CN109825615A - 沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病原微生物的检测技术领域，尤其涉及沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法。所述试剂盒中包含CT/NG/UU保守区域特异的引物对和Taqman荧光探针，该试剂盒通过实时荧光定量PCR，能准确地将CT/NG/UU感染样本检测出来，使用方便快捷，灵敏度高，特异性好，重复性强。

Description

沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒 及检测方法

技术领域

本发明涉及病原微生物的检测技术领域，尤其涉及沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

性传播疾病(Sexually transmitted diseases,STD)是指通过性接触可以传染的一组传染病，在中国，人们简称为性病。作为一种社会性疾病，STD不仅给患者造成不同程度的身体损伤，同时带来精神痛苦，还给配偶、子女、家庭带来不幸，给社会和国家造成严重的损失。感染STD疾病的患者，男性可导致附睾炎，精索炎进而致不育，女性可引起盆腔炎、输卵管炎、子宫内膜炎、异位内膜炎、异位妊娠、流产等。其中沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟氏菌(NG)、脲原体(UU)三种病原体感染已经成为STD的主要的致病病原体。因此，沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟氏菌(NG)、脲原体(UU)的及时诊断对防控性传播疾病至关重要。

沙眼衣原体Chlamydia trachomatis分为3个生物型，即小鼠生物型(biovarmouse)、沙眼生物型(biovar trachoma)和性病淋巴肉芽肿生物型(biovarlymphogranuloma venereum,LGV)，后二者与人类疾病有关。用间接微量免疫荧光试验，沙眼生物型又分A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、 K14个血清型，LGV生物型又有L1、L2、L2a、L34个血清型。其中A、B、Ba 及C型的衣原体株能引起沙眼，L1、L2、L3型能引起性病性淋巴肉芽肿，D-K 型则引起非淋菌性尿道炎。沙眼衣原体是引起非淋菌性尿道炎的主要病原体，由前述可知，非淋菌性尿道炎的40％～50％是由沙眼衣原体感染引起的。沙眼衣原体感染目前已是西方国家最常见的性传播疾病之一，发病人数增加很快，已超过淋病。在中国，沙眼衣原体感染的患病人数也在迅速增加。

人类是淋球菌唯一的自然宿主，淋病主要由性接触而传播。淋球菌侵入泌尿生殖系统繁殖，男性发生尿道炎，女性引起尿道炎和子宫颈炎。如治疗不彻底，可扩散至生殖系统。胎儿可经产道感染造成新生儿淋病性急性结膜炎。人类对淋球菌无自然免疫力，均易感，病后免疫力不强，不能防止再感染。

脲原体经尿道感染后患者可出现尿道炎症状，并可继发慢性前列腺炎。在检查前列腺液时，可见活泼、泳动的微生物群体。脲原体还继续感染精道、精囊和睾丸，影响精子和精液的质量，引起不育。

目前，沙眼衣原体(CT)、淋病奈瑟氏菌(NG)、脲原体(UU)(简称为CT/NG/UU)的检测方法主要有细菌的分离培养、免疫学诊断和分子生物学诊断，三种方法具有以下特点：

1)病原体的分离培养是CT/NG/UU的金标准，但分离培养法对技术要求较高，费用较昂贵，耗时长，在临床检测中应用不多。

2)免疫学诊断诊断还存在滞后性，不能准确反映当前是否感染或携带病原体，难以满足早期诊断的要求。

3)病原体核酸检测：具有快速、准确、检测窗口短、高灵敏度等优点，能够对CT/NG/UU作出早期诊断，给疫情的快速分析和控制提供有力的技术支撑。

其中实时定量PCR检测平台已成为最简捷和可靠的核酸检测方法，在目前国内外的核酸诊断中应用最为广泛，检测原理为，检测探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光，引物延伸时，与模板结合的探针被 Taq酶(5’→3’外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在每次PCR循环中，都有新的报告基团被剪切，因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比，可实时监控扩增情况。

目前产品大部分采取针对CT/NG/UU单一的荧光定量PCR检测方法，必须对一个临床样本进行多管检测，才能分别得出结论，增加了检测成本和操作繁琐度。本发明针对以上技术缺陷，选择沙眼衣原体cryptic plasmid保守区域，淋球菌质粒保守区域、脲原体16SrRNA保守区域、β-珠蛋白基因(HBB，内标)保守区域，设计特异性引物和探针，利用实时荧光定量PCR技术，制成 CT/NG/UU实时荧光定量PCR检测试剂盒，并介绍了其使用方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法，该引物组所针对的靶基因片段较小，特异性较强，且灵敏度较高。

本发明提供的沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针组，其包括：

SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；

SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针；

SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针。

本发明中，SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针针对沙眼衣原体(CT)的cryptic plasmid设计，所述CT特异性靶基因片段长度为104bp；序列为：GGTTATCTTAAAAGGGATTGCAGCT TGTAGTCCTGCTTGAGAGAACGTGCGGGCGATTTGCCTTAACCCCACCA TTTTTCCGGAGCGAGTTACGAAGACAAAAC(SEQ ID NO:13)。所述CT 特异性靶基因片段。

本发明中，SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针针对淋病奈瑟氏菌(NG)的plasmid设计，所述NG特异性靶基因片段长度为121bp；序列为：TTTGCTGTTCTCGACTGGGCAATTTTC CAGTGTCAAACCTTTGGTCTTGGTTTCCAACAGGTCTAGGGTGCGCTCT GCTTCGGCTCTCTGCTGTTTCAAGTCGTCCAGCTCGTTCTTGACG(SEQ ID NO：14)。

本发明中，SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针针对脲原体(UU)的16S rRNA，所述UU特异性靶基因片段长度为122bp；序列为：GCAGGCGGGTTTGTAAGTTTGGTATTAA ATCTAGATGCTTAACGTCTAGCTGTATCAAAAACTGTAAACCTAGAGTGT AGTAGGGAGTTGGGGAACTCCATGTGGAGCGGTAAAATGCGTAG(SEQ ID No.15)。

本发明所述的引物和探针具有良好的准确性、灵敏度、特异性，即便在同一个扩增体系中进行检测，也能够良好的区分CT、NG或UU。本试剂盒对CT、NG、UU的最低检出限浓度为1.0×10⁰拷贝/μL，即最低检出限为5拷贝。

本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

具体的，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；

SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。

本发明还提供了沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的试剂盒，其包括本发明所述的引物、探针组。

本发明提供的试剂盒中，还包括对内参基因HBB检测的引物对和探针；

所述针对内参基因HBB检测的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:10～11 所示；所述针对内参基因HBB检测的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。所述HBB特异性靶基因片段序列为：TCTGACTCCTGAGG AGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAG TTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTT TAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATG(SEQ ID NO：12)。本发明提供的试剂盒中，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团 JOE，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。

本发明提供的试剂盒中，还包括荧光定量PCR检测试剂和/或样本提取试剂；

所述荧光定量PCR检测试剂包括qPCR Master Mix酶混合液、qPCR Master Mix反应缓冲液；

所述qPCR Master Mix酶混合液，包括Taq酶和UNG酶，所述的Taq酶为AnstartTaqDNA聚合酶，所述的UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶。

所述样本提取试剂包括NaOH、TritonX-100和TE缓冲液。

所述样本提取液包括NaOH终浓度为0.01％～0.5％，优选为0.1％。

所述样本提取液包括TritonX-100终浓度为0.01％～0.5％，优选为0.1％。

本发明提供的试剂盒中，还包括阳性对照和/或阴性对照；

本发明的阴性对照品为DEPC水；

本发明的阳性对照品为含有沙眼衣原体、淋球菌和脲原体靶基因片段的质粒溶液。

本发明还提供了检测并区分沙眼衣原体、淋球菌和脲原体的方法，其包括：以本发明所述的试剂盒，对待测样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，产生S型扩增曲线则为阳性。

本发明所述的方法中，所述实时荧光定量PCR的体系包括：

体系中，所述引物浓度为100～1000nM，优选为500nM。所述探针浓度为 10～500nM，优选为200nM。

本发明所述的方法中，所述实时荧光定量PCR的程序包括：

50℃2分钟；

95℃5分钟预变性；

95℃15秒→60℃35秒，45个循环。

对于结果的判断，具体包括：

待检样品DNA的扩增曲线Ct值<38且有典型S型扩增曲线，为阳性结果；

待检样品DNA的扩增曲线Ct值等于45(或显示为Undet)或无典型S 型扩增曲线，为阴性结果；

待检DNA样品的扩增曲线38≤Ct值<45，为灰色区域，如重测结果仍为 Ct值<45，且有典型S型扩增曲线，则判定为阳性结果；如Ct值仍不显示或无典型S型扩增曲线，则判定为阴性结果。

待检样品CT、NG、UU均为阴性的情况下，考察HBB扩增情况，或HBB 没有S型扩增曲线，或者Ct值大于35，表明取样失败、提取失败或加样错误，需重新试验。

对于设置阳性对照的实验，还应满足：阳性对照，FAM通道、ROX通道均有明显的扩增，具有典型S型扩增曲线，且Ct值小于30；

对于设置阴性对照的实验，还应满足：阴性对照，FAM通道、ROX通道 Ct值＝45(或显示为undet)或无典型S型扩增曲线，进行后续判断，否则应进行问题查找。

本发明所述的引物和探针可用于多种来源样品的检测。对生物样品的检测可以判断该样品是否被CT、NG或UU感染，而对非生物样品的检测可以判断该样品是否被CT、NG或UU污染。因此，本发明所述的试剂盒可用于样品的非诊断目的的检测。本发明中，所述检测的样品来自阴道、泌尿道、医疗器械、药品、食品或化妆品。一些具体实施例中，所述的待测样品阴道分泌物或泌尿道分泌物。

本发明的有益效果至少包括：

(1)发明针对CT/NG/UU/HBB的保守区域，共特异性设计了8条引物和4条Taqman探针，与目的基因的保守区域结合，具有很高的特异性，与铜绿假单胞菌菌株CMCC10104、金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29108、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29204、干酪乳杆菌株 CMCC34103、大肠埃希氏菌株CMCC44103、变形杆菌株CMCC49102、伤寒沙门氏菌株CMCC50096、福氏志贺氏菌株CMCC51573、白色念珠菌株 CMCC98001、人型支原体(MH)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人巨细胞病毒(HCMV)、肺炎支原体(MP)、生殖支原体(MG)、加德纳杆菌(GV)、白色念珠菌(CC)、阴道毛滴虫(Tv)、人类基因组均没有交叉反应；

(2)CT/NG/UU3种病原物的检测在同一管内完成，并通过不同荧光标记探针加以区分，临床上可通过一次样本核酸提取、一次核酸加样，完成3 种病原物的同步检测，有效降低以往单管检测带来的检测成本过高问题，并有效改善单管检测的操作繁琐情况；

(3)靶标基因片段较短，均在100～150bp之间，若过短会影响UNG酶的去污染效果，若过长会造成反应效率下降，因此本发明既能有效避免污染，又能保证反应的高效性和灵敏度，均能检测到低至5个拷贝的CT/NG/UU DNA；

(4)在反应管内加入人类β-珠蛋白基因特异性引物探针，可有效监控样本采样、样本提取、PCR检测全过程，克服提取过程中加入外标，不能有效监控样本采样成功与否的弊端。

本发明的试剂盒非常适合临床使用和推广，对我国的性传播疾病中 CT/NG/UU的防控工作具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例4特异性实验的荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1：铜绿假单胞菌菌株CMCC10104、2：金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、3：脑膜炎奈瑟菌株CMCC29108、4：干酪乳杆菌株CMCC34103、5：大肠埃希氏菌株CMCC44103、6：变形杆菌株CMCC49102、7：伤寒沙门氏菌株 CMCC50096、8：福氏志贺氏菌株CMCC51573、9：白色念珠菌株CMCC98001、 10：人型支原体(MH)、11：单纯疱疹病毒(HSV)、12：人乳头瘤病毒(HPV)、 13：人巨细胞病毒(HCMV)、14：肺炎支原体(MP)、15：生殖支原体(MG)、 16：加德纳杆菌(GV)、17：白色念珠菌(CC)、18：阴道毛滴虫(Tv)及 19：人正常基因组、20：阳性对照品；

图2为实施例5灵敏度实验的CT(Cy5通道)荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1～7为含有CT/NG/UU/HBB靶基因片段的质粒溶液，浓度依次为1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷贝/μL；

图3为实施例5灵敏度实验的NG(FAM通道)荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1～7为含有CT/NG/UU/HBB靶基因片段的质粒溶液，浓度依次为1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷贝/μL；

图4为实施例5灵敏度实验的UU(ROX通道)荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是1～7为含有CT/NG/UU/HBB靶基因片段的质粒溶液，浓度依次为1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷贝/μL；

图5为实施例6重复性试验的阳性对照100倍稀释品(R1)的荧光检测结果。

具体实施方式

本发明提供了沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：用于快速检测CT/NG/UU的引物探针对的设计

下载NCBI中沙眼衣原体cryptic plasmid序列、淋球菌plasmid序列、脲原体16SrRNA、HBB基因序列，设计引物对和探针，序列如下：

表1引物和探针序列

实施例2：用于快速检测CT/NG/UU的实时荧光定量PCR试剂盒的建立

用于快速检测人CT/NG/UU的实时荧光定量PCR试剂盒，包括反应混合液、样本提取液、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体。

其中反应混合液，含有上下游引物和探针(SEQ ID NO：1～12)、Anstart qPCRMaster Mix酶混合液、Anstart qPCR Master Mix5×反应缓冲液。

其中Anstart qPCR Master Mix酶混合液、Anstart qPCR Master Mix5×反应缓冲液由菲鹏生物股份有限公司提供，Anstart qPCR Master Mix酶混合液稀释 25倍使用，Anstart qPCR Master Mix5×反应缓冲液稀释5倍使用。

其中引物CT-F、CT-R、Ng-F、Ng-R、UU-F、UU-R、HBB-F、HBB-R 终浓度500nM。

其中探针CT-P、Ng-P、UU-P、HBB-R浓度为200nM。

其中CT-P探针荧光基团为Cy5，猝灭基团为BHQ3，Ng-P探针荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ1，UU-P探针荧光基团为ROX，猝灭基团为MGB， HBB-P探针荧光基团为JOE，猝灭基团为BHQ2。

其中样本提取液为含0.1％NaOH、0.1％TritonX-100的TE缓冲液。

其中阳性对照品，为含有CT/Ng/UU/HBB靶基因片段的质粒溶液，浓度为10000拷贝/μL，对应的Ct值均在在23左右。

其中CT特异性靶基因片段序列为：

GGTTATCTTAAAAGGGATTGCAGCTTGTAGTCCTGCTTGAGAGAAC GTGCGGGCGATTTGCCTTAACCCCACCATTTTTCCGGAGCGAGTTACGA AGACAAAAC(SEQ ID No.13)。

其中Ng特异性靶基因片段序列为：

TTTGCTGTTCTCGACTGGGCAATTTTCCAGTGTCAAACCTTTGGTCT TGGTTTCCAACAGGTCTAGGGTGCGCTCTGCTTCGGCTCTCTGCTGTTTC AAGTCGTCCAGCTCGTTCTTGACG(SEQ ID No.14)。

其中UU特异性靶基因片段序列为：

GCAGGCGGGTTTGTAAGTTTGGTATTAAATCTAGATGCTTAACGTCT AGCTGTATCAAAAACTGTAAACCTAGAGTGTAGTAGGGAGTTGGGGAAC TCCATGTGGAGCGGTAAAATGCGTAG(SEQ ID No.15)。

其中HBB特异性靶基因片段序列为：

TCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG GTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCA AGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATG (SEQID No.16)。

其中阴性对照品为DEPC水。

实施例3：CT/NG/UU核酸检测试剂盒的快速检测方法

利用实施例2的试剂盒快速检测人阴道分泌物、泌尿道分泌物中的 CT/NG/UU，具体步骤如下：

(1)核酸提取：向阴道分泌物(5份，编号1-5)、泌尿道分泌物样本(编号6-10)(采用培养法测定是否被CT、NG或UU感染，该方法为目前行业金标准)收集管中加入1mL生理盐水，充分振荡洗涤棉拭子，然后将棉拭子靠壁挤干丢弃，取500μL液体转移至1.5mL的离心管中，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入1mL生理盐水，打散沉淀，13000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀中加入已振荡混匀的样本提取液50μL，漩涡振荡器上振荡打散沉淀(必要时用枪头轻轻打散沉淀)，100℃干浴或者水浴10分钟，13000rpm 离心5分钟，上清液用于PCR反应(吸取时不用触动管子底部的沉淀物)。

(2)实时定量荧光PCR：利用上述CT/NG/UU实时荧光定量PCR检测试剂盒进行PCR扩增反应，分别以提取的待检样品DNA、阳性对照和阴性对照各5μL为模板，与试剂盒的反应混合液20μL混合，进行实时荧光定量PCR 反应，PCR反应条件设置为：50℃2分钟UNG酶去污染，95℃5分钟预变性， 95℃15秒→60℃35秒，Cy5、FAM、ROX、JOE通道用于收集检测荧光信号，共45个循环。

(3)结果判断：

①应满足：阳性对照，FAM通道、CY5通道、ROX通道均有明显的扩增，具有典型S型扩增曲线，且Ct值小于30；阴性对照，FAM通道、CY5 通道、ROX通道Ct值＝45(或显示为undet)或无典型S型扩增曲线，进行后续判断，否则应进行问题查找；

②待检样品DNA的扩增曲线Ct值<38且有典型S型扩增曲线，为阳性结果；

③待检样品DNA的扩增曲线Ct值等于45(或显示为Undet)或无典型S 型扩增曲线，为阴性结果；

④待检DNA样品的扩增曲线38≤Ct值<45，为灰色区域，如重测结果仍为Ct值<45，且有典型S型扩增曲线，则判定为阳性结果；如Ct值仍不显示或无典型S型扩增曲线，则判定为阴性结果；

⑤待检样品CT、NG、UU均为阴性的情况下，考察HBB扩增情况，或 HBB没有S型扩增曲线，或者Ct值大于35，表明取样失败、提取失败或加样错误，需重新试验。

判定结果如表2：

表2样品检测结果

结果显示，CT阳性样品4份，NG阳性样品4份，UU阳性样品5份，双阳样品3份，全阳性样品1份，阴性样品2份。结果与现有技术鉴定一致，准确率可达100％。

实施例4：特异性实验

利用实施例2中的试剂盒、实施例3的方法分别对铜绿假单胞菌菌株 CMCC10104、金黄色葡萄球菌菌株CMCC26001、脑膜炎奈瑟菌株 CMCC29108、脑膜炎奈瑟菌株CMCC29204、干酪乳杆菌株CMCC34103、大肠埃希氏菌株CMCC44103、变形杆菌株CMCC49102、伤寒沙门氏菌株 CMCC50096、福氏志贺氏菌株CMCC51573、白色念珠菌株CMCC98001、人型支原体(MH)、单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人巨细胞病毒(HCMV)、肺炎支原体(MP)、生殖支原体(MG)、加德纳杆菌(GV)、白色念珠菌(CC)、阴道毛滴虫(Tv)及人正常基因组、阳性对照品进行PCR 检测，结果见图1，结果表明，仅含CT/NG/UU/HBB靶基因片段的质粒溶液，即阳性对照品为阳性，其余管均为阴性。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地、特异地将CT/NG/UU检测出来。

实施例5：灵敏度实验

取阳性对照品(即含CT/NG/UU/HBB靶基因片段的质粒溶液)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×10⁰～1.0×10⁶拷贝/μL 的浓度作为样品，用本发明的试剂盒和检测方法进行检测。

检测结果如图2-图5所示，结果表明，本试剂盒对CT的最低检出限浓度为1.0×10⁰拷贝/μL(相当于浓度100个/mL)，即最低检出限为5拷贝。对NG 的最低检出限浓度为1.0×10⁰拷贝/μL(相当于浓度100个菌/mL)，即最低检出限为5拷贝。对UU的最低检出限浓度为1.0×10⁰拷贝/μL(相当于浓度 100CFU/mL)，即最低检出限为5拷贝。

实施例6：重复性试验

取试剂盒中阳性对照的100倍稀释品，命名为R1，用本发明的试剂盒和检测方法，连续重复10次试验，检测结果见图5、表3所示，结果显示阳性对照的100倍稀释品Ct值变异系数均小于5％。

表3 Ct值及变异系数(CV值)。

模板	CT(CY5)	NG(FAM)	UU(ROX)
				R1	30.58	30.97	29.77
R1	30.56	31.14	29.98
				R1	30.40	30.99	29.92
R1	30.31	31.09	29.84
				R1	30.52	31.22	29.89
R1	29.57	30.47	29.42
				R1	30.35	30.89	29.69
R1	30.28	30.93	29.64
				R1	30.27	30.88	29.97
R1	30.52	31.02	29.94
				平均值	30.34	30.96	29.81
标准差	0.29	0.20	0.18
				CV值	1.0％	0.7％	0.6％

以上实施例表明，本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高、重复性强、使用方便的特点，适合临床使用。

对比例1

表4引物和探针序列

取阳性对照品(即含CT/NG/UU靶基因片段的质粒溶液)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×10⁰～1.0×10⁶拷贝/μL的浓度作为样品，用对比例1所述的引物和探针进行检测。

结果表明，对比例1的引物和探针对CT的最低检出限浓度为10拷贝/μL (相当于浓度1000个/mL)，即最低检出限为50拷贝。对NG的最低检出限浓度为100拷贝/μL(相当于浓度10000个菌/mL)，即最低检出限为500拷贝。对UU的最低检出限浓度为10拷贝/μL(相当于浓度1000CFU/mL)，即最低检出限为50拷贝。

结果显示，对比例1的引物和探针反应效率偏低，灵敏度不足。

实施例7：妇科用药对样本检测影响

选择市面上常见的妇科用药及清洁品，包括消糜栓、硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、美妇康卡波姆凝胶、宫炎洁卡波姆凝胶、氧氟沙星凝胶、氧氟沙星凝胶、甲硝唑呋喃酮栓、洁尔阴洗液，进行试验，验证其对试剂盒检测的影响。

结果表明，0.1mg/ml消糜栓、10mg/ml硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、 10mg/mL美妇康卡波姆凝胶、10mg/mL宫炎洁卡波姆凝胶、10mg/mL氧氟沙星凝胶、10mg/mL甲硝唑呋喃酮栓、0.1％洁尔阴洗液，对检测不存在干扰，且能够实现对药品中是否存在CT、NG或UU感染。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中生方政生物技术股份有限公司

<120> 沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针、试剂盒及检测方法

<130> MP1829942

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggttatctta aaagggattg cagc 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttttgtctt cgtaactcgc tcc 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcccgcacg ttctctcaag c 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttgctgttc tcgactgggc aat 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtcaagaac gagctggacg act 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgaagcagag cgcaccctag ac 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaggcgggt ttgtaagttt ggta 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctacgcattt taccgctcca catg 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccaactccc tactacactc tagg 24

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctgactcct gaggagaagt ctgcc 25

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catgcccagt ttctattggt ctcctt 26

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccttgcccca cagggcagta acgg 24

<210> 13

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggttatctta aaagggattg cagcttgtag tcctgcttga gagaacgtgc gggcgatttg 60

ccttaacccc accatttttc cggagcgagt tacgaagaca aaac 104

<210> 14

<211> 121

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttgctgttc tcgactgggc aattttccag tgtcaaacct ttggtcttgg tttccaacag 60

gtctagggtg cgctctgctt cggctctctg ctgtttcaag tcgtccagct cgttcttgac 120

g 121

<210> 15

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gcaggcgggt ttgtaagttt ggtattaaat ctagatgctt aacgtctagc tgtatcaaaa 60

actgtaaacc tagagtgtag tagggagttg gggaactcca tgtggagcgg taaaatgcgt 120

ag 122

<210> 16

<211> 138

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tctgactcct gaggagaagt ctgccgttac tgccctgtgg ggcaaggtga acgtggatga 60

agttggtggt gaggccctgg gcaggttggt atcaaggtta caagacaggt ttaaggagac 120

caatagaaac tgggcatg 138

Claims (10)

1.沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的引物、探针组，其包括：

SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；

SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针；

SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物对，SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针。

2.根据权利要求1所述的引物、探针组，其特征在于，

SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3；

SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1；

SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。

3.沙眼衣原体、淋球菌和脲原体多重检测的试剂盒，其包括权利要求1或2所述的引物、探针组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括对内参基因HBB检测的引物对和探针；

所述针对内参基因HBB检测的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:10～11所示；

所述针对内参基因HBB检测的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团JOE，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ2。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光定量PCR检测试剂和/或样本提取试剂；

所述荧光定量PCR检测试剂包括qPCR Master Mix酶混合液、qPCR Master Mix反应缓冲液；

所述样本提取试剂包括NaOH、TritonX-100和TE缓冲液。

7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和/或阴性对照；

本发明的阴性对照品为DEPC水；

本发明的阳性对照品为含有沙眼衣原体、淋球菌和脲原体靶基因片段的质粒溶液。

8.检测并区分沙眼衣原体、淋球菌和脲原体的方法，其包括：以权利要求3～7任一项所述的试剂盒，对待测样品DNA进行实时荧光定量PCR检测，产生S型扩增曲线则为阳性。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的体系包括：

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的程序包括：

50℃ 2分钟；

95℃ 5分钟预变性；

95℃ 15秒→60℃ 35秒，45个循环。