CN102094072A - SYBR Green法检测解脲支原体感染的荧光PCR试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于SYBR Green法检测解脲支原体感染的荧光PCR试剂盒，属于体外核酸诊断试剂盒领域。该试剂盒包括阴性参控品、阳性对照品、荧光聚合酶链式反应液、Taq聚合酶和DNA提取液。本发明包括一个以荧光PCR技术为基础的PCR反应体系，包含针对解脲支原体特异序列的正、反向引物和荧光染料SYBR Green，可以简便快速地在临床样本中检测解脲支原体感染，特异性高，对解脲支原体的早期检出有很大的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于体外核酸检测领域，在临床样本中检测解脲支原体感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒。
背景技术
解脲支原体(ureaplasma urealyticum，UU)又称解脲脲原体，是一种原核微生物，为脲原体属中惟一的一种，因生长需要尿素而得名。解脲支原体可引起泌尿生殖道感染，与女性生殖道健康关系最为密切，被认为是非淋球菌性尿道炎中仅次于衣原体(占50％)的重要病原体。80％孕妇的生殖道内存在有解脲支原体。
解脲支原体是人类泌尿生殖道常见的共生微生物，为致病性比较弱的条件致病病原体。在成人主要通过性接触传染，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染。成人男性的感染部位在尿道黏膜，女性感染部位在宫颈。妇女妊娠后，由于孕激素的增加，抑制了细胞免疫，机体抵抗力下降，更易受到解脲支原体的感染。主要引起非淋球菌性尿道炎(宫颈炎)、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、自然流产、早产、前列腺炎、附睾炎、不育症、低体重新生儿、新生儿肺炎、脑膜炎以及败血症等。解脲支原体感染造成的女性生殖器官病理性改变，是不孕不育的重要原因。解脲支原体感染孕妇容易造成其流产，因此，对不明原因的流产，尤其是多次流产者，应考虑有解脲支原体感染的可能。解脲支原体感染造成的不完全梗阻的输卵管炎性粘连，可使管腔狭窄，通而不畅，还是发生宫外孕的重要原因。解脲支原体可以经胎盘垂直传播或由孕妇下生殖道感染上行扩散，引起宫内感染，两者均可导致流产、早产、胎儿宫内发育迟缓、低体重儿、胎膜早破，甚至造成胎死宫内等一系列不良后果。
解脲支原体基本为球形，亦可呈球杆状或丝状，因其在培养基上的菌落呈针尖大小，菌体大小为0.2～0.3μm，须在低倍显微镜下观察，故又称之为微小(tiny strain)支原体，分子量4.5×108，高度多形性，无细胞壁及前体，由三层蛋白质和脂质组成的膜样结构以及一层类似毛发结构组成，细胞器极少。在培养基上的菌落表面有粗糙颗粒，合适条件下可转成典型的“荷包蛋”样菌落。解脲支原体生长需要尿素和胆固醇，分解尿素为其典型的代谢特征，尿素分解后产生氨氮，使培养基pH上升。
解脲支原体基因组亦为环状双股DNA，全长为200万～300万bp，G+C含量为25.5％。几乎所有ATP合成都是尿素水解的结果，产生一个产能的电化学梯度。解脲支原体不编码某些高度保守的eubacterial酶，包括细胞分裂蛋白FtsZ、Chaperonins GroES及GroEL和核糖核苷二磷酸还原酶，解脲支原体有6个密切相关的铁转运体，其是通过基因复制产生，提示其有一种在其他小基因组细菌所没有的呼吸系统。目前解脲支原体的1～14标准血清型可被划分为两大生物群，其一包括血清型1、3、6和14，称之为生物群1或Parvo，另一个则由其余各血清型组成，成为生物群2或T960。解脲支原体菌株的分群有助于阐明生物群或血清型与疾病之间的可能联系。
目前市场上用于检测解脲支原体的方法主要有：分离培养方法，代谢抑制试验，间接血 凝试验，生长抑制试验，分子生物学诊断方法。分子生物学诊断方法目前主要应用聚合酶链反应(PCR)法及DNA探针技术作诊断。现在正得到广泛的应用。
荧光PCR技术在1995年由美国PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险。
荧光PCR技术的荧光探针以发展形成多种类型，如Taqman探针，FRET探针，SYBR Green法等，本方法涉及的是SYBR技术。其工作原理是：SYBR Green是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
发明内容
为克服传统方法对UU检测的缺点，本发明提供一种特异性高、成本低的检测产品。
本发明提供了一种检测UU(解脲支原体)感染的荧光PCR(聚合酶链式反应)试剂盒，包括阴性参考品、阳性对照品、荧光PCR反应液以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括PCR分型引物。
所述的阳性对照品为含有插入UU特异序列的PMD18-T载体质粒，所述的插入序列如下：
ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TAGGGAATTT TTCACAATGG GCGCAAGCCT TATGAAGCAA TGCCGCGTGA
ACGATGAAGG TCTTATAGAT TGTAAAGTTC TTTATATGGG AAGAAACGCT AAGATAGGAA ATGATTTTAG
TTTGACTGTA CCATTTGAAT AAGTATCGGC TAACTATGTG CCAGCAGCCN CGGTAATACA TAGGATGCAA
GCGTTATCCG GATTTACTGG GCGTAAAACG AGCGC 245bp
所述的阳性对照品重组质粒的扩增结果解脲支原体循环数小于30.0。
所述的阴性参考品为解脲支原体阴性血清。
所述的PCR分型引物序列如下：
扩增检测解脲支原体的正向引物 ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA 22；
扩增检测解脲支原体的反向引物 GCGCTCGTTTTACGCCCAGTA 21。
所述的荧光PCR反应液加入了SBRY Green的荧光染料。可以通过荧光信号的收集判断有无解脲支原体的存在。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
①具有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接监测PCR过程中的变化。与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；
②SYBR Green与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低；
③利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定；
④检测速度快，加上样本提取总共仅需2-3个小时，操作步骤简单；
⑤可同时进行高通量的样本检测。
总之荧光PCR技术灵敏度高，特异性好，可实时监测反应进程，反应时间可控制在两个半小时以内，而且是闭管操作，无需后续处理，可最大限度避免反应产物污染，可以取代传统细胞检测或者普通PCR检测进行UU的早期诊断。
附图说明：
图为临床样本的UU荧光PCR扩增曲线。所测得阳性样本Ct值小于35.0。
具体实施方式：
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1：试剂盒的制备
1.引物设计与合成
使用Primer premier5.0，针对UU的16S rRNA基因(此为解脲脲原体的保守区域)，设计上下游引物。引物委托专业公司(生工)合成，其中引物为PAGE纯化。
扩增序列如表1：
表1.特异性引物序列
| 序列名称 | 寡核苷酸序列(5’-3’) | 碱基长度(bp) |
| UU正向引物 | ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA | 22 |
| UU反向引物 | GCGCTCGTTTTACGCCCAGTA | 21 |
2.UU质粒阳性参考品的制备
本实施例中UU质粒作为阳性模板用于阳性对照品。
根据步骤1中合成的扩增UU特异性序列的引物，在16S rRNA基因的序列中选取一段覆盖设计引物的序列进行分片段合成，然后将合成好的片段序列进行拼接，拼接好的序列经过纯化连接到PGEM-Teasy载体(购买TAKARA)上；然后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞(购买TAKARA)中；通过蓝白斑筛选，构建UU的重组质粒DNA作为阳性参考品。构建的UU重组质粒经双向DNA测序鉴定。提取质粒，紫外分光光度计定量，稀释到2.0×1010拷贝/微升于-20℃保存。
3.对照品选择
使用无UU血清为阴性对照；UU重组质粒(2×106拷贝/微升)为阳性对照。
4.荧光PCR反应液组成
表2.PCR反应液组成
| 原料名称 | 终浓度 |
| PCR Buffer | (0.8-2)× |
| MgCl2 | 2-5mM |
| dNTP | 0.1-0.5mM |
| UU引物 | 0.1-0.50μM |
| SYBR Green | 0.1-0.50μM |
| Taq酶 | 0.5-3U |
| H2O | 适量 |
| DNA模版 | 2μL |
| 总体积 | 20μL |
实施例2：试剂盒的使用
1.样本提取
使用DNA提取液提取待测样品中的UU病毒核酸
1)样本前处理：拭净宫颈口过多的分泌物，用生理盐水浸润的棉拭子紧贴宫颈口粘膜稍用力转动2周以取得分泌物和脱落细胞，将取样后的棉拭子放入备有1ml无菌生理盐水的EP管中充分漂洗，贴壁挤干。碱裂解法提取UU病毒。
裂解液配方：60mmol/L TrisHCl，pH 8.0；0.5％SDS；200mmol/L NaCl
2)操作步骤：取500μl分泌物混匀于13000rpm离心10min，弃上清；加50μl裂解液，100℃保温20min，13000rpm离心1min，取上清1μl做PCR反应。
2.UU阳性对照品的准备
将UU质粒阳性对照品用去离子水进行稀释，浓度为2.0×106拷贝/毫升。
3.样本检测
分别取步骤1中提取的核酸，步骤2中获得的阳性对照品，作为DNA模板，加入到荧光反应液中，组成PCR反应体系。
反应体系如下：
表3.反应体系
4.反应程序
设置收集SYBR荧光信号的荧光检测通道，将反应管放入荧光PCR仪(ABI7500)开始扩增，反应程序如下：
表4.PCR反应程序
6.结果判断
基线范围的Ct值(循环数)为6-15或由软件自动选择，设定阈值使之超过无规则扩增曲线的最高值。荧光PCR仪不同，所得基线范围的Ct值会有所不同。
7.质控标准
各类对照质控品判断结果如下表：
表5.质控品标准检测结果
| 质控品 | 标准检验结果 | |
| 1 | 阴性对照 | 无扩增 |
| 2 | 阳性对照 | 20.0＜Ct值≤25.0 |
8.结果报告：
图为临床样本的UU荧光PCR扩增曲线。所测得阳性对照品Ct值在18.0～22.0之间。
样本结果的判断标准如下：
表6.报告样本检测结果
序列表
<110>上海裕隆临床检验中心有限公司
<120>SYBR Green法检测解脲支原体感染的荧光PCR试剂盒
<160>3
<210>1
<211>245
<212>DNA
<213>解脲支原体(ureaplasma urealyticum)
<400>1
actcctacgg gaggcagcag tagggaattt ttcacaatgg gcgcaagcct tatgaagcaa 60
tgccgcgtga acgatgaagg tcttatagat tgtaaagttc tttatatggg aagaaacgct 120
aagataggaa atgattttag tttgactgta ccatttgaat aagtatcggc taactatgtg 180
ccagcagccn cggtaataca taggatgcaa gcgttatccg gatttactgg gcgtaaaacg 240
agcgc 245
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作SYBR Green法检测解脲支原体感染的荧光PCR试剂盒中扩增检测UU的正向引物。
<400>2
actcctacgg gaggcagcag ta 22
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作SYBR Green法检测解脲支原体感染的荧光PCR试剂盒中扩增检测UU的反向引物。
<400>3
gcgctcgttt tacgcccagt a 21
Claims (6)
1.一种SYBR Green法检测解脲支原体感染的荧光PCR试剂盒，包括阴性参考品、阳性对照品、Taq聚合酶、荧光PCR反应液，以及DNA提取液；所述的荧光PCR反应液包括解脲支原体PCR分型引物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为含有插入解脲支原体特异序列的PMD18-T载体质粒，所述插入的特异序列如下：
ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TAGGGAATTT TTCACAATGG GCGCAAGCCT TATGAAGCAA TGCCGCGTGA
ACGATGAAGG TCTTATAGAT TGTAAAGTTC TTTATATGGG AAGAAACGCT AAGATAGGAA ATGATTTTAG
TTTGACTGTA CCATTTGAAT AAGTATCGGC TAACTATGTG CCAGCAGCCN CGGTAATACA TAGGATGCAA
GCGTTATCCG GATTTACTGG GCGTAAAACG AGCGC 245bp。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品重组质粒的扩增结果解脲支原体循环数小于30.0。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的阴性参考品为解脲支原体阴性血清。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR分型引物序列如下：
扩增检测解脲支原体的正向引物ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA 22；
扩增检测解脲支原体的反向引物GCGCTCGTTTTACGCCCAGTA 21。
6.如权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光PCR反应液加入了SBRY Green的荧光染料。
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