CN107937580A - 泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。该泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒和试剂盒的使用方法可以同时检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌，通过使用实时荧光PCR扩增技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，该试剂盒的使用方法快速简便，并且特异性好，对非沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的病原体微生物不会检测出，因而不易出现假阳性的问题，并且灵敏度高，可达400copies/ml，检测范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml，检测范围宽。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。
背景技术
泌尿生殖道微生物的研究具有重要的临床和科研价值。泌尿生殖道微生物种类繁多，常见的有沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)及淋球菌(NG)等。
沙眼衣原体是一种具有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，是一类介于病毒、细菌和立克次体之间的特殊微生物，在微生物分类上属于细菌门、立克次体纲、衣原体目、衣原体属。沙眼衣原体是国内外最常见的泌尿生殖道感染型微生物，在我国生殖道衣原体感染居STD的第三位，且其发病率有逐年增高的趋势。机体感染沙眼衣原体后，能诱导产生特异性细胞免疫和体液免疫，但通常免疫力不强，且维持短暂，因而常造成持续感染、隐性感染和反复感染。
解脲脲原体又称解脲支原体，属于柔膜纲支原体目支原体科的脲原体属，是一类介于细菌与病毒之间的最小原核微生物，主要分布于人体泌尿生殖道内，并可通过性接触而传播，也可由母体垂直传染给胎儿。男性生殖道最常见的寄生处在尿道口和精液中，女性生殖道最常见的寄生处在阴道。解脲脲原体是非淋菌性尿道炎的主要病原体之一，感染后可导致多种生殖道炎症。在男性，可导致非淋菌性尿道炎、急性附睾炎、前列腺炎等的发生；在女性可引起包括子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎等，宫内感染可引起流产、死胎、早产等不良后果。
奈瑟淋球菌在1879年由Neisser发现，俗称淋病双球菌或淋球菌，是引起人类淋病的致病病原体，属奈瑟菌属。淋球菌有严格的人类寄生性，对人体有较强的适应和侵袭能力，其主要致病物质包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，是发展中国家发病率较高的性传播疾病之一。淋球菌主要通过性接触直接感染，也可以通过接触患者的衣物或马桶等间接感染，还可以通过产道感染分娩时的胎儿。
目前沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的实验室检测方法主要有分离培养法、免疫学方法、基于核酸检测的分子生物方法等。培养法的特异性和敏感性高，但其具有临床检测时间过长(至少需要24h～48h，甚至更长时间)，过程繁琐，需要使用特殊的培养介质以及易受杂菌影响等缺陷，不适用于大范围检测。免疫学方法简便快捷，但特异性差、灵敏度不高。近年来，聚核酶链式反应(PCR)法渐渐显现了其在检测上的优势。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术，其检测结果准确，重复性高，能动态反应病原体变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。
目前已有一些基于实时荧光定量PCR技术检测沙眼衣原体、解脲脲原体或淋球菌DNA的试剂盒产品，但普遍存在特异性差、灵敏度低的问题，并且大部分是针对沙眼衣原体、解脲脲原体或淋球菌单一的检测试剂盒，对于多种病原体微生物混合的检测效果尤其差，并且处理过程繁琐。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测特异性好、灵敏度高的泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法。
一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针，包括沙眼衣原体扩增引物对及对应的检测探针、解脲脲原体扩增引物对及对应的检测探针、以及淋球菌扩增引物对及对应的检测探针；所述沙眼衣原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示；所述解脲脲原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示；所述淋球菌扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:9所示；各检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且不同检测探针的荧光报告基团不同。
在其中一个实施例中，所述沙眼衣原体的检测探针上标记的荧光报告基团是HEX或VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述解脲脲原体的检测探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；所述淋球菌的检测探针上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。
一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，包括上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针。
在其中一个实施例中，所述泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒还包括内标阳性质控及其扩增引物对和检测探针；所述内标阳性质控含有序列如SEQ ID NO:13所示的β球蛋白目的基因片段；所述内标阳性质控扩增引物对的两条引物的序列分别SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:12所示；所述内标阳性质控的检测探针的两端也分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且其标记的荧光报告基团不同于所述泌尿生殖道微生物的检测探针上标记的荧光报告基团。
在其中一个实施例中，所述内标阳性质控的检测探针上标记的荧光报告基团是ROX，荧光淬灭基团是BHQ 2。
在其中一个实施例中，所述泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒包括灭活的沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌阳性对照品。
在其中一个实施例中，所述泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs试剂中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP以及dUTP，所述试剂盒中还包括UNG酶。
一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
以提取的核酸样本作为模板，加入上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针进行实时荧光PCR扩增反应；
在实时荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号。
在其中一个实施例中，所述泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒的使用方法还包括使用上述内标阳性质控和/或上述阳性对照品进行与待测样本同样处理的步骤。
上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒和试剂盒的使用方法可以同时检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌，通过使用实时荧光PCR扩增技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，该试剂盒的使用方法快速简便，并且特异性好，对非沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的病原体微生物不会检测出，因而不易出现假阳性的问题，并且灵敏度高，可达400copies/ml，检测范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml，检测范围宽。
进一步，该试剂盒和试剂盒的使用方法通过对PCR反应体系进行优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性。
更进一步，通过增加内标阳性对照，通过检测人表皮细胞中的β-球蛋白来评定采集的样本是否适用于扩增反应，可以监测待测样本中是否具有PCR抑制物，因而可以评价核酸提取的质量，避免PCR假阴性的问题。
在实时荧光PCR扩增过程中，通过实时荧光采集，在PCR扩增结束后，通过曲线形状及Ct值可以很容易判断沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌DNA的阴、阳性，检测结果可用于沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，从而为沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的研究提供可靠的实验依据。
附图说明
图1～图3依次为沙眼衣原体、解脲脲原体与淋球菌的阳性对照品的检测结果；
图4为对阴性对照品的特异性检测结果；
图5～图7依次为对不同浓度的沙眼衣原体、不同浓度的解脲脲原体与不同浓度的淋球菌的阳性对照品的灵敏度检测结果；
图8～图10依次为使用不同干扰物质对沙眼衣原体、解脲脲原体与淋球菌的阳性对照品的灵敏度检测结果；
图11和图12分别不使用和使用dUTP和UNG酶检测阴性对照品的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式的泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针，包括沙眼衣原体扩增引物对及对应的检测探针、解脲脲原体扩增引物对及对应的检测探针、以及淋球菌扩增引物对及对应的检测探针。沙眼衣原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示。解脲脲原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示。淋球菌扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:9所示。各检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且不同检测探针的荧光报告基团不同。
在一个实施例中，各微生物的检测探针上标记的荧光报告基团位于5’端，荧光淬灭基团位于3’端。进一步，在一个具体的实施例中，沙眼衣原体的检测探针上标记的荧光报告基团是HEX或VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；解脲脲原体的检测探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；淋球菌的检测探针上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。可理解，在其他实施例中，各检测探针上标记的荧光报告基团不限于上面所述，只要两端标记的荧光基团能够发生荧光能量共振转移即可，且不同的微生物对应的检测探针上标记的荧光报告基团不同即可。
本实施方式还提供了一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，其包括上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针。
在一个实施例中，该泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒还包括内标阳性质控及其扩增引物对和检测探针。该内标阳性质控含有序列如SEQ ID NO:13所示的β球蛋白目的基因片段，如在一个实施例中，该内标阳性质控为含有上述基因片段的克隆质粒。内标阳性质控扩增引物对的两条引物的序列分别SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:12所示。内标阳性质控的检测探针的两端也分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且其标记的荧光报告基团不同于泌尿生殖道微生物的检测探针上标记的荧光报告基团，如在一个具体的实施例中，该内标阳性质控的检测探针的5’端上标记的荧光报告基团是ROX，荧光淬灭基团是BHQ 2。选择β球蛋白作为内标既可以监测样本采集，也可以监测样本提取。在一个实施例中，可以将SEQ ID NO:13所示的β球蛋白目的基因片段通过使用含有限制性内切酶位点序列的引物进行扩增，并插入使用同样限制性内切酶酶切的空载体质粒中，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆，提取质粒即得。
进一步，在一个实施例中，该泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒包括灭活的沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌阳性对照品。如在一个优选的实施例中，可以将灭活的沙眼衣原体、解脲脲原体、淋球菌与上述内标阳性质控的克隆质粒按照预设的比例(如相同浓度)进行混合，共同构成阳性参照品。
阳性参照品可以为后续软件分析提供定量的对照基础，如可以对经定值后的阳性参照品用TE缓冲液依次稀释为A、B、C、D四个浓度，其浓度分别为1.00～5.00E+07copies/ml(A)、1.00～5.00E+06copies/ml(B)、1.00～5.00E+05copies/ml(C)、1.00～5.00E+04copies/ml(D)，后续软件通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。
进一步，上述沙眼衣原体、解脲脲原体、淋球菌与内标阳性质控的克隆质粒也可以按照特定的浓度比例混合在一起构成阳性对照，如在一个具体的实施例中，将沙眼衣原体、解脲脲原体、淋球菌和β-球蛋白目的基因片段的克隆质粒混合，各组分浓度为1.00～5.00E+05copies/ml。
更进一步，该试剂盒还包括阴性对照品，阴性对照品可以采用但不限于如灭菌的生理盐水等物质。
在一个可选的实施例中，该泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs试剂中的至少一种。
在一个具体的实施例中，10×PCR扩增缓冲液包括pH 7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2％(体积/体积)曲拉通溶液和10％(体积/体积)甲酰胺溶液。
DNA聚合酶可以是但不限于热启动Taq酶，其使用浓度为1U/μl～5U/μl。
在一个具体的实施例中，dNTPs包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP以及dUTP，进一步，该试剂盒中还包括UNG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)，其使用浓度为0.05U/μl～0.2U/μl。UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。进一步，在一个具体的实施例中，可以将DNA聚合酶与UNG酶混合构成酶混合液使用。
在一个优选的实施例中，可以将5μl 10×PCR扩增缓冲液、终浓度为0.2mmol/L的dNTPs(各dNTP的终浓度都是0.2mmol/L)、0.2μmol/L～0.4μmol/L的各微生物及内标阳性对照的克隆质粒对应的扩增引物、0.2μmol/L～0.4μmol/L的各微生物对应的检测探针、以及0.1μmol/L～0.2μmol/L的克隆质粒对应的检测探针混合在一起构成实时荧光PCR反应液，后续与核酸提取按照预设比例进行共混反应即可。
本实施方式还提供了一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：
提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
以提取的核酸样本作为模板，加入上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针进行实时荧光PCR扩增反应；
在实时荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号。
实时荧光PCR扩增反应的条件可以根据缓冲液盐离子浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成、反应特征和核酸长度等具体确定和调整，如在一个优选的实施例中，可按照如下程序进行：
在一个实施例中，该泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒的使用方法还包括使用上述内标阳性质控和/或上述阳性对照品进行与待测样本同样处理的步骤。
进一步，在一个实施例中，该检测用的试剂盒的使用方法还包括使用灭菌的生理盐水等阴性对照品进行与待测样本同样处理的步骤。
上述泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒和试剂盒的使用方法可以同时检测沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌，通过使用实时荧光PCR扩增技术，只需进行一次核酸提取和一步PCR检测反应即可，该试剂盒的使用方法快速简便，并且特异性好，对非沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的病原体微生物不会检测出，因而不易出现假阳性的问题，并且灵敏度高，可达400copies/ml，检测范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml，检测范围宽。
进一步，该试剂盒和试剂盒的使用方法通过对PCR反应体系进行优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性。
更进一步，通过增加内标阳性对照，通过检测人表皮细胞中的β-球蛋白来评定采集的样本是否适用于扩增反应，可以监测待测样本中是否具有PCR抑制物，因而可以评价核酸提取的质量，避免PCR假阴性的问题。
在实时荧光PCR扩增过程中，通过实时荧光采集，在PCR扩增结束后，通过曲线形状及Ct值可以很容易判断沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌DNA的阴、阳性，检测结果可用于沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，从而为沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的研究提供可靠的实验依据。
以下为具体实施例部分。
1、样本采集
本实施例检测样本来源可以是泌尿生殖道分泌物。
阳性对照：将沙眼衣原体、解脲脲原体、淋球菌和β-球蛋白目的基因片段的克隆质粒混合，各组分浓度为1.00～5.00E+05copies/ml。
阴性对照：灭菌的生理盐水。
阳性参照品：将灭活的沙眼衣原体、解脲脲原体、淋球菌与上述内标阳性质控的克隆质粒按照等浓度进行混合，共同构成阳性参照品，用TE缓冲液依次稀释为A、B、C、D四个浓度，其浓度分别为1.00～5.00E+07copies/ml(A)、1.00～5.00E+06copies/ml(B)、1.00～5.00E+05copies/ml(C)、1.00～5.00E+04copies/ml(D)。
2、样本核酸提取
2.1方法一：磁珠法提取核酸(SuperAll超级提取试剂盒，货号S1006，湖南圣湘生物科技有限公司)
1)裂解病毒：每管加入200μl～1ml DNA提取溶液I，然后加入100μl～1ml待测样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心。
2)磁珠吸附核酸：每管加入50μl～400μl DNA提取溶液II，震荡混匀10秒钟后，室温静置5～10分钟。
3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上，2～5分钟后缓慢将溶液吸出。
4)洗涤：每管加入400μl～1ml DNA提取溶液III和100μl～500μl DNA提取溶液IV，震荡混匀3～7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上。
5)2～5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1～3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃。
6)每管加入50～100μl DNA洗脱液，用吸头吸取DNA洗脱液洗脱吸附于离心管壁的棕色残留物，反复几次尽量将其完全洗脱。
7)静置5～10分钟后将离心管再次置于分离器上，2～5分钟后，将洗脱液吸出置于新的离心管中备用。
8)每个反应管加入上述经预处理的待测样本、阴性对照、阳性对照5～10μl。
9)每管加入PCR-mix 40～45μl，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒。
2.2方法二：样本经高速离心浓缩后核酸释放(样本释放剂包括0.01～0.5mM/L的莎梵婷、50～200mM/L的氯化钾、质量体积浓度为0.01％～2％的十二烷基磺酸钠、以及体积浓度为0.05％～1％的乙醇)
1)取200～500μl待测样本，13,000rpm离心5分钟后吸弃上清，加入20～50μl释放剂，静置10分钟后，备用；
2)每个反应管加入上述经预处理的待测样本、阴性对照、阳性对照5～10μl；
3)每管加入PCR-mix 40～45μl，盖上管盖(去除气泡后)，2000rpm离心30秒。
注：PCR-mix：按比例(实时荧光PCR反应液38～44μl/人份、酶混合液1～2μl/人份，总体积40～45μl/人份)取相应量的实时荧光PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
传统的主要采用煮沸法对沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌的核酸进行提取的方法(即先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板)。对于浓缩这一步，不同机构往往浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样会导致后面加入裂解液时很难充分混匀，而无法看到沉淀，将会使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。本实施例对沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌DNA的提取方法进行了比较和优化，无需加热即可完成DNA的释放和提取，提取过程简单易行，且没有传统煮沸法的诸多弊端。
3、荧光PCR反应(在荧光定量PCR扩增仪上进行)
1)将PCR反应管放入扩增仪的样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及阳性参照品浓度。
2)荧光检测通道选择：1)选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)检测解脲脲原体DNA；2)选择HEX或VIC通道(Reporter:HEX/VIC,Quencher:none)检测沙眼衣原体DNA；3)选择ROX通道(Reporter:ROX,Quencher:none)检测内标；4)选择CY5通道(Reporter:CY5,Quencher:none)检测淋球菌DNA；5)参比荧光(Passive Reference)设置为none。
3)荧光定量PCR反应条件为：
4、结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct≤38，可以判为沙眼衣原体/解脲脲原体/淋球菌阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示(Undet)显示，可以判为沙眼衣原体/解脲脲原体/淋球菌阴性。
1)准确性：检测阳性对照品，请参图1、图2和图3，结果均为阳性且鉴别准确，无交叉反应。
2)特异性：检测阴性对照品，请参图4，结果均为阴性，并且对感染部位相同的其他病原体(单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒6型、人乳头瘤病毒16型、生殖支原体、人型支原体)检测结果均为阴性。
3)精密度：批内精密度Ct值的变异系数(CV,％)≤5％。
4)最低检测限：请参图5、图6和图7，对不同浓度的沙眼衣原体、解脲脲原体及淋球菌的阳性对照品进行检测，最低浓度为400copies/ml，检测结果均为阳性，说明沙眼衣原体、解脲脲原体及淋球菌的最低检出限可达400copies/ml，灵敏度非常高。
5)干扰物质：请参图8、图9和图10，在待测样本中加入2g/L血红蛋白或10％粘液，对本引物和探针的检测无明显影响。
6)对比图11和图12(图11使用的dNTPs不含有dUTP，且检测过程中不使用UNG酶，图12使用的dNTPs含有dUTP，且检测过程中使用UNG酶)的阴性对照样品的检测结果，阴性对照品结果非阴性，说明存在污染。通过PCR产物污染的预防试验表明：PCR反应体系中加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。
临床样本的检测试验表明：本发明的快速检测试剂盒的检测范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml，检测限宽，且检测下限即灵敏度为400copies/ml，灵敏度高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖南圣湘生物科技有限公司
<120> 泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针、试剂盒及试剂盒的使用方法
<130> 111
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgttgcatg atgctttatc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaacggatc taagcttgtc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgacaagctt agatccgttt c 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctgctcgtg aagtattac 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaactagtt tagtaccatc 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttgatcaag ttatggaagg tg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagtgcgtt aaggctttca t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgcagcaatc gagcagcgaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcgctgctc gattgctgcg 20
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gactctctct gcctattggt ctatt 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccataacag catcaggagt g 21
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagatcccca aaggactcaa agaacc 26
Claims (10)
1.一种泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针，其特征在于，包括沙眼衣原体扩增引物对及对应的检测探针、解脲脲原体扩增引物对及对应的检测探针、以及淋球菌扩增引物对及对应的检测探针；所述沙眼衣原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:3所示；所述解脲脲原体扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:6所示；所述淋球菌扩增引物对的两条引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:9所示；各检测探针的两端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且不同检测探针的荧光报告基团不同。
2.如权利要求1所述的泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针，其特征在于，所述沙眼衣原体的检测探针上标记的荧光报告基团是HEX或VIC，荧光淬灭基团是BHQ1；所述解脲脲原体的检测探针上标记的荧光报告基团是FAM，荧光淬灭基团是BHQ1；所述淋球菌的检测探针上标记的荧光报告基团是CY5，荧光淬灭基团是BHQ2。
3.一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针。
4.如权利要求3所述的泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，其特征在于，还包括内标阳性质控及其扩增引物对和检测探针；所述内标阳性质控含有序列如SEQ ID NO:13所示的β球蛋白目的基因片段；所述内标阳性质控扩增引物对的两条引物的序列分别SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，对应的检测探针的序列如SEQ ID NO:12所示；所述内标阳性质控的检测探针的两端也分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，且其标记的荧光报告基团不同于所述泌尿生殖道微生物的检测探针上标记的荧光报告基团。
5.如权利要求4所述的泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，其特征在于，所述内标阳性质控的检测探针上标记的荧光报告基团是ROX，荧光淬灭基团是BHQ 2。
6.如权利要求4或5所述的泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，其特征在于，还包括灭活的沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌阳性对照品。
7.如权利要求4或5所述的泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs试剂中的至少一种。
8.如权利要求7所述的泌尿生殖微生物检测用的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP以及dUTP，所述试剂盒中还包括UNG酶。
9.一种泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
以提取的核酸样本作为模板，加入权利要求3中所述的泌尿生殖道微生物检测用的引物和探针进行实时荧光PCR扩增反应；
在实时荧光PCR扩增反应过程中检测荧光信号。
10.如权利要求9所述的泌尿生殖道微生物检测用的试剂盒的使用方法，其特征在于，还包括使用如权利要求4或5所述的内标阳性质控和/或如权利要求6所述的阳性对照品进行与待测样本同样处理的步骤。
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