CN111534576B - 用于荧光定量pcr的方法、组合物、试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及一种荧光定量PCR的方法，所述方法包括：1）将上下游引物对、荧光探针以及PCR扩增试剂混合；2）进行荧光定量PCR；其中，所述荧光探针上带有两个淬灭基团，其中，第一淬灭基团位于3’末端，而第二淬灭基团标记在T碱基上且与所述第一淬灭基团相隔10~15nt。使用本发明的荧光定量PCR方法能够降低荧光定量PCR中的本底信号，进一步提升PCR的灵敏度，降低检测假阴性的出现，并且还能够提高荧光定量PCR扩增效率。

Description

用于荧光定量PCR的方法、组合物、试剂盒及其用途
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及荧光定量PCR检测领域。
背景技术
核酸的聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种用于放大扩增特定的核酸片段（DNA/RNA）的分子生物学技术，使基因片段数万倍的增加。其原理的核心是荧光探针引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合杂交，形成部分双链，在DNA聚合酶的作用下进行DNA合成。而荧光探针引物与单链DNA模板的结合是基于碱基配对原则：碱基配对遵循G（鸟嘌呤）：C（胞嘧啶）、A（腺嘌呤）：T（胸腺嘧啶）/U（尿嘧啶）的Watson-Crick碱基配对原则，其被广泛的应用到医学诊断、科学研究、生物工程、农学等多种学科。实时荧光定量PCR （Quanti tative Real-time PCR，qPCR）是一种在核酸扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。qPCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。用于qPCR检测的荧光指示剂主要分为两大类：一类是荧光探针，如Taqman探针，分子信标探针；另一类是能与双链DNA结合的荧光染料，如SYBR Green和EvaGreen等。
早在20世纪70年代，科学家Korana就已经提出了核酸体外扩增的设想。1983年美国科学家Kery Mullis在研究核酸测序方法的时候产生了核酸体外扩增的灵感：利用试管模拟天然的DNA体内复制的过程。提供一系列合适的条件：包括模板DNA，荧光探针引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复兴和延伸的温度和时间，就可以成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。这个体外扩增DNA的技术经过后续一系列的优化和完善，也与1987年成功申请了全球首个PCR的发明专利 US Patent 4683202。
之后，随着PCR技术在临床和科研的使用和推广，后续不断有专利对PCR技术细节进行丰富和优化。1992年Higuchi等人首次提出了采用动态PCR的方法和封闭式荧光采集的方式对目的基因数量进行检测分析，即实时荧光定量PCR技术。实时荧光定量PCR分析是通过检测扩增产物量（产物标记荧光强度）与初始靶基因量直接相关而进行定量分析。扩增产物增加的荧光信号达到对数期的循环数Ct值（Cycle threshold）与把模板初始拷贝数的对数存在负相关的线性关系，即初始模板稀释一杯达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环数就要增加一个循环数（Ct）。扩增产物增加的信号可以通过产物DNA的荧光染料，如SybrGreen I显示，也可采用带猝灭基团的荧光探针进行检测如Taqman探针。带荧光猝灭基团的探针包括在qPCR技术利用Taq酶水解的荧光标记探针以及在水解荧光探针基础上增加结合效率的MGB探针。后续多种杂交探针类型，如茎环结构的杂交探针双杂交（FRET）探针等新型的探针虽然有相关的使用，但均在使用范围上有较大的局限性，并且，这些探针的灵敏度仍有待进一步加强。
除此之外，在临床检验应用过程中，经常会遇见由于检测方法灵敏度较低从而导致假阴性的出现；尤其是例如新型冠状病毒（2019-nCoV）的ORF1ab基因，由于其表达量较少，容易因检测方法的灵敏度较低而造成漏检。
因此，本领域需求一种能够提升PCR灵敏度，降低假阴性情况出现的方法和产品。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供了一种荧光定量PCR的方法，所述方法包括：
1）将上下游引物对、荧光探针以及PCR扩增试剂混合；
2）进行荧光定量PCR；
其中，所述荧光探针上带有两个淬灭基团，其中，第一淬灭基团位于3’末端，而第二淬灭基团标记在T碱基上且与所述第一淬灭基团相隔10~15nt。
使用本发明的荧光定量PCR方法能够降低荧光定量PCR中的本底信号，进一步提升PCR的灵敏度，降低检测假阴性的出现，并且还能够提高荧光定量PCR扩增效率。
不希望受到理论的束缚，单猝灭基团并不能完全猝灭荧光基团的荧光，从而导致本底信号较高，采用本发明的如上限定的双猝灭基团的荧光探针，进一步成功地降低本底信号，同时不影响反应的进行，从而提升PCR的灵敏度，并提高PCR扩增效率。
在优选的实施方案中，所述方法还包括混合有额外添加剂，所述额外添加剂为甲酰胺（Formamide）、SDS和Proclin类抗生素的任意一种或多种。
本发明的额外添加剂能进一步与带有双淬灭基团的荧光探针相配合，使得灵敏度进一步提升，检测结果更为准确。
在一些具体的实施方案中，本发明使用的额外添加剂的pH值在7.0~8.8之间，更优选地，本发明使用的PCR扩增试剂的pH值为7.5。
在一个具体的实施方案中，所述额外添加剂为甲酰胺（Formamide）、SDS和Proclin300，其浓度在添加至PCR反应液中后具有0.01%~0.05%（v/v）的终浓度。
进一步地，所述荧光探针的长度为18~35bp，更优选地，所述荧光探针的长度为22~28bp。
进一步地，所述荧光探针的Tm值为55~70℃，更优选地，所述荧光探针的Tm值为65~70℃。
进一步地，所述第二荧光探针的GC含量不超过60%。
猝灭基团可以选择BHQ1、BHQ2、MGB，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，所述第一猝灭基团和第二猝灭基团是同一种猝灭基团。第一和第二猝灭基团均可用本领域技术人员熟知的方法进行标记。
荧光探针还具有荧光基团，所述荧光基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
本发明所提及的“荧光定量PCR”是核酸扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样本中的特定核酸序列进行定量分析的方法。
本发明所提及的“PCR扩增试剂”是指用于实时荧光定量核酸扩增检测的试剂。本领域技术人员能够理解qPCR扩增试剂通常含有DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液等。例如当检测对象为RNA时，还可进一步包括逆转录酶。不难理解，本领域技术人员可以根据具体需要（例如样本的种类、含量等），确定PCR扩增试剂的成分和浓度。
第二方面，本发明提供了一种一步法荧光定量PCR的方法，所述方法包括：
1）将样本释放剂、上下游引物对、荧光探针、PCR扩增试剂，以及样本混合；
2）进行荧光定量PCR；
其中，所述荧光探针上带有两个淬灭基团，其中，第一淬灭基团位于3’末端，而第二淬灭基团标记在T碱基上且与所述第一淬灭基团相隔10~15nt；
并且，所述方法中不包括核酸的纯化和/或提取步骤。
本发明中提及的“样本释放剂”是指能够释放样本中核酸而无需进行核酸的纯化和/或提取就能用于PCR的化学试剂。例如强酸性或强碱性的化学试剂。示例性的样本释放剂可以是包括0.01~0.5mmol/L莎梵婷（surfactin）、100~200mmol/L氯化钾、50~200mmol/L氯化锂、质量/体积比为0.1%~1%十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1%~1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、质量/体积比为0.01%~2%十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05%~1%乙醇等组分中的一种或几种，但本发明不限于此。
本发明所提及的“一步法”是指样本免提取的核酸释放及扩增技术（ExtractionFree Nucleic Acid Release and Amplification Technology, EFNART）。其是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系，进行直接的样本核酸扩增检测。
使用本发明的方法，能够提升“一步法”的灵敏度，克服了“一步法”灵敏度低，检测结果不准确的缺陷，避免假阴性的出现，同时使用一步法又节约了时间，在极短时间内完成对核酸的检测，提升了检测效率（例如，给病人最早的带来准确的诊断结果和治疗方案，为阻碍重大传染病疫情的传播起到关键作用）。
本发明所提及的“样本”指的是含有待测核酸的物质，所述样本可以包括但不限于是动植物细胞、细菌、病毒、真菌等，以及包含这些在内的体液、组织、器官等。
特别地，本发明所提的样本为粘液、痰液、脓液和尿液等，由于此类样本需要利用保存液进行保存，在保存液中含有如抗生素、表面活性剂等一些干扰物质，在使用免核酸提取的检测方法时，灵敏度通常很低。
第三方面，本发明提供了一种用于荧光定量PCR的组合物，所述组合物包括上下游引物对、荧光探针以及PCR扩增试剂；
其中，所述荧光探针上带有两个淬灭基团，其中，第一淬灭基团位于3’末端，而第二淬灭基团标记在T碱基上且与所述第一淬灭基团相隔10~15nt。
进一步地，所述组合物还包括额外添加剂，所述额外添加剂为甲酰胺（Formamide）、SDS和Proclin类抗生素的任意一种或多种。
在一些具体的实施方案中，所述组合物中使用的额外添加剂的pH值在7.5~8.8之间，更优选地，本发明使用的PCR扩增试剂的pH值为8.5。
在一个具体的实施方案中，所述额外添加剂为SDS和Proclin 300，其浓度在添加至PCR反应液中后具有0.01%~0.05%（v/v）的终浓度。
进一步地，所述荧光探针的长度为18~35bp，更优选地，所述荧光探针的长度为22~28bp。
进一步地，所述荧光探针的Tm值为55~70℃，更优选地，所述荧光探针的Tm值为55~70℃。
进一步地，所述荧光探针的GC含量不超过60%。
猝灭基团可以选择BHQ1、BHQ2、MGB，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，所述第一猝灭基团和第二猝灭基团是同一种猝灭基团。
荧光探针还具有荧光基团，所述荧光基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
第四方面，本发明提供了上述组合物在用于制备荧光定量PCR的试剂盒中的用途。
进一步地，本发明提供了上述组合物在用于制备一步法荧光定量PCR的试剂盒中的用途。
第五方面，本发明提供了一种荧光定量PCR的试剂盒，所述试剂盒包括上述的组合物。
附图说明
图1-6为本发明组合物和对比例组合物检测新型冠状病毒（2019-nCoV）的检测结果。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明的双猝灭基团荧光探针提升PCR灵敏度
为了测评本发明中的探针的双猝灭设计方式的应用，考察其对PCR的影响。采用带有本发明的探针双猝灭设计方式与单一猝灭基团探针在PCR扩增试剂进行对比。在不改变引物序列以及扩增组分的前提下，考察同样的PCR扩增体系中的不同探针设计对弱阳性样本的核酸检测。对比的方法为用临床诊断为阳性的低浓度呼吸道合胞病毒（RSV）样本进行检测，同一份样本检测10次，验证对样本的阳性检出效率。每组的具体组分如表1所示。
表1不同探针设计方案的具体组分
Figure 315836DEST_PATH_IMAGE001
上述对比的实验中，考察探针的双猝灭设计，尤其是在不同碱基位置上的设计与单一猝灭基团的探针的对比。试验结果表明（表2）可以看出，本发明的扩增方案1和扩增方案2的探针设计，相对于没有双猝灭的常规设计的对比扩增方案，对于低浓度的RSV样本有明显提升检测效率的效果。但相对比较本发明的扩增方法1/2，虽然在不同的碱基上设计了第二个猝灭基团，但是对于扩增检测效率的影响几乎无区别，对于10例样本的检测效率无明显差异。该组实验结果显示对于同一条探针上的双猝灭基团的设计，在不同位置上的设计对检测效率无明显差异。
表2 10例低浓度核酸的不同扩增程序的扩增对比结果
Figure 983578DEST_PATH_IMAGE002
实施例2、本发明的双猝灭基团荧光探针以及额外添加剂提升PCR灵敏度
为了测评本发明中双猝灭探针及其PCR扩增试剂组分（0.02%甲酰胺 (v/v)、0.03%SDS（w/v）和0.01% Proclin 300 (v/v)）的应用，用同样的探针设计原理在呼吸道合胞病毒（RSV）的荧光探针设计上进行了对比修饰，及在探针碱基序列不改变的前提下，用本发明中的双猝灭基团方案和常规的探针设计（5’-FAM特异性探针序列-3’-BHQ1）进行同样的PCR扩增体系中的弱阳性样本的核酸检测。对比的方法为用临床诊断为阳性的RSV样本逐级的梯度稀释，稀释10倍（1:9，v/v），稀释100倍（1:99，v/v），稀释1000倍（1:999，v/v），稀释10000倍（1:9999，v/v），检测的方式为免核酸提取的样本直接扩增检测的方式，采取的方法是样本：样本释放剂：qPCR反应液=10:10:30（v/v/v）进行总体积为50μL的样本直接扩增方式，扩增程序如表3。每组的具体组分如表4所示。
表3 本发明采用的对核酸的扩增检测程序
Figure 855719DEST_PATH_IMAGE003
表4不同探针设计方案的具体组分
Figure 317925DEST_PATH_IMAGE004
表5的对比结果表明，对于本发明中的PCR扩增体系中的添加剂组分，在RSV样本免提取扩增的灵敏度方面有这显著的提升。在引物探针序列以及PCR扩增体系主要成分不变动的前提下，采取对探针的猝灭修饰方案进行优化，将较大幅度提升核酸检测能力。
表5 基于样本梯度稀释的灵敏度对比检测方案
Figure 541096DEST_PATH_IMAGE005
实施例3、本发明的双猝灭基团荧光探针以及额外添加剂提升PCR灵敏度
为了测评本发明中的引物探针设计方案以及添加剂组分（甲酰胺、SDS和Proclin300）的应用，将带有本发明的引物探针以及PCR添加剂试剂组成部分与无本发明的引物探针方案的常规3’端单一猝灭基团（BHQ1）进行对比分析。对比的方法为用临床诊断为阳性的3例新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸样本（样本01，样本02，样本03），以45μL PCR反应液+5μL核酸样本的方式进行对比测试。实时荧光定量PCR扩增检测程序如表3。每组的具体组分如表6所示。
表6 不同探针设计方案的具体组分
Figure 543687DEST_PATH_IMAGE006
从图1-6以及表7的扩增的对比结果来看，用同样的核酸模板用量以及引物探针用量的前提下，仅仅因为探针标记方式的改变和必须的添加剂组分，两者之间，尤其是基于FAM通道的ORF 1ab基因的扩增效率有非常明显的提升。因为在本发明的探针修饰方法对核酸试剂检测灵敏度的提升有明显的优势。
表7 本发明方案和对照方案对3例核酸样本扩增效果对比结果
Figure 34449DEST_PATH_IMAGE007
表7的对比结果表明，对于本发明中的探针修饰和添加剂组分，在PCR的灵敏度方面有这显著的提升。试剂盒的检测能力与Cycle threathold （Ct）值呈负相关的关系，及同等浓度下Ct值越小，则表示检测能力越高，Ct值越大，则表示检测能力越低，No Ct则表示无扩增。本发明中的探针修饰和添加剂对于核酸检测能力有明显的提升，但是对于不同的样本，PCR添加剂的提升效果存在着样本间的差异。
实施例4、本发明的双猝灭基团荧光探针以及额外添加剂提升一步法PCR灵敏度
在临床检验应用过程中，由于呼吸道样本的传染性很强，如新型冠状病毒、SARS、MERS冠状病毒等，以及常见的甲型流感病毒、乙型流感病毒等均有很强的致病性。因此在极短时间内完成对病毒的检测能够给病人最早的带来诊断结果和治疗方案。本发明中的双猝灭探针及配套PCR扩增添加剂组分的方案也用于样本快速检测的应用当中。该方案的主要特点包括两大方面：同样是无需要核酸处理的样本直接扩增，分别是1、在无需核酸提取纯化的前提下，利用带灭活功能的样本释放剂对采集的样本进行直接灭活，并释放出病毒中的核酸，搭配相关的PCR扩增试剂组分进行直接扩增检测；2、采用时间非常短的逆转录程序和PCR扩增程序，在不超过15-35分钟内完成对病毒的检测并给出检测结果。检测的方式为免核酸提取的样本直接扩增检测的方式，采取的方法是样本：样本释放剂：qPCR反应液=10:10:30（v/v/v）进行总体积为50μL的样本直接扩增方式。为了对比在快速检测中和常规检测中的检测效果，本实验方案采用了快速扩增程序和普通扩增程序下的本发明反应条件以及常规扩增程序下的常规探针设计方案对新冠病毒低浓度核酸样本和阴性样本的检测效率的对比。
表8 本发明方案中用于一步法PCR和常规PCR
Figure 933134DEST_PATH_IMAGE008
表9 10例低浓度核酸的不同扩增程序的扩增对比结果
Figure 378022DEST_PATH_IMAGE009
对10个低浓度样本检测结果来看，采用本发明的方案对低浓度的样本检测中全部检测出来，同时采用快速扩增方案的检测结果与常规扩增程序无差别，因此，实验结果证明了基于双猝灭探针设计的扩增检测方案既可以用于常规qPCR的扩增程序，也可以用于快速qPCR的扩增程序，并且在两个不同的扩增程序上无明显差异。本发明方案可以用于病毒的快速检测。对照方案当中采用无本发明的常规单猝灭基团的探针设计及组合方案，在常规扩增程序当中，对10例样本全部检出，但扩增的Ct值拖后；但用快速扩增程序当中，10个样本检测出阳性的只有4个，检测能力明显偏低。因此对比结果显示本发明中的方案可以用于RNA病毒的核酸快速诊断。
实施例5、本发明的双猝灭基团荧光探针以及额外添加剂提升PCR灵敏度
为了测评本发明中双猝灭探针及其PCR扩增试剂组分（甲酰胺（Formamide）、SDS和Proclin 300）的应用，用同样的探针设计原理在呼吸道腺病毒（ADV）的荧光探针设计上进行了对比修饰，及在探针碱基序列不改变的前提下，用本发明中的双猝灭基团方案和对照方案的扩增方案进行对比，进行同样的PCR扩增体系中的弱阳性样本的核酸检测。
四种方案的设计分别为（如表11所示）：
本发明方案：双猝灭荧光探针带添加剂组分的扩增试剂
对照方案1：仅含有双淬灭荧光探针的常规扩增试剂
对照方案2：仅单猝灭荧光探针的带添加剂的扩增试剂
对照方案3：仅单猝灭荧光探针的常规扩增试剂
对比的方法为用临床诊断为阳性的ADV样本逐级的梯度稀释，稀释10倍（1:9，v/v），稀释100倍（1:99，v/v），稀释1000倍（1:999，v/v），检测的方式为免核酸提取的样本直接扩增检测的方式，采取的方法是样本：样本释放剂：qPCR反应液=10:10:30（v/v/v）进行总体积为50μL的样本直接扩增方式，扩增程序如表10。
表10 本发明采用的对核酸的扩增检测程序
Figure 387567DEST_PATH_IMAGE010
表11 不同探针设计方案的具体组分
Figure 234300DEST_PATH_IMAGE011
表12的对比结果表明，在ADV样本免提取扩增的灵敏度方面有这显著的提升，本发明的扩增效率是最好的，明显优于基于常规荧光探针设计和常规PCR扩增试剂组分的方案。
除此之外，表12的对比结果还证明了，添加剂对双猝灭基团的优化作用明显好于对单猝灭基团的优化作用。在双猝灭基团体系中，添加剂对Ct值的提升大于1（具有数量级上的差异，Ct值相差1等同于模板量相差1倍），而在单猝灭基团体系中，添加剂对Ct值的提升却小于0.5（基本上等同于没有提升）。
表12基于样本梯度稀释的灵敏度对比检测方案
Figure 38308DEST_PATH_IMAGE012

Claims (6)

1.一种荧光定量PCR的方法，所述方法包括：
1）将上下游引物对、荧光探针以及PCR扩增试剂混合；
2）进行荧光定量PCR；
其中，所述荧光探针上带有两个淬灭基团，其中，第一淬灭基团位于3’末端，而第二淬灭基团标记在T碱基上且与所述第一淬灭基团相隔10~15nt；
其中，所述方法在1）中还混合有额外添加剂，所述额外添加剂为SDS和Proclin 300，其浓度在添加至PCR反应液中后具有0.01%~0.05%体积比的终浓度。
2.一种一步法荧光定量PCR的方法，所述方法包括：
1）将样本释放剂、上下游引物对、荧光探针、PCR扩增试剂，以及样本混合；
2）进行荧光定量PCR；
其中，所述荧光探针上带有两个淬灭基团，其中，第一淬灭基团位于3’末端，而第二淬灭基团标记在T碱基上且与所述第一淬灭基团相隔10~15nt；
并且，所述方法中不包括核酸的纯化和/或提取步骤；
其中，所述方法在1）中还混合有额外添加剂，所述额外添加剂为SDS和Proclin 300，其浓度在添加至PCR反应液中后具有0.01%~0.05%体积比的终浓度。
3.一种用于荧光定量PCR的组合物，所述组合物包括上下游引物对、荧光探针以及PCR扩增试剂；
其中，所述荧光探针上带有两个淬灭基团，其中，第一淬灭基团位于3’末端，而第二淬灭基团标记在T碱基上且与所述第一淬灭基团相隔10~15nt；
其中，所述组合物还包括额外添加剂，所述额外添加剂为SDS和Proclin 300，其浓度在添加至PCR反应液中后具有0.01%~0.05%体积比的终浓度。
4.如权利要求3所述的组合物在用于制备荧光定量PCR的试剂盒中的用途。
5.如权利要求3所述的组合物在用于制备一步法荧光定量PCR的试剂盒中的用途。
6.一种荧光定量PCR的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求3所述的组合物。
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