC---3’；
低危型HPV81特异性引物其序列如SEQ ID NO：37～38所示：
SEQ ID NO:37(HPV81F):5’---GCCTTGCACACTTTGTATTTCC---3’；
SEQ ID NO:38(HPV81R):5’---GTCCTGCAACGTTTCGGTTTA---3’；
以人actb基因作为内参基因，通过NCBI上的primer-blast软件针对人actb基因设计特异性引物。之后将得到的多对引物(平均10对)输入oligo 6软件进行分析，综合考虑引物自匹配、颈环结构、扩增效率及错配情况，获得最优的引物对，其序列如SEQ ID NO：39～40所示：
SEQ ID NO:39(actbF):5’---GAGGGCATACCCCTCGTAGA---3’；
SEQ ID NO:40(actbR):5’---GTGCTATCCCTGTACGCCTC---3’；
实施例2：质粒标准品的构建及标准曲线的制定。
为了检验所设计的引物是否能够准确地应用于HPV的qPCR分型检测，现相应获得各种引物的扩增标准曲线。
以获得HPV53的标准曲线为例：
一、53型质粒标准品构建：
(1)目的片段扩增，使用53型目的片段扩增引物(上游：5-GGTATCCGTATGGAGTGTG-3；下游：5-CCACCTTGCTACATACATGC-3)，以HPV53型感染的临床样本DNA为模板。使用KOD-Plus-Neo(TOYOBO)试剂盒，进行扩增，反应体系和反应条件见表1，2。
表1质粒构建目的片段扩增体系
表2质粒构建目的片段扩增反应条件
(2)目的片段胶回收及纯化，取50μL上述PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳，切取1970bp处的条带即目的片段。利用切胶回收试剂盒回收(AXYGEN，USA Code：AP-GX-50)，按照其说明书所描述的过程回收并纯化DNA片段。
(3)目的片段与载体连接，使用快速DNA连接试剂盒(碧云天，中国)。连接体系为10微升：50ng经EcoRV(Thermo)酶切的pUC19,150ng上述PCR产物，0.5微升Rapid T4 DNAligase，5微升快速连接缓冲液(2X)，无菌双蒸水补至10微升。连接条件为：25℃连接30min。
(4)转化宿主大肠杆菌,具体步骤如下：(a)待连接反应结束后，全量(10微升)连接溶液加入至100微升大肠杆菌感受态菌DH5a，冰中放置30min。(b)42℃加热120s后，再在冰中放置3min。(c)加入1毫升LB液体培养基，37℃振荡培养60min。(d)5000rpm离心2min，弃去上清，加入40微升2％X-gal和7微升20％IPTG将菌体吹吸混匀涂布在含有Amp+(80ug/ml)的LB固体培养皿。(e)37℃倒置培养过夜(12-16h)，形成单菌落。
(5)PCR鉴定阳性克隆，用灭菌牙签挑取单个白斑菌落，在含有Amp的LB固体培养基上留种，并蘸入20微升PCR反应液中(含pUC19通用引物M13-47和RVM),进行扩增结果得到1970bp片段的为阳性菌落。
(6)测序检测质粒序列质量，将上述鉴定为阳性的菌落接种于3mL LB(Amp+)培养液中，在37℃培养10-12h，取1mL菌液送测序公司测序。测序结果为该菌落的质粒中含有EF546472.1序列中第283至2152位共1970个HPV53的同源序列，命名为pE3F2，将含pE3F2的菌命名DH5a/pE3F2。进一步将该序列与NCBI中的HPV53序列比对同源性，结果如图18所示，可以看出，该序列与GeneBank中多种HPV53序列具有99％以上的同源性，因此pE3F2质粒可以作为定量HPV53的标准品。
另外，其它亚型的标准品也可参照上述记载的方式，即通过获得各亚型的本文中涉及的各特异性引物目标区域序列，再通过常规克隆手段将其转化至质粒载体即可，对质粒类型无要求载体中，获得含有不同亚型的标准品；同时，标准品也可采用现有的含有不同亚型的质粒进行替换，或是按照现有技术制备获得。
二、标准曲线和标准熔解峰曲线制备。
使用质粒小提试剂盒(AXYGEN，USA)提取并纯化上述获得的标准品质粒，而后采用Nanodrop超微量分光光度计计算定量拷贝数，梯度稀释成107，106，105，104，103，102，101数量级，同时，在保证质粒拷贝数浓度的前提下，标准品质粒与背景DNA(不含目的片段的DNA序列，如使用Qiagen DNA mini kit提取自人正常淋巴母细胞系HMy2.CIR)按1:300000的质量比混合。然后以SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20序列中记载的引物对进行qPCR反应，反应体系和条件按照表3和表4中记载进行配比。
由qPCR反应获得产物分别获得HPV53型质粒标准品的扩增标准曲线(参见图4)，和熔解峰标准曲线(参见图9)。
由图4显示qPCR CT值与HPV拷贝数成负相关，随着拷贝数降低，ct值增大。但在有非特异性扩增的情况下，ct值只能提示扩增结果，而不能在有非特异扩增中进行定量。图9显示HPV53型的标准熔解峰位置在79.0℃。
表3标准曲线qPCR反应体系
表4HPV qPCR反应条件(两步法)
而后，上述获得的其它亚型的也可按照上述记载的方式，采用实施例1中分别记载的不同亚型的引物对进行qPCR反应，分别获得各自的标准曲线(参见图2、3、5和6)和标准熔解峰曲线(参见图7、8、10、11)。
(此处只是得到上述引物对在扩增对应标准品时得到的标准熔解峰位置对应温度，对于在其它一起上使用没有意义，在其他一起上使用前需要使用标准品重新进行矫正。)由上述附图分别可见特异性引物HPV16，HPV18，HPV66，HPV44对各自目标标准品不同浓度梯度的扩增效率及目标标准熔解峰的位置分别为：81.5℃，80.5℃，79.5℃，77.0℃。
实施例3：引物特异性检测。
为了证明各种特异性引物对目标类型的扩增特异性，发明中所有特异性引物均与常见21种单独HPV感染的临床样本DNA进行扩增，其中各种临床样本均由第三方检测验证感染类型。且都经过阳性参照扩增保证DNA浓度。
现以16型引物为例
一、21种单独HPV感染的临床样本DNA提取：
(1)将内含样本的保存管盖拧紧，涡旋振荡15秒，使宫颈刷上的脱落细胞尽可能多的悬浮在保存液中。
(2)在保存管中吸取1ml保存液于1.5mlEP管中，8000g离心1分钟，弃上清。
(3)使用QIAGEN(德国)DNA MINI KIT提取组织的protocol进行DNA提取，最后使用100微升AE buffer溶解DNA，即为待测样本DNA溶液。所得到的DNA样本溶液可直接进行后续qPCR HPV分子检测，也可将其保存在-20℃冻存以备将来检查使用。
二、qPCR反应：
以上述实施例中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2记载的引物对进行qPCR反应，反应体系中各组分的添加量如表5所示，然后按表6的反应条件，应用Bio-Rad CFX connect实时定量PCR系统运行qPCR反应：
表5:HPV检测qPCR反应体系
表6：HPV检测qPCR反应条件
三、反应结果：
由上述扩增产物获得扩增曲线和熔解曲线(参见图14)。在阳性参照actb已经验证的情况下，首先检查扩增曲线，可见在各种常见类型HPV感染的样本中，只有HPV16+的样本能在HPV16特异性引物扩增下ct值为22.14，小于30，之后检查熔解曲线，可见HPV16+样本在HPV16特异性引物的扩增下熔解峰位置为81.5℃，与标准熔解峰一致。判定HPV16特异性引物可以扩增HPV16+样本。同时，由图可见有部分其它HPV感染类型的ct值在30-35之间，继续查看它们的熔解峰位置与标准熔解峰不一致，有的甚至没有形成熔解峰，因此判定HPV16特异性引物不能有效扩增这些HPV感染类型的样本。综上，HPV16引物的特异性较好。
而后，按照上述记载的方式分别对45型，6型，81型引物对进行特异性检测，分别获得各自的扩增曲线和熔解曲线(参见图15，16，17)。
由图15，16，17可见在阳性参照actb已经验证的情况下，首先检查扩增曲线，可见在各种常见类型HPV感染的样本中，分别只有HPV45+，HPV6+，HPV81+的样本能分别在HPV45，HPV6，HPV81特异性引物扩增下ct值分别为27.81，27.14，26.15，均小于30，之后检查熔解曲线，可见各样本在HPV45，HPV6，HPV81特异性引物的扩增下熔解峰位置分别为74.8℃，73.0℃，74.2℃，与标准熔解峰一致。判定HPV45，HPV6,HPV81特异性引物可以特异性扩增对应的样本。
四、检测结果分析方法。
待测标本中HPV最终浓度是以qPCR各样本反应结果的CT值来代表的，样本CT值代表HPV浓度的高低，CT值越高，样本内HPV病毒浓度越低(反之未必)。对于CT值大于35或无扩增的实验结果，在确认阳性对照actb基因扩增CT值小于35时即可判为HPV阴性；对于CT值小于30的实验结果，需要进一步结合熔解峰进行分析，如果样本熔解峰与标准熔解峰温度位置相同，则为阳性，反之则为阴性。对于扩增曲线中ct在大于30小于35的引物类型，在熔解峰与标准峰位置相同的基础上，如果满足峰型尖锐陡峭的特点，则为阳性，反之则为阴性。哪种引物对检测结果为阳性，就提示这种类型的HPV感染。当多组引物对检测结果同时为阳性时，则提示该样本为多重HPV感染。所有阳性对照actb基因扩增CT值大于35的实验结果应视为实验程序(样本提取)或操作错误，检测结果判定无效，应重新调整实验程序一直到阳性对照actb基因扩增CT值小于35才能做进一步实验检测判读。
实施例4：60例临床患者宫颈刷获取的脱落细胞样本HPV-DNA检测。
以下结合60例临床患者宫颈脱落细胞样本采用本发明提供的引物进行qPCR HPV检测；但并不局限于宫颈脱落细胞样本应用，也同样适应于其他各类临床样本HPV分子检测。在本实施例中所使用的60例临床患者样本，42例来自沈阳市妇婴医院，10例来自中国医科大学第一附属医院，8例来自中国医科大学第四附属医院。
1.样本DNA提取及qPCR检测实验。
每例临床样本同时检测上述实施例其中记载的20对引物，其中包括阳性参照及19种HPV引物对。qPCR反应总体系为20微升。所用的样本均保存在宫颈脱落细胞保存管中，并已经过现阶段各医院常用的反向点杂交法检测HPV感染类型，-80摄氏度保存。
2.以18号临床样本为例，
样品DNA提取：
(1)将内含样本的保存管盖拧紧，涡旋振荡15秒，使宫颈刷上的脱落细胞尽可能多的悬浮在保存液中。
(2)在保存管中吸取1ml保存液于1.5mlEP管中，8000g离心1分钟，弃上清。
(3)使用QIAGEN(德国)DNA MINI KIT提取组织的protocol进行DNA提取，最后使用100微升AE buffer溶解DNA，即为待测样本DNA溶液。所得到的DNA样本溶液可直接进行后续qPCR HPV分子检测，也可将其保存在-20℃冻存以备将来检查使用。然而，由于临床采样操作人员同样存在操作手法不同的情况，且患者的实际情况也有较大随机性，因此并不能保证按所述方法在每个样品中都能提取到合格的DNA，因此每个样本的阳性参照具有重要意义。
qPCR反应：同实施例3中qPCR反应。
所有qPCR反应体系中各组分的添加量如表7所示，然后按表8的反应条件，应用Bio-Rad CFX connect实时定量PCR系统运行qPCR反应：
表7:HPV检测qPCR反应体系
表8：HPV检测qPCR反应条件
3.反应结果：
由上述扩增产物获得反应的扩增曲线和熔解曲线(参见图12，13)。按照说明中提到的双重分析方法，首先检查阳性参照(Actb)的ct值，为20.13，小于30，说明样本DNA提取及反应过程正常。之后查看各种特异性引物的扩增曲线，发现HPV6特异性引物的ct值为20.05，然后查看其熔解峰位置与标准熔解峰一致(74.5℃)，则判定该样本HPV6阳性。同时，我们还看到有部分引物的ct值在30-35之间，继续查看它们的熔解峰位置与标准熔解峰不一致，有的甚至没有形成熔解峰，因此判定这些类型的HPV为阴性。综上，由上述记载的方式判定该样本为HPV6单一感染。
而后参照上述记载的方式分别对上述60例临床患者宫颈脱落细胞样本HPV qPCR检测结果统计，样本DNA浓度及质量检测：依据阳性对照actb基因的qPCR测试结果判断原始样本DNA的提取质量和相对浓度是否可靠以及实验操作是否正确。60例临床样本actb基因阳性对照检测结果显示有59例样本actb基因扩增CT值均小于30(38号CT值大于30)，熔解曲线分析为单一峰值，证明样本DNA提取质量和实验操作正确，检测结果可以得到正确判读(表9)。
表9：60例临床患者宫颈脱落细胞样本HPV qPCR检测结果
60例病人样本HPV检测结果分析：60例临床患者样本中，除1例DNA提取不和格外，其余59例检测结果均可正确判读。经统计，共检测出16型阳性样品12例；18型阳性样品10例；31型阳性样品1例；33型阳性样品1例；35型阳性样品2例；39型阳性样品3例；45型阳性样品2例；51型阳性样品2例；52型阳性样品9例；53型阳性样品6例；56型阳性样品1例；58型阳性样品5例；59型阳性样品1例；66型阳性样品3例；68型阳性样品2例；6型阳性样品5例；11型阳性样品4例；44型阳性样品3例；81型阳性样品5例；阴性样本2例。这与文献中报道的我国HPV主要感染类型为16、18、52、58型相符。其中检测出了12例复合感染，占总检测数(59例)的20.3％，提示复合感染在HPV感染中十分常见，并且会出现高危低危型混合感染的情况。通过对相同样品进行的反向点杂交法检测得到的数据进行对比，一致性仅为81.67％。对于两种检测方法有分歧的11例样本，我们又采取了第三方检测，使用的是上海之江生物科技股份有限公司出品的基于Taq-man技术的HPV检测试剂盒。其结果显示，所有11例有分歧样本与本发明的检测结果完全一致。这11例有分歧的样本中，反向点杂交法检测有9例假阴性，说明其方法检测灵敏度不够；有2例假阳性，说明其方法存在一定的错误性。另一方面，假阴性多出现在多重感染样本中，说明其方法对多重感染的样本检测存在一定的偏好性，从而影响试验结果。

Claims (8)

1.一种分型检测HPV的qPCR引物，其特征在于：
特异性的扩增高危型HPV16的引物对为SEQ ID NO:1-2所示；
特异性的扩增高危型HPV18的引物对为SEQ ID NO:3-4所示；
特异性的扩增高危型HPV31的引物对为SEQ ID NO:5-6所示；
特异性的扩增高危型HPV33的引物对为SEQ ID NO:7-8所示；
特异性的扩增高危型HPV35的引物对为SEQ ID NO:9-10所示；
特异性的扩增高危型HPV39的引物对为SEQ ID NO:11-12所示；
特异性的扩增高危型HPV45的引物对为SEQ ID NO:13-14所示；
特异性的扩增高危型HPV51的引物对为SEQ ID NO:15-16所示；
特异性的扩增高危型HPV52的引物对为SEQ ID NO:17-18所示；
特异性的扩增高危型HPV53的引物对为SEQ ID NO:19-20所示；
特异性的扩增高危型HPV56的引物对为SEQ ID NO:21-22所示；
特异性的扩增高危型HPV58的引物对为SEQ ID NO:23-24所示；
特异性的扩增高危型HPV59的引物对为SEQ ID NO:25-26所示；
特异性的扩增高危型HPV66的引物对为SEQ ID NO:27-28所示；
特异性的扩增高危型HPV68的引物对为SEQ ID NO:29-30所示；
或与SEQ ID NO:1-30所示序列同源性达70-90％的序列。
2.一种分型检测HPV的qPCR引物，其特征在于：
特异性的扩增低危型HPV6的引物对为SEQ ID NO:31-32所示；
特异性的扩增低危型HPV11的引物对为SEQ ID NO:33-34所示；
特异性的扩增低危型HPV44的引物对为SEQ ID NO:35-36所示；
特异性的扩增低危型HPV81的引物对为SEQ ID NO:37-38所示；
或与SEQ ID NO:31-38所示序列同源性达70-90％的序列。
3.一种权利要求1或2所述的分型检测HPV的qPCR引物的应用，其特征在于：所述分型检测HPV的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中的应用。
4.按权利要求3所述的分型检测HPV的qPCR引物的应用，其特征在于：所述分型检测HPV的qPCR引物在制备HPV检测试剂盒中扩增阳性对照引物对核苷酸序列如SEQ ID NO:39-40所示。
5.一种HPV检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括SEQ ID NO:1-38所示的特异性扩增HPV的核苷酸序列，及SEQ ID NO:39-40所示对照引物对。
6.按权利要求5所述的HPV检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒扩增高危型HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV66或HPV68；扩增低危型HPV6、HPV11、HPV44或HPV81。
7.一种权利要求5所述的HPV检测试剂盒的应用，其特征在于：所述HPV检测试剂盒在检测HPV中的应用。
8.按权利要求7所述的HPV检测试剂盒的应用，其特征在于：将待检测的样品经所述HPV检测试剂盒进行扩增，将扩增产物在扩增曲线和熔解曲线的双重数值分析，进而确定待检测的样品的感染类型。
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