CN110343777A - 四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病原微生物的检测技术领域，尤其涉及四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法。所述试剂盒中包含MG/MH/UU/UP保守区域特异的引物对和Taqman荧光探针，该试剂盒通过实时荧光定量PCR，能快速、准确地将MG/MH/UU/UP感染样本检测出来并进行鉴别诊断，特异性高，使用方便快捷，区分度好。

Description

四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检 测方法
技术领域
本发明涉及病原微生物的检测技术领域，尤其涉及四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法。
背景技术
支原体(mycoplasma)是一类没有细胞壁、高度多形性、能通过滤菌器、可用人工培养基培养增殖的最小原核细胞型微生物，大小为0.1～0.3微米。支原体主要以二分裂方式繁殖，亦可以出芽方式繁殖，分枝形成丝状后断裂呈球杆状颗粒。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，最适pH值为7.8～8.0。在固体培养基上培养，形成典型的“荷包蛋”状菌落。由于能形成丝状与分枝形状，故称为支原体。
支原体广泛存在于人和动物体内，大多不致病，对人致病的支原体主要有肺炎支原体、生殖器支原体、人型支原体、脲原体等。其中生殖器支原体、人型支原体、脲原体是引起人类泌尿生殖道感染的病原体，通过性接触传播，引起尿道炎、前列腺炎等泌尿生殖道感染；亦可经胎盘传播引起早产、自然流产、先天畸形、死胎和不孕症等，经产道感染可致新生儿肺炎或脑膜炎。因此阴道泌尿道支原体的鉴别诊断，尤其是针对备孕前检测、孕期检测、产前检测均至关重要。
生殖支原体(M.genitalium，MG)，首次于1981年从非淋菌性尿道炎的两位男性尿道标本中分离出，随后从泌尿生殖道、直肠、呼吸道、滑膜液中均分离出该病原体。人群中流行率平均为0.8-4.1％，性病门诊感染率更高，平均为4.0-19.4％，女性生殖支原体感染中，30.4％同时合并感染淋病，25.0％合并感染衣原体。HIV感染中2-33％同时感染生殖支原体。男性感染生殖支原体可表现为剂型非淋菌性尿道炎、持续性尿道炎、附睾炎、直肠炎等；女性表现为尿道炎、宫颈炎、盆腔炎、不孕、早产、异位妊娠等。
人型支原体(M.hominis，MH)，存在于泌尿系和生殖器中，可以引起泌尿系的感染和生殖器的炎症。男性感染人型支原体，在急性期，患者通常会出现会阴部位有胀痛感。腰痛，双股内侧的不适感和提肛动作时的刺痛感，严重的患者还有可能会病发前列腺炎和附睾炎；女性感染人型支原体，大部分病人通常不会有任何症状。但是也有少数病情比较严重的患者会出现阴道坠胀感，尿频，尿急等。当该病原体蔓延到宫颈后，女性朋友会出现白带增多，混浊，子宫颈有水肿，充血甚至是糜烂。
脲原体可定植于尿道、生殖道黏膜上皮细胞表面，直接性接触是脲原体感染的主要传播途径，是一种阴道共生菌属，正常人可携带而不致病，当机体内环境改变及抵抗力下降时才致病。脲原体可引起非淋菌性尿道炎、宫颈炎、子宫肌炎、子宫内膜炎、输卵管卵巢炎、盆腔脓肿及盆腔结缔组织炎；另外研究发现，脲原体阳性的精液中精子的活动力差，含量少，畸形精子比例高，脲原体在不明原因不孕妇女中的检出率明显高于正常人群，因此脲原体可引起不孕不育；解脲脲原体是早产孕妇的羊水中最常检测到的微生物，脲原体在胎盘中的出现与自然流产、早产、胎膜早破、绒毛膜羊膜炎、产后发热等的发生有关。
脲原体根据其基因组差异，可分为2个生物型14个亚型，生物型1(Ureaplasmaparvum，UP，细小脲原体)和生物型2(Ureaplasma urealyticum，UU，解脲脲原体)，其中4种细小脲原体，UP1、UP3、UP6、UP14；10种解脲脲原体，UU2、UU4、UU5、UU7、UU8、UU9、UU10、UU11、UU12、UU13。
目前，生殖支原体(MG)、人型支原体(MH)、解脲脲原体(UU)、细小脲原体(UP)的检测方法主要为分离培养法，但生殖支原体(MG)培养困难，通常需要1-2个时间，而且培养法无法区分解脲脲原体(UU)和细小脲原体(UP)。
实时定量PCR检测平台已成为最简捷和可靠的核酸检测方法，在目前国内外的核酸诊断中应用最为广泛，国内已有阴道泌尿道支原体单独检测的试剂盒上市，但还没有针对MG/MH/UU/UP联合检测并进行鉴别诊断的荧光定量PCR试剂盒产品。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法。本发明提供的生殖支原体、人型支原体、解脲脲原体和细小脲原体多重检测的引物、探针组所针对的靶基因片段较小，特异性较强，且灵敏度较高。
本发明提供的四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组，其包括：
用于检测生殖支原体的SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；和
用于检测人型支原体的SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针；和
用于检测解脲脲原体的SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针；和
用于检测细小脲原体的SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针。
本发明选择生殖支原体(MG)粘附蛋白mgpC保守区域，人型支原体(MH)/解脲脲原体(UU)/细小脲原体(UP)16SrRNA序列、β-珠蛋白基因(HBB，内标)保守区域，设计特异性引物和探针，利用实时荧光定量PCR技术，制成MG/MH/UU/UP鉴别诊断的实时荧光定量PCR检测试剂盒，并介绍了其使用方法。
本发明中，SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针针对生殖支原体(MG)的粘附蛋白mgPC设计，所述MG特异性靶基因片段长度为129bp；序列为：
AGTAAGAATGTTACTGCTTACACCCCCTTCGCCACCCCCATCACCGATTCTAAAAGTGATCTGGTTAGTTTGGCACAACTTGATTCTTCTTATCAAATCGCTGACCAAACCATCCATAACACCAACCTG(SEQ ID NO:14)。
本发明中，SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针针对人型支原体(MH)的16SrRNA设计，所述MH特异性靶基因片段长度为178bp；序列为：
TCTACCTTTTAGATTGGAATACCCATTGGAAACAATGGCTAATGCCGGATACGCATGGAACCGCATGGTTCCGTTGTGAAAGGCGCTGTAAGGCGCCACTAAAAGATGAGGGTGCGGAACATTAGTTAGTTGGTGAGGTAATGGCCCACCAAGACTATGATGTTTAGCCGGGTCGAGA(SEQ ID NO：15)。
本发明中，SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针针对解脲脲原体(UU)的16SrRNA设计，所述UU特异性靶基因片段长度为164bp；序列为：
GGTGAACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTACCCTTAAGTTGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGAATAATAACATCAATATCGCATGAGAAGATGTAGAAAGTCGCGTTTGCGACGCTTTTGGATGGGGGTGCGACGTATCAGATAGTTGGTG(SEQ ID No.16)。
本发明中，SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针针对细小脲原体(UP)的16SrRNA设计，所述UP特异性靶基因片段长度为168bp；序列为：
GGTGAACGGGTGAGTAACACGTATCCAATCTACCCTTAAGTTGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGAATAATAACATCAATATCGCATGAGAAGATGTAGAAAGTCGCTCTTTGTGGCGACGCTTTTGGATGAGGGTGCGACGTATCAGATAGTTGGTG(SEQ ID No.17)。
本发明所述的引物和探针具有良好的准确性、灵敏度、特异性，即便在同一个扩增体系中进行检测，也能够良好的区分MG、MH、UU和UP。
本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
具体的，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。
SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团JOE，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
本发明还提供了生殖支原体、人型支原体、解脲脲原体、细小脲原体鉴别诊断的试剂盒，其包括本发明所述的引物、探针组。
本发明提供的试剂盒中，还包括对内参基因HBB检测的引物对和探针；
所述针对内参基因HBB检测的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示；所述针对内参基因HBB检测的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。所述HBB特异性靶基因片段序列为：TCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATG(SEQID NO：18)。本发明提供的试剂盒中，SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团TAMRA，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
本发明提供的试剂盒中，还包括荧光定量PCR检测试剂和/或样本提取试剂；
所述荧光定量PCR检测试剂包括qPCR Master Mix酶混合液、qPCRMaster Mix反应缓冲液；
所述qPCR Master Mix酶混合液，包括Taq酶和UNG酶，所述的Taq酶为AnstartTaqDNA聚合酶，所述的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。
所述样本提取试剂包括NaOH、TritonX-100和TE缓冲液。
所述样本提取液包括NaOH终浓度为0.01％～0.5％，优选为0.1％。
所述样本提取液包括TritonX-100终浓度为0.01％～0.5％，优选为0.1％。
本发明提供的试剂盒中，还包括阳性对照和/或阴性对照；
本发明的阴性对照品为DEPC水；
本发明的阳性对照品为含有生殖支原体、人型支原体、解脲脲原体、细小脲原体靶基因片段的质粒溶液。
本发明还提供了检测并区分生殖支原体、人型支原体、解脲脲原体、细小脲原体的方法，其包括：以本发明所述的试剂盒，对待测样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，产生S型扩增曲线则为阳性。
本发明所述的方法中，所述实时荧光定量PCR的体系包括：
体系中，所述引物浓度为100～1000nM，优选为500nM。所述探针浓度为10～500nM，优选为200nM。
本发明所述的方法中，所述实时荧光定量PCR的程序包括：
50℃2分钟；
95℃5分钟预变性；
95℃15秒→60℃35秒，45个循环。
对于结果的判断，具体包括：
待检样品DNA的扩增曲线Ct值<38且有典型S型扩增曲线，为阳性结果；
待检样品DNA的扩增曲线Ct值等于45(或显示为Undet)或无典型S型扩增曲线，为阴性结果；
待检DNA样品的扩增曲线38≤Ct值<45，为灰色区域，如重测结果仍为Ct值<45，且有典型S型扩增曲线，则判定为阳性结果；如Ct值仍不显示或无典型S型扩增曲线，则判定为阴性结果。
待检样品MG、MH、UU、UP均为阴性的情况下，考察HBB扩增情况，或HBB没有S型扩增曲线，或者Ct值大于35，表明取样失败、提取失败或加样错误，需重新试验。
对于设置阳性对照的实验，还应满足：阳性对照，CY5通道、FAM通道、ROX、JOE通道均有明显的扩增，具有典型S型扩增曲线，且Ct值小于30；
对于设置阴性对照的实验，还应满足：阴性对照，CY5通道、FAM通道、ROX、JOE通道Ct值＝45(或显示为undet)或无典型S型扩增曲线，进行后续判断，否则应进行问题查找。
本发明所述的引物和探针可用于多种来源样品的检测。对生物样品的检测可以判断该样品是否被MG、MH、UU或UP感染，而对非生物样品的检测可以判断该样品是否被MG、MH、UU或UP污染。因此，本发明所述的试剂盒可用于样品的非诊断目的的检测。本发明中，所述检测的样品来自阴道、医疗器械、药品、食品或化妆品。一些具体实施例中，所述的待测样品阴道分泌物或泌尿道分泌物。
本发明的有益效果至少包括：
(1)发明针对MG/MH/UU/UP/HBB的保守区域，共特异性设计了8条引物和5条Taqman探针，与目的基因的保守区域结合，具有很高的特异性，与铜绿假单胞菌菌株CMCC10104、金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29108、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29204、干酪乳杆菌株CMCC34103、大肠埃希氏菌株CMCC44103、变形杆菌株CMCC49102、伤寒沙门氏菌株CMCC50096、福氏志贺氏菌株CMCC51573、白色念珠菌株CMCC98001、人型支原体(MH)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人巨细胞病毒(HCMV)、肺炎支原体(MP)、沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、人类基因组均没有交叉反应；
(2)MG/MH/UU/UP4种病原物的检测在同一管内完成，并通过不同荧光标记探针加以区分，临床上可通过一次样本核酸提取、一次核酸加样，完成3种病原物的同步检测，有效降低以往单管检测带来的检测成本过高问题，并有效改善单管检测的操作繁琐情况；
(3)靶标基因片段较短，均在100～180bp之间，若过短会影响UNG酶的去污染效果，若过长会造成反应效率下降，因此本发明既能有效避免污染，又能保证反应的高效性和灵敏度；
(4)在反应管内加入人类β-珠蛋白基因特异性引物探针，可有效监控样本采样、样本提取、PCR检测全过程，克服提取过程中加入外标，不能有效监控样本采样成功与否的弊端。
本发明试剂盒非常适合临床使用和推广，对阴道泌尿道支原体的感染和鉴别诊断具有重要的意义。
附图说明
图1为实施例4特异性实验的荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1：铜绿假单胞菌菌株CMCC10104、2：金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、3：脑膜炎奈瑟菌株CMCC29108、4：干酪乳杆菌株CMCC34103、5：大肠埃希氏菌株CMCC44103、6：变形杆菌株CMCC49102、7：伤寒沙门氏菌株CMCC50096、8：福氏志贺氏菌株CMCC51573、9：白色念珠菌株CMCC98001、10：人型支原体(MH)、11：单纯疱疹病毒(HSV)、12：人乳头瘤病毒(HPV)、13：人巨细胞病毒(HCMV)、14：肺炎支原体(MP)、15：淋球菌(NG)、16：沙眼衣原体(CT)及17：人正常基因组、18：阳性对照品。
具体实施方式
本发明提供了四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：用于快速检测MG/MH/UU/UP的引物探针对的设计
下载NCBI中生殖支原体mgpC序列、人型支原体/解脲脲原体/细小脲原体的16SrRNA序列、HBB基因序列，设计引物对和探针，序列如下：
表1引物和探针序列
实施例2：用于快速检测MG/MH/UU/UP的实时荧光定量PCR试剂盒的建立
用于快速检测人MG/MH/UU/UP鉴别诊断的实时荧光定量PCR试剂盒，包括反应混合液、样本提取液、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体。
其中反应混合液，含有上下游引物和探针(SEQ ID NO：1～13)、Anstart qPCRMaster Mix酶混合液、Anstart qPCR Master Mix5×反应缓冲液。
其中Anstart qPCR Master Mix酶混合液、Anstart qPCR Master Mix5×反应缓冲液由菲鹏生物股份有限公司提供，Anstart qPCR Master Mix酶混合液稀释25倍使用，Anstart qPCR Master Mix5×反应缓冲液稀释5倍使用。
其中引物MG-F、MG-R、MH-F、MH-R、UUUP-F、UUUP-R、HBB-F、HBB-R终浓度500nM。
其中探针MG-P、MH-P、UU-P、UP-P、HBB-R浓度为200nM。
其中MG-P探针荧光基团为Cy5，猝灭基团为BHQ3，MH-P探针荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1，UU-P探针荧光基团为ROX，猝灭基团为MGB，UP-P探针荧光基团为JOE，猝灭基团为BHQ2；HBB-P探针荧光基团为TAMRA，猝灭基团为BHQ-2。
其中样本提取液为含0.1％NaOH、0.1％TritonX-100的TE缓冲液。
其中阳性对照品，为含有MG/MH/UU/UP/HBB靶基因片段的质粒溶液，浓度为10000拷贝/μL，对应的Ct值均在在23左右。
其中MG特异性靶基因片段序列为：
AGTAAGAATGTTACTGCTTACACCCCCTTCGCCACCCCCATCACCGATTCTAAAAGTGATCTGGTTAGTTTGGCACAACTTGATTCTTCTTATCAAATCGCTGACCAAACCATCCATAACACCAACCTG(SEQ ID NO:14)。
其中MH特异性靶基因片段序列为：
TCTACCTTTTAGATTGGAATACCCATTGGAAACAATGGCTAATGCCGGATACGCATGGAACCGCATGGTTCCGTTGTGAAAGGCGCTGTAAGGCGCCACTAAAAGATGAGGGTGCGGAACATTAGTTAGTTGGTGAGGTAATGGCCCACCAAGACTATGATGTTTAGCCGGGTCGAGA(SEQ ID NO：15)。
其中UU特异性靶基因片段序列为：
GGTGAACGGGTGAGTAACACGTATCCAACCTACCCTTAAGTTGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGAATAATAACATCAATATCGCATGAGAAGATGTAGAAAGTCGCGTTTGCGACGCTTTTGGATGGGGGTGCGACGTATCAGATAGTTGGTG(SEQ ID No.16)。
其中UP特异性靶基因片段序列为：
GGTGAACGGGTGAGTAACACGTATCCAATCTACCCTTAAGTTGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGAATAATAACATCAATATCGCATGAGAAGATGTAGAAAGTCGCTCTTTGTGGCGACGCTTTTGGATGAGGGTGCGACGTATCAGATAGTTGGTG(SEQ ID No.17)。
其中HBB特异性靶基因片段序列为：
TCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATG(SEQ IDNo.18)。
其中阴性对照品为DEPC水。
实施例3：MG/MH/UU/UP核酸检测试剂盒的快速检测方法
利用实施例2的试剂盒快速检测人阴道分泌物中的MG/MH/UU/UP，具体步骤如下：
(1)核酸提取：向女性阴道分泌物(5份，编号1-5)、男性尿道分泌物(5份，编号6-10)(其中1-6、2-7、3-8、4-9、5-10分别为夫妻二人)(采用培养法测定是否被MG、MH、UU或UP感染，该方法为目前行业金标准)收集管中加入1mL生理盐水，充分振荡洗涤棉拭子，然后将棉拭子靠壁挤干丢弃，取500μL液体转移至1.5mL的离心管中，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入1mL生理盐水，打散沉淀，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入已振荡混匀的样本提取液50μL，漩涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，100℃干浴或者水浴10分钟，13000rpm离心5分钟，上清液用于PCR反应(吸取时不用触动管子底部的沉淀物)。
(2)实时定量荧光PCR：利用上述MG/MH/UU/UP实时荧光定量PCR检测试剂盒进行PCR扩增反应，分别以提取的待检样品DNA、阳性对照和阴性对照各5μL为模板，与试剂盒的反应混合液20μL混合，进行实时荧光定量PCR反应，PCR反应条件设置为：50℃2分钟UNG酶去污染，95℃5分钟预变性，95℃15秒→60℃35秒，Cy5、FAM、ROX、JOE、TARMA通道用于收集检测荧光信号，共45个循环。
(3)结果判断：
①应满足：阳性对照，FAM通道、CY5通道、ROX通道、JOE通道均有明显的扩增，具有典型S型扩增曲线，且Ct值小于30；阴性对照，FAM通道、CY5通道、ROX通道、JOE通道Ct值＝45(或显示为undet)或无典型S型扩增曲线，进行后续判断，否则应进行问题查找；
②待检样品DNA的扩增曲线Ct值<38且有典型S型扩增曲线，为阳性结果；
③待检样品DNA的扩增曲线Ct值等于45(或显示为Undet)或无典型S型扩增曲线，为阴性结果；
④待检DNA样品的扩增曲线38≤Ct值<45，为灰色区域，如重测结果仍为Ct值<45，且有典型S型扩增曲线，则判定为阳性结果；如Ct值仍不显示或无典型S型扩增曲线，则判定为阴性结果；
⑤待检样品MG、MH、UU、UP均为阴性的情况下，考察HBB扩增情况，或HBB没有S型扩增曲线，或者Ct值大于35，表明取样失败、提取失败或加样错误，需重新试验。
判定结果如表2：
表2样品检测结果
结果显示，MG阳性样品2份，MH阳性样品3份，UU阳性样品4份，UP阳性样本6份，其中全阴性样品2份。结果与现有技术鉴定一致，准确率可达100％。另外还得出一个结论，夫妻之间共同传染几率非常高，检测人群中达到95％。
实施例4：特异性实验
利用实施例2中的试剂盒、实施例3的方法分别对铜绿假单胞菌菌株CMCC10104、金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29108、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29204、干酪乳杆菌株CMCC34103、大肠埃希氏菌株CMCC44103、变形杆菌株CMCC49102、伤寒沙门氏菌株CMCC50096、福氏志贺氏菌株CMCC51573、白色念珠菌株CMCC98001、人型支原体(MH)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人巨细胞病毒(HCMV)、肺炎支原体(MP)、沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)及人正常基因组、阳性对照品进行PCR检测，结果见图1，结果表明，仅含MG/MH/UU/UP靶基因片段的质粒溶液，即阳性对照品为阳性，其余管均为阴性。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地、特异地将MG/MH/UU/UP检测出来。
以上实施例表明，本发明的试剂盒具有准确性好、特异性高、临床应用性强、使用方便的特点，适合临床使用。
实施例5：妇科用药对样本检测影响
选择市面上常见的妇科用药及清洁品，包括消糜栓、硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、美妇康卡波姆凝胶、宫炎洁卡波姆凝胶、氧氟沙星凝胶、氧氟沙星凝胶、甲硝唑呋喃酮栓、洁尔阴洗液，进行试验，验证其对试剂盒检测的影响。
结果表明，0.1mg/ml消糜栓、10mg/ml硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、10mg/mL美妇康卡波姆凝胶、10mg/mL宫炎洁卡波姆凝胶、10mg/mL氧氟沙星凝胶、10mg/mL甲硝唑呋喃酮栓、0.1％洁尔阴洗液，对检测不存在干扰，且能够实现对药品中是否存在MG、MH、UU、UP感染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中生方政生物技术股份有限公司
<120> 四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组、试剂盒及检测方法
<130> MP1916184
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
agtaagaatg ttactgctta cac 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caggttggtg ttatggatgg tt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cttcgccacc ccyatcaccg 20
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tctacctttt agattggaat acccat 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tctcgacccg gctaaacatc atagt 25
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
catcttttag tggcgcctta cagcgc 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ggtgaacggg tgagtaacac gt 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
caccaactat ctgatacgtc gcac 24
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
agcgtcgcaa acgcgac 17
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
agcgtcgcca caaagagcga c 21
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tctgactcct gaggagaagt ctgcc 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
catgcccagt ttctattggt ctcctt 26
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ccttgcccca cagggcagta acgg 24
<210> 14
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
agtaagaatg ttactgctta cacccccttc gccaccccca tcaccgattc taaaagtgat 60
ctggttagtt tggcacaact tgattcttct tatcaaatcg ctgaccaaac catccataac 120
accaacctg 129
<210> 15
<211> 178
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tctacctttt agattggaat acccattgga aacaatggct aatgccggat acgcatggaa 60
ccgcatggtt ccgttgtgaa aggcgctgta aggcgccact aaaagatgag ggtgcggaac 120
attagttagt tggtgaggta atggcccacc aagactatga tgtttagccg ggtcgaga 178
<210> 16
<211> 164
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ggtgaacggg tgagtaacac gtatccaacc tacccttaag ttggggataa ctagtcgaaa 60
gattagctaa taccgaataa taacatcaat atcgcatgag aagatgtaga aagtcgcgtt 120
tgcgacgctt ttggatgggg gtgcgacgta tcagatagtt ggtg 164
<210> 17
<211> 168
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ggtgaacggg tgagtaacac gtatccaatc tacccttaag ttggggataa ctagtcgaaa 60
gattagctaa taccgaataa taacatcaat atcgcatgag aagatgtaga aagtcgctct 120
ttgtggcgac gcttttggat gagggtgcga cgtatcagat agttggtg 168
<210> 18
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tctgactcct gaggagaagt ctgccgttac tgccctgtgg ggcaaggtga acgtggatga 60
agttggtggt gaggccctgg gcaggttggt atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac 120
caatagaaac tgggcatg 138

Claims (10)

1.四种阴道泌尿道支原体多重检测的引物、探针组，其包括：
用于检测生殖支原体的SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；和
用于检测人型支原体的SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针；和
用于检测解脲脲原体的SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针；和
用于检测细小脲原体的SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对和SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针。
2.根据权利要求1所述的引物、探针组，其特征在于，
SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；
SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；
SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；
SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团JOE，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
3.四种阴道泌尿道支原体多重检测的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的引物、探针组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括对内参基因HBB检测的引物对和探针；
所述针对内参基因HBB检测的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示；
所述针对内参基因HBB检测的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团TARMA，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光定量PCR检测试剂和/或样本提取试剂；
所述荧光定量PCR检测试剂包括qPCR Master Mix酶混合液、qPCR Master Mix反应缓冲液；
所述样本提取试剂包括NaOH、TritonX-100和TE缓冲液。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和/或阴性对照；
本发明的阴性对照品为DEPC水；
本发明的阳性对照品为含有含有生殖支原体、人型支原体、解脲脲原体和细小脲原体靶基因片段的质粒溶液。
8.检测并区分生殖支原体、人型支原体、解脲脲原体和细小脲原体的方法，其包括：以权利要求3～7任一项所述的试剂盒，对待测样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，产生S型扩增曲线则为阳性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的体系包括：
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的程序包括：
50℃ 2分钟；
95℃ 5分钟预变性；
95℃ 15秒→60℃ 35秒，45个循环。
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