CN113652493A - 一种能减少三种荧光通道pcr竞争的生殖道pcr体系 - Google Patents
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Abstract
一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系，涉及分子生物学。所述生殖道PCR体系包括：包含6种生殖道病原体的六套引物与探针、dNTPs、无甘油热启动酶、MgCl2、冻干保护剂等。所述6种生殖道病原体为沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体、B族链球菌。所述沙眼衣原体和人型支原体的探针采用能降低荧光本底的双淬灭探针，以提高基因竞争双方的弱势一方的PCR扩增效率。可用于对性病感染生殖道病原体导致的不孕不育及孕期感染B族链球菌的检测。使用方便，操作简单，能够满足多种荧光通道竞争要求的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学，尤其是涉及一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系。
背景技术
不孕症是指一年未采取避孕措施，性生活正常而未能成功妊娠。研究表明，不孕症困扰着全球约16％的育龄夫妇。国内外的调查均表明，生物学因素中的输卵管因素是造成中国不孕症的首要因素。而生殖道病原体的感染是导致不孕不育的主要因素。支原体、衣原体和淋球菌是生殖道感染的主要病原菌，可引起男性尿道炎、女性阴道炎、宫颈炎、盆腔炎及不孕症等。
沙眼衣原体(CT)引起的性传播疾病是全世界近年来主要的导致不孕症的性传播疾病。CT感染的主要病理改变是慢性炎症，感染前期可能无明显临床症状，但是随着感染的发展，会引发组织损伤，后期还可形成瘢痕，对器官的正常功能造成影响。
淋病奈瑟菌(NG)为淋病的病原菌，可造成黏膜上皮的损伤，导致输卵管阻塞、粘连，从而影响黏膜上皮的正常分泌机制，导致不孕。淋球菌性附睾-睾丸炎可导致持续性的少精症、无精症。
感染生殖道的支原体中的主要包括解脲支原体(UU)、人型支原体(MH)和生殖器支原体(MG)三种类型。支原体可在生殖道细胞表面形成黏附，对正常的细胞进行杀伤从而引起子宫内膜、输卵管慢性炎症的发生，输卵管黏膜遭到损伤后，会造成输卵管粘连或阻塞；另外，UU、MH和MG还对输卵管纤毛的运动造成一定的影响，阻碍受精卵的形成，从而导致不孕症的发生。
B族链球菌呈阳性和母婴结局、胎膜早破等现象有密切相关，检测孕妇B族链球菌是保证母婴健康、安全的重要手段。早在20世纪90年代，CDC便制订了B族链球菌的检测、筛查及处理指南，AAP、ACOG提倡怀孕35～37周的孕妇进行B族链球菌的产前筛查，并对阳性者及早干预，把产妇的产褥病发病率及新生儿败血症感染率控制在最低范围内。目前临床用于生殖道感染病原体检测的方法有培养技术、免疫技术和PCR技术等，这些技术在临床诊断中已发挥巨大的作用，但仍存在一些缺点。培养技术繁琐而费时；免疫技术要有特异的抗血清。对于多种荧光通道的荧光PCR体系，相应的引物探针会形成竞争，导致多通道体系的灵敏度下降，也会产生假阳的现象。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的多种荧光通道的荧光PCR体系中，相应的引物探针会形成竞争，导致多通道体系灵敏度下降，产生假阳现象等问题，提供能同时检测生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体和B族链球菌6种核酸的一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系。
本发明所述能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系包括：包含6种生殖道病原体的六套引物与探针、dNTPs、无甘油热启动酶、MgCl2、冻干保护剂等。
所述6种生殖道病原体为沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体、B族链球菌；
所述六套引物与探针为：
沙眼衣原体：
上游引物：ACCTTTTTTCGCTGTTTTTGTCTT；
下游引物：AAAGAGAGATAGCAGAGAAATACGGAGT；
探针：TGTCGCTTCTCGCTATCATATCATTCGAGC。
淋病奈瑟菌：
上游引物：CACCCCCACGGCGATT；
下游引物：CAGCACATAACGCATAGCGAAA；
探针：CACCATCGTCCGTATGGCGCA。
解脲支原体：
上游引物：TACTTCACGAGCAGATTGCATTA；
下游引物：TGCAAGAAGACGTTTAGCTAGAGG；
探针：CTTACCATCTCTTGCCCCTTCCACTAC。
人型支原体：
上游引物：ACCTTCGGGTTATGCTGATGTT；
下游引物：GGAAAAACCGCACTGTTAACTCTT；
探针：AACACATAAGACGTTACGCGGCACTCG。
生殖支原体：
上游引物：TGCTTTAAAATCCCTTCCAAATAGTT；
下游引物：TCACCTTGTTGGGTTGGTAGAGT；
探针：CCTATGATACCAATCCTACCCTCTCA。
B族链球菌
上游引物：ATGGCAGCTTCGCTATTATCAGT；
下游引物：AAATCAGCCTTTACCTCTGAAACAG；
探针：CACAAGAAACAGATACGACGTGGACAGCAC。
所述冻干保护剂由3％～13％海藻糖，0.5％～2％甘露醇，1％～2.5％PEG 6000，0.2～3mg/mL BSA蛋白组成。
所述沙眼衣原体、人型支原体、B族链球菌的探针采用能降低荧光本底的双淬灭探针，以提高基因竞争双方的弱势一方的PCR扩增效率。
所述沙眼衣原体、淋病奈瑟菌为一管PCR检测体系，解脲支原体、人型支原体为一管PCR检测体系，生殖支原体与B族链球菌为1管检测体系。
所述沙眼衣原体、淋病奈瑟菌检测体系中沙眼衣原体为双淬灭探针。
所述解脲支原体、人型支原体检测体系中人型支原体为双淬灭探针。
所述生殖支原体、B族链球菌检测体系中B族链球菌为双淬灭探针。
本发明可用于临床生殖道样本检测，其中样本包括生殖道拭子、尿液。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点和技术效果：
本发明可以用于对性病感染生殖道病原体导致的不孕不育及孕期感染B族链球菌的检测。本发明将沙眼衣原体、淋病奈瑟菌，解脲支原体、人型支原体，生殖支原体，B族链球菌六套引物和探针配制成三份液体试剂，能同时检测生殖道沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体和B族链球菌6种核酸，使用方便、操作简单，能够满足多种荧光通道竞争要求的灵敏度。
附图说明
图1为试剂冻干后的图片。
图2为本发明体系和不含双淬灭探针体系对含有沙眼衣原体基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。其中，a为本试剂体系；b为不含双淬灭探针的体系。
图3为本发明对含有淋球菌基因的克隆菌提取核酸并进行灵敏度试验的结果。
图4为本发明对含有解脲支原体基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。
图5为本发明体系和不含双淬灭探针体系对含有人型支原体基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。其中，a为本试剂体系；b为不含双淬灭探针的体系。
图6为本发明对含有生殖支原体基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。
图7为本发明体系和不含双淬灭探针体系对含有B族链球菌基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。其中，a为本试剂体系；b为不含双淬灭探针的体系。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例将结合附图对本发明进行作进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例能同时区分6种生殖道病原体，其核酸冻干试剂包括含有3％～13％海藻糖，0.5％～2％甘露醇，1％～2.5％PEG6000，0.2mg～3mg/mL BSA蛋白的冻干保护剂，所述冻干保护剂中含有生殖道病原体沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体和B族链球菌六套引物和能降低荧光本底的双淬灭探针。其探针引物序列如表1所示。
表1
所述冻干试剂的配置过程为：
将含有2％～10％海藻糖，2％～5％葡聚糖，0.5％～2％PEG8000，0.01～0.02mg/mL BSA蛋白的保护与沙眼衣原体、淋病奈瑟菌，解脲支原体、人型支原体，生殖支原体，B族链球菌六套引物和探针按常规方法配制成三份液体试剂。所述三份液体试剂分别为：(1)管1：沙眼衣原体(双淬灭探针)、淋病奈瑟菌、内参引物探针及PCR缓冲液、冻干保护剂；(2)管2：解脲支原体、人型支原体(双淬灭探针)、内参引物探针及PCR缓冲液、冻干保护剂；(3)管3：生殖支原体、B族链球菌(双淬灭探针)、内参引物探针及PCR缓冲液、冻干保护剂；然后将液体试剂分装至八连管内，将耗材放置冻干机中进行真空冷冻干燥即可。试剂冻干后的图片如图1。
表2
| 组分 | 浓度 | 体积(/mL) |
| PCR缓冲液 | 10× | 250 |
| dNTPs | 10mM | 112.5 |
| CT/NG/内参上游引物 | 50μM | 10 |
| CT/NG/内参下游引物 | 50μM | 10 |
| CT/NG/内参探针 | 50μM | 5 |
| MgCl<sub>2</sub> | 25mM | 175 |
| BSA | 500mg/mL | 12.5 |
| PEG-6000 | 500mg/mL | 12.5 |
| 海藻糖 | 500mg/mL | 80 |
| 甘露醇 | 500mg/mL | 12.5 |
| Taq酶 | 5U/μL | 37.5 |
| UNG酶 | 2U/μL | 2.5 |
表3
| 组分 | 浓度 | 体积(/mL) |
| PCR缓冲液 | 10× | 250 |
| dNTPs | 10mM | 112.5 |
| MH/UU/内参上游引物 | 50μM | 10 |
| MH/UU/内参下游引物 | 50μM | 10 |
| MH/UU/内参探针 | 50μM | 5 |
| MgCl<sub>2</sub> | 25mM | 175 |
| BSA | 500mg/mL | 12.5 |
| PEG-6000 | 500mg/mL | 12.5 |
| 海藻糖 | 500mg/mL | 80 |
| 甘露醇 | 500mg/mL | 12.5 |
| Taq酶 | 5U/μL | 37.5 |
| UNG酶 | 2U/μL | 2.5 |
表3
| 组分 | 浓度 | 体积(/mL) |
| PCR缓冲液 | 10× | 250 |
| dNTPs | 10mM | 112.5 |
| GBS/MG/内参上游引物 | 50μM | 10 |
| GBS/MG/内参下游引物 | 50μM | 10 |
| GBS/MG/内参探针 | 50μM | 5 |
| MgCl<sub>2</sub> | 25mM | 175 |
| BSA | 500mg/mL | 12.5 |
| PEG-6000 | 500mg/mL | 12.5 |
| 海藻糖 | 500mg/mL | 80 |
| 甘露醇 | 500mg/mL | 12.5 |
| r-Taq酶 | 5U/μL | 37.5 |
| UNG酶 | 2U/μL | 2.5 |
本发明实施例试剂冻干采用宁波新芝原位型冷冻干燥机(Scientz-10ND)进行冷冻干燥,程序如表5：
表5
| 温度 | 时间 | 是否抽真空 |
| -50℃ | 6h | 否 |
| -45℃ | 3h | 是 |
| -40℃ | 3h | 是 |
| -35℃ | 2h | 是 |
| -30℃ | 2h | 是 |
| -25℃ | 1h | 是 |
| -20℃ | 1h | 是 |
| -15℃ | 1h | 是 |
| -10℃ | 1h | 是 |
| -5℃ | 1h | 是 |
| 0℃ | 1h | 是 |
| 10℃ | 1h | 是 |
| 20℃ | 1h | 是 |
本发明实施例PCR体系和不含双淬灭探针体系对含有沙眼衣原体基因的克隆菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果见图2。不同浓度梯度的沙眼衣原体基因的克隆菌样本扩增曲线均呈S型，本试剂体系在样本浓度为1×104copies/mL、1×103copies/mL的沙眼衣原体基因的克隆菌的Ct值分别为32.14、35.51；不含双淬灭探针体系在样本浓度为1×104copies/mL、1×103copies/mL的沙眼衣原体基因的克隆菌的Ct值分别为35.49、41.66。
本发明实施例对含有淋球菌基因的克隆菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果见图3。不同浓度梯度的淋球菌基因的克隆菌样本扩增曲线均呈S型，浓度为1×104copies/mL、1×103copies/mL的淋球菌基因的克隆菌的Ct值分别为32.05、35.69。
本发明实施例对含有解脲支原体基因的克隆菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果见图4。不同浓度梯度的解脲支原体基因的克隆菌样本扩增曲线均呈S型，浓度为1×104copies/mL、1×103copies/mL的解脲支原体基因的克隆菌的Ct值分别为32.96、36.14。
本发明实施例对含有人型支原体基因的克隆菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果见图5。不同浓度梯度的人型支原体基因的克隆菌样本扩增曲线均呈S型，本试剂体系在样本浓度为1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL、1×103copies/mL的人型支原体基因的克隆菌的Ct值分别为32.01、35.38；不含双淬灭探针体系在样本浓度为1×104copies/mL、1×103copies/mL的人型支原体基因的克隆菌的Ct值分别为35.15、38.59。本发明实施例对含有生殖支原体基因的克隆菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果见图6。不同浓度梯度的生殖支原体基因的克隆菌样本扩增曲线均呈S型，浓度为1×104copies/mL、1×103copies/mL的生殖支原体基因的克隆菌的Ct值分别为33.12、36.37。
本发明实施例对含有B族链球菌基因的克隆菌提取核酸，并进行灵敏度试验的结果见图7。不同浓度梯度的B族链球菌基因的克隆菌样本扩增曲线均呈S型，本试剂体系在样本浓度为1×104copies/mL、1×103copies/mL的B族链球菌基因的克隆菌的Ct值分别为32.01、34.92；不含双淬灭探针体系在样本浓度为1×104copies/mL、1×103copies/mL的B族链球菌基因的克隆菌的Ct值分别为35.37、37.64。
图2给出本发明体系和不含双淬灭探针体系对含有沙眼衣原体基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。图3给出本发明对含有淋球菌基因的克隆菌提取核酸并进行灵敏度试验的结果。图4给出本发明对含有解脲支原体基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。图5给出本发明体系和不含双淬灭探针体系对含有人型支原体基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。图6给出本发明对含有生殖支原体基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。图7给出本发明体系和不含双淬灭探针体系对含有B族链球菌基因的克隆菌提取核酸进行灵敏度试验的结果。由图2～7可以看出，添加双猝灭探针对FAM通道检测项目的灵敏度有大幅度的提高。
Claims (9)
1.一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系，其特征在于所述PCR体系包括dNTPs、无甘油热启动酶、MgCl2、冻干保护剂和包含6种生殖道病原体的六套引物与探针；所述6种生殖道病原体为沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体、B族链球菌。
2.如权利要求1所述一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系，其特征在于所述六套引物与探针为：
沙眼衣原体：
上游引物：ACCTTTTTTCGCTGTTTTTGTCTT；
下游引物：AAAGAGAGATAGCAGAGAAATACGGAGT；
探针：TGTCGCTTCTCGCTATCATATCATTCGAGC；
淋病奈瑟菌：
上游引物：CACCCCCACGGCGATT；
下游引物：CAGCACATAACGCATAGCGAAA；
探针：CACCATCGTCCGTATGGCGCA；
解脲支原体：
上游引物：TACTTCACGAGCAGATTGCATTA；
下游引物：TGCAAGAAGACGTTTAGCTAGAGG；
探针：CTTACCATCTCTTGCCCCTTCCACTAC；
人型支原体：
上游引物：ACCTTCGGGTTATGCTGATGTT；
下游引物：GGAAAAACCGCACTGTTAACTCTT；
探针：AACACATAAGACGTTACGCGGCACTCG；
生殖支原体：
上游引物：TGCTTTAAAATCCCTTCCAAATAGTT；
下游引物：TCACCTTGTTGGGTTGGTAGAGT；
探针：CCTATGATACCAATCCTACCCTCTCA；
B族链球菌
上游引物：ATGGCAGCTTCGCTATTATCAGT；
下游引物：AAATCAGCCTTTACCTCTGAAACAG；
探针：CACAAGAAACAGATACGACGTGGACAGCAC。
3.如权利要求1所述一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系，其特征在于所述冻干保护剂由3％～13％海藻糖，0.5％～2％甘露醇，1％～2.5％PEG 6000，0.2～3mg/mL BSA蛋白组成。
4.如权利要求1所述一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系，其特征在于所述沙眼衣原体、淋病奈瑟菌为一管PCR检测体系，解脲支原体、人型支原体为一管PCR检测体系，生殖支原体与B族链球菌为1管检测体系。
5.如权利要求4所述一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系，其特征在于所述沙眼衣原体、淋病奈瑟菌检测体系中沙眼衣原体采用双淬灭探针。
6.如权利要求4所述一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系，其特征在于所述解脲支原体、人型支原体检测体系中人型支原体采用双淬灭探针。
7.如权利要求4所述一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系，其特征在于所述生殖支原体、B族链球菌检测体系中B族链球菌采用双淬灭探针。
8.如权利要求1所述一种能减少三种荧光通道PCR竞争的生殖道PCR体系在生殖道样本检测中的应用。
9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述样本包括生殖道拭子、尿液。
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