CN112646900A - 一种b族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物、试剂盒 - Google Patents

一种b族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物、试剂盒，所述试剂盒包括：扩增反应MIX、GBS检测液、阳性对照品和阴性对照品，所述GBS检测液包括针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物和RNase Free ddH2O。本发明的B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物、试剂盒通过将采集的细胞样本经提取核酸后，在taq DNA聚合酶的作用下，扩增出特异性片段，再利用胶体金免疫层析法实现B族链球菌核酸检测，所述试剂盒对GBS核酸扩增产物的检测不依赖于昂贵的荧光定量PCR仪器，整个过程操作简单快捷，对操作人员素质的要求也较低。

Description

一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物、试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体来说，涉及一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物、试剂盒。
背景技术
B族链球菌是一种革兰氏阳性球菌，学名无乳链球菌(S.agalactiae)，早期被兽医界重视是由于它能引起牛乳房炎，严重危害畜牧业。直至1938年，Fry首次报告3例人类感染B族链球菌引起产后心内膜炎的死亡，证实B族链球菌也是人类的致病菌。由于该菌细胞壁中多糖物质属于抗原构造分类中的B族，故又被称为B族链球菌(group B streptococcus，GBS)。
B族链球菌是一种条件致病菌，是国际上公认的新生儿侵袭性感染的首要原因。如果孕妇感染B族链球菌，新生儿就可能在出生时吸入感染的羊水或通过产道时感染B族链球菌。新生儿感染B族链球菌主要表现为早期侵入性感染，以新生儿败血症为主要临床表现。新生儿感染B族链球菌能够导致败血症，肺炎和脑膜炎，发病率和死亡率较高，也可能遗留长期病理状态如耳聋、视力受损、发育障碍以及脑瘫等。同时，B族链球菌还可引起早产、胎儿发育不良(低体重儿)、胎膜早破及晚期流产。美国新哈芬地区历经10年的调查统计结果显示：新生儿败血症年发生率为2.7‰，其中约50％是B族链球菌感染引起的。抗生素(尤其是青霉素)是治疗B族链球菌感染的有效手段，因此为避免抗生素滥用、同时又有效降低新生儿GBS感染，在孕妇产前进行B族链球菌感染筛检显得尤为必要。
为降低由于B族链球菌感染导致的新生儿感染，中华医学会妇产科学分会产科学组在《孕前和孕期保健指南建议》(2018版)中明确将GBS筛查作为高危孕妇的备查项目，且最佳检测时间在35～37周。因此，建立有效快捷的孕产妇GBS筛查方法，对于降低新生儿GBS感染具有重要意义。
目前B族链球菌感染的实验室检测方案主要包括传统的培养法和荧光定量PCR法。培养法作为病原微生物检测的金标准，具有特异性高的显著优势，但却具有耗时长、费用大、培养难度高、通量低、灵敏度低等一系列缺点，很难满足临床实际需求；荧光定量PCR法具有灵敏度高、耗时短、通量相对较高的优势，但其检测过程依赖于昂贵的qPCR仪器，又很难满足基层医院的需求。
核酸胶体金免疫层析技术是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上形成检测线(T线)和质控线(C线)，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上。待测样本通过常规的核酸提取后，采用5’端带有特定标记的引物进行PCR扩增，之后将扩增产物直接添加到试纸条一端的样本垫上后，扩增产物通过毛细作用向前移动，在结合垫上与胶体金标记试剂相互作用，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，形成肉眼可观察的显色结果(如图1所示)。该法已广泛应用于抗原抗体检测，但在核酸检测领域还鲜有使用。
本发明旨在建立一种利用PCR技术和胶体金免疫层析技术简便、快速、准确、高通量检测35～37周孕妇GBS感染情况试剂盒。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物、试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物，其序列为：
正向引物序列：5’-CTCTAGTGGCTGGTGCATTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示，
反向引物序列：5’-GAGTTGTCACTTGATCAGCATGT-3’，如SEQ ID NO.2所示。
所述正向引物5’端标记生物素；所述反向引物5’端标记FITC或TAMARA。
根据本发明的另一方面，提供了B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测试剂盒，所述试剂盒包括：扩增反应MIX、GBS检测液、阳性对照品和阴性对照品；
所述GBS检测液包括针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物和RNase FreeddH2O；
所述针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物序列为：
正向引物序列：5’-Bio-CTCTAGTGGCTGGTGCATTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示，
反向引物序列：5’-FITC-GAGTTGTCACTTGATCAGCATGT-3’，如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述扩增反应MIX购自南京诺唯赞生物科技有限公司(货号：P211-V10.1)，该反应体系包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及各种PCR扩增反应液所需离子。
优选地，所述阳性对照品为含有B族链球菌CAMP基因序列的灭活大肠杆菌工程菌。
优选地，所述阴性对照品为RNase Free ddH2O。
优选地，所述GBS检测液中针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物的浓度为50～400nM。
优选地，所述GBS检测液中针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物的浓度为200nM。
本发明的有益效果：
(1)填补了临床空白：本发明提供的B族链球菌核酸胶体金层析检测的特异性标记引物、试剂盒及检测方法，能够快速、准确且灵敏地检测出B族链球菌。填补了目前临床对于孕妇B族链球菌感染核酸胶体金检测这一空白领域；
(2)加快临床诊断效率：实验结果重复性好，精密度高，本发明检测时间周期短，最快能在70分钟内完成检测，极大的节约了检测时间；
(3)质量控制：本发明中胶体金层析试纸设计了质控条带，可对胶体金层析过程进行质量监控，能监控是否出现假阳性以及人工操作失误；
(4)操作简单、适用于基层医院：仅需操作者将B族链球菌核酸检测液和模板进行混合即可上机检测，检测仪器仅依赖于普通PCR仪器，核酸胶体金免疫层析试结果为可视化，对操作人员、仪器的要求极低，适合高中低等级医院、临床可推广性高；
(5)防污染反应体系：本发明试剂中引入了dUTP/UDG防污染系统，可完全消除扩增产物污染对qPCR的影响，无需担心样本开盖对实验系统的污染问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明所述的核酸胶体金免疫层析法检测原理示意图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测试剂盒，包括：
(1)扩增反应MIX：购自南京诺唯赞生物科技有限公司(货号：P211-V10.1)，该反应体系包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及各种PCR扩增反应液所需离子。
(2)GBS检测液：包括针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物和RNase FreeddH2O。
针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物为：
CAMP F:5’-Bio-CTCTAGTGGCTGGTGCATTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示，
CAMP R:5’-FITC-GAGTTGTCACTTGATCAGCATGT-3’，如SEQ ID NO.2所示，
正向引物5’端标记生物素；反向引物5’端标记可用FITC或TAMARA。引物浓度为50～400nM，优选使用200nM。
(3)阳性对照品：含有B族链球菌CAMP基因序列(CAMP基因序列如SEQ ID NO.3所示，>NZ_CP026082.1:c2130842-2130075Streptococcus agalactiae strain YZ1605chromosome,complete genome Cfb gene)的灭活大肠杆菌工程菌。
(4)阴性对照品：RNase Free ddH2O。
本实施例中特异性引物是选择B族链球菌CAMP基因序列进行比对，设计，保证这对引物能够特异性扩增出B族链球菌CAMP基因，而其他病原菌(如肺炎链球菌、化脓性链球菌、嗜热乳酸链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌DH5α和白假丝酵母菌)不能扩增出。
所述试剂盒的组分如表1所示，所述试剂盒保存于-20℃。
表1.试剂盒组分
组分 50个反应体积 成分
GBS检测液 375μL B族链球菌特异性标记引物和RNase Free ddH<sub>2</sub>O
扩增反应MIX 625μL Taq酶、dNTP等
阳性对照品 250μL B族链球菌CAMP基因序列的灭活大肠杆菌
阴性对照品 250μL RNase Free ddH<sub>2</sub>O
采用所述试剂盒进行B族链球菌核酸胶体金层析检测的方法为以B族链球菌DNA为模板，配制扩增反应体系进行PCR扩增，核酸胶体金免疫层析法检测原理如图1所示。
所述扩增反应体系包括：样品模板、扩增反应MIX、GBS检测液。
所述扩增程序为：
95℃3min(1个循环)；
95℃15sec，58℃30sec，72℃40sec(35个循环)；
72℃5min(1个循环)；
4℃∞(1个循环)。
待PCR反应完成后，按顺序进行以下操作：
a.取扩增产物用样本稀释10倍，稀释倍数可根据产物浓度进行调整；
b.取出层析试纸条放于洁净水平桌面上(尽快使用)，注意不要触碰NC膜；
c.用移液枪或滴管吸取80uL待检样品缓慢逐滴滴加在试纸条加样孔上，2-10分钟判读结果。
结果分析如表2所示：
表2.结果分析
Figure BDA0002844768670000061
实施例2
实施例1所述试剂盒的性能验证
(1)样本处理
选用《B族链球菌核酸检测试剂国家参考品》(批号370030-201801)进行试剂盒性能验证。所有样本按照美基生物核酸提取试剂盒(产品编号：IVD4173)进行核酸提取，所得DNA样本保存于2-8℃；若样本长时间不用可保存于-20℃。
(2)PCR扩增
按表3配置PCR扩增反应液(每个反应20μL)。将配置好的PCR扩增反应液按20μL每个反应孔进行分装。将已提取好的样品DNA、阳性对照品DNA、阴性对照品DNA各5μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。扩增程序为：
95℃3min(1个循环)；
95℃15sec，68℃30sec，72℃40sec；(35个循环)，
72℃5min(1个循环)，
4℃(∞)。使用常规PCR仪进行扩增即可。
表3.PCR扩增反应液
组分 1个反应体积
GBS检测液 7.5μL
扩增反应MIX 12.5μL
总体积 20μL
(3)层析检测：
待PCR反应完成后，按顺序进行以下操作：
a.取待测物(PCR扩增产物)用于检测，用样品稀释液对扩增产物稀释10倍待用，稀释倍数可根据目标物浓度进行调整；
b.取出试纸条放于水平桌面上(尽快使用)，注意不要触碰NC膜；
c.用移液枪或滴管吸取80uL待检样品缓慢逐滴滴加在试纸条加样孔上，2-10分钟进行判读结果。
(4)试剂盒性能：
如表4所示，对13份国家参考品的阳性样本进行检测，结果均为阳性，阳性符合率为100％。
表4.GBS国家阳性参考品
Figure BDA0002844768670000071
Figure BDA0002844768670000081
如表5所示，对国家参考品中的肺炎链球菌、化脓性链球菌、嗜热乳酸链球菌、变异链球菌、酿脓链球菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌DH5α和白假丝酵母菌10种病原菌进行检测，检测结果均为阴性，符合率100％。
表5.GBS国家阴性参考品
编号 病原体 浓度(CFU/mL) 检测结果
N1 肺炎链球菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
N2 化脓性链球菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
N3 嗜热乳酸链球菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
N4 变异链球菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
N5 酿脓链球菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
N6 嗜酸乳杆菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
N7 罗伊氏乳杆菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
N8 表皮葡萄球菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
N9 大肠埃希菌DH5α 1×10<sup>10</sup> 阴性
N10 白假丝酵母菌 1×10<sup>10</sup> 阴性
重复性：检测稀释至1×107CFU/mL的GBS1、GBS5，各重复检测10次，检测结果均为阳性。
最低检出限：所述试剂盒最低检测限为1×104CFU/mL。
所述试剂盒对稀释至不高于1×104CFU/mL的GBS1、GBS2、GBS5，检测结果均为阳性。
实施例3
采用实施例1所述试剂盒对50份临床样本检测：
(1)样本处理
使用阴道拭子采集50名2020年4月就诊于北京朝阳医院妇产科35-37周产检孕妇阴道标本。
样本采集要点：阴道标本采集前24小时，禁止性交，盆浴、阴道检查、阴道灌洗及局部是药等，以免影响检查结果。一般采用盐水浸湿的棉拭子睚阴道深部或阴道穹后部、宫颈管口等处取材，制备成1mL阴道分泌物的生理盐水溶液备用。
每份样本取200μL、连同阴性、阳性对照品，按照美基生物核酸提取试剂盒(产品编号：IVD4173)进行核酸提取DNA待用。
(2)PCR扩增
按表6配置PCR扩增反应液(每个反应20μL)，将配置好的PCR扩增反应液液按20μL每个反应孔进行分装。将已处理样本DNA、阳性对照品DNA、阴性对照品DNA各5μL加入相应反应孔，上机进行PCR扩增。扩增程序：
95℃3min(1个循环)；
95℃15sec，68℃30sec，72℃40sec，(35个循环)；
72℃5min(1个循环)，
4℃(∞)。使用常规PCR仪进行扩增。
表6.临床样本PCR扩增反应液
组分 60个反应体积
GBS检测液 450μL
扩增反应MIX 750μL
总体积 1200uL
(3)层析检测
待PCR反应完成后，按顺序进行以下操作：
a.取待测物(PCR产物)用于检测，用超纯水稀释样品，稀释倍数根据目标物浓度确定；
b.取出试纸条放于水平桌面上(尽快使用)，注意不要触碰NC膜；
c.用移液枪或滴管吸取80ul待检样品缓慢逐滴滴加在试纸条加样孔上，2-10分钟根据表2进行结果判读。
同时，采用购自博尔诚(北京)科技有限公司的B族链球菌(GBS)核酸检测试剂盒(国械注准20163402238)对50例样本进行对比检测(表3)，其结果判定严格按照说明书进行。
如表7所示，最终两种试剂盒检测结果显示其中8例阳性，42例阴性，与已获批荧光定量PCR试剂盒检测结果符合率100％。
表7. 50例样本GBS核酸胶体金层析法与荧光定量PCR检测结果对比
Figure BDA0002844768670000101
Figure BDA0002844768670000111
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过将采集的细胞样本经提取核酸后，在taq DNA聚合酶的作用下，扩增出特异性片段，再利用胶体金免疫层析法实现B族链球菌核酸检测，所述试剂盒对GBS核酸扩增产物的检测不依赖于昂贵的荧光定量PCR仪器，整个过程操作简单快捷，对操作人员素质的要求也较低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京华瑞康源生物科技发展有限公司
<120> 一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物、试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctctagtggc tggtgcattg tt 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagttgtcac ttgatcagca tgt 23
<210> 3
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaacgtta aacatatgat gtatttatct ggaactctag tggctggtgc attgttattt 60
tcaccagctg tattagaagt acatgctgat caagtgacaa ctccacaagt ggtaaatcat 120
gtaaatagta ataatcaagc ccagcaaatg gctcaaaagc ttgatcaaga tagcattcag 180
ttgagaaata tcaaagataa tgttcaggga acagattatg aaaaaccggt taatgaggct 240
attactagcg ttgaaaaatt aaagacttca ttgcgtgcca actctgagac agtttatgat 300
ttgaattcta ttggtagtcg tgtagaagcc ttaacagatg tgattgaagc aatcactttt 360
tcaactcaac atttagcaaa taaggttagt caagcaaata ttgatatggg atttgggata 420
actaagctag ttattcgcat tttagatcca tttgcttcag ttgattcaat taaagctcaa 480
gttaacgatg taaaggcatt agaacaaaag gttttaactt atcctgattt aaaaccaact 540
gatagagcta ccatctatac aaaatcaaaa cttgataagg aaatttggaa tacacgtttt 600
actagagata aaaaagtact taacgtcaaa gaatttaaag tttacaatac tttaaataaa 660
gcaatcacac atgctgttgg agttcagttg aatccaaatg ttacggtaca acaagttgat 720
caagagattg taacattaca agcagcactt caaacagcat taaaataa 768

Claims (8)

1.一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物，其特征在于，其序列为：
正向引物序列：5’-CTCTAGTGGCTGGTGCATTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示，
反向引物序列：5’-GAGTTGTCACTTGATCAGCATGT-3’，如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测引物，其特征在于，所述正向引物5’端标记生物素；所述反向引物5’端标记FITC或TAMARA。
3.一种B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测试剂盒，其特征在于，包括：扩增反应MIX、GBS检测液、阳性对照品和阴性对照品；
所述GBS检测液包括针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物和RNase Free ddH2O；
所述针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物序列为：
正向引物序列：5’-Bio- CTCTAGTGGCTGGTGCATTGTT-3’，如SEQ ID NO.1所示，
反向引物序列：5’-FITC-GAGTTGTCACTTGATCAGCATGT-3’，如SEQ ID NO.2所示。
4. 根据权利要求3所述的B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应MIX包括taq DNA聚合酶、4种dNTP及PCR扩增反应液所需离子。
5.根据权利要求3所述的B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有B族链球菌CAMP基因序列的灭活大肠杆菌工程菌。
6. 根据权利要求3所述的B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为RNase Free ddH2O。
7.根据权利要求3所述的B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测试剂盒，其特征在于，所述GBS检测液中针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物的浓度为50~400nM。
8.根据权利要求3所述的B族链球菌核酸胶体金免疫层析法检测试剂盒，其特征在于，所述GBS检测液中针对B族链球菌CAMP基因的特异性标记引物的浓度为200nM。
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