CN104032023B - 一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：Beacon？NTM：5’-CY3-<b>CATTG</b>TACGCCCATAATT？CGGAC<b>CAATG</b>–BHQ1-3’；所述探针的5’端用Cy3标记，3’端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长570nm。本发明的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测非结核分枝杆菌。本发明还公开了一种快速检测非结核分枝杆菌的试剂盒及检测方法。

Description

一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种分子信标探针和试剂盒，通过使用荧光原位杂交的手段，检测样品中少量的非结核分枝杆菌。

背景技术

根据中国卫生部组织的第四次全国结核病流行病抽样调查(2000年)得出的结果，我国有4亿人感染过结核菌，现有的传染性结核病人达200万人，结核病的人数位居世界第二，仅次于印度。中国卫生部2006年3月公布的全国传染病疫情报告中指出，肺结核仍然占甲、乙类传染病种中发病数和死亡数的首位。大部分的结核病人或生活在结核病高发地区的居民，都很难得到迅速、准确的诊断。虽然非结核分枝杆菌(non-tuberculousmycobacteriumspecies,NTM)的特性有别于结核分枝杆菌，但常常会引起结核样病变，并且对常用的抗结核菌药物耐受。临床上经常将非结核分枝杆菌感染误诊为结核杆菌感染，这不仅会影响患者的诊断与治疗，也会导致结核疫情资料的错误。因此在结核病诊断中，快速鉴定或区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染对于病人的治疗、医院的传染病防治都至关重要。

目前临床上检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌最常用的方法是抗酸染色镜检法，该方法具有简单、快速、成本低的优点，缺点是灵敏度低，痰内或者其它标本内含菌量少时往往不能得出阳性结果，并且不能区分是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌。

分子信标探针(Molecularbeaconprobe)，具有灵敏度高、特异性强、只有和靶序列杂交上了才会发出荧光等优点，被应用于荧光原位杂交。本发明通过对大量结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌菌株的16SrRNA序列进行比对，挑选非结核分枝杆菌的特异性序列，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标原位杂交反应体系，克服了非结核分枝杆菌当前临床检测的诸多问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子信标探针，通过荧光原位杂交的手段，建立一种快速、灵敏、特异性地检测样品中非结核分枝杆菌的方法。

一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：

BeaconNTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

所述探针的5’端用Cy3标记，3’端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长570nm。

进一步地，所述分子信标浓度为10ng/μL。

本发明还提供了一种快速检测非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)裂解液：4％(w/v)氢氧化钠；

(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mMNaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mMNa2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mMTris/HCl(pH7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：

BeaconNTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

(3)终止液：1％(v/v)稀硫酸；

(4)洗涤液：5mMTris，15mMNaCl，0.1％(v/v)TritonX-100，pH值为10。

本发明最后提供了一种上述试剂盒快速检测非结核分枝杆菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)吸取10μL样品滴在载玻片上，自然风干；

(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；

(3)52℃杂交10分钟；

(4)液侵泡1分钟，终止反应；

(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。

本发明的技术要点或原理：荧光原位杂交(FlourescenceinsituHybridization，FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针，通过杂交的方法来检测细胞或组织内特异性DNA或RNA的方法；分子信标探针是一种具有独特“发夹”空间结构的探针，在未与靶序列结合时，分子信标呈“发夹”结构，有一环序列(loop)和一茎序列(stem)，其中环序列是与靶位点互补的碱基序列，而茎序列是与靶位点无关的互补序列；在探针的两端分别标记有荧光基团和荧光猝灭基团，当探针处于发卡结构时，荧光基团和猝灭基团相邻，产生能量共振转移效应，使得荧光基团被猝灭，不能产生荧光信号，而当探针与靶位点结合时，发夹结构被打开，荧光基团和猝灭基团分开，产生荧光信号，通过荧光显微镜可以检测到该荧光信号。

本发明通过比对多个结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的16SrRNA序列，筛选出1条非结核分枝杆菌特有的靶序列。根据该靶序列，人工合成分子信标探针，其碱基组成为：

BeaconNTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

探针的5’端用Cy3标记，3’端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长570nm。

本发明通过大量实验，确定荧光原位杂交的最佳温度为52℃，甲酰胺最佳浓度为20％，分子信标最佳浓度为10ng/μL。

本发明分子信标探针5’端的荧光标记，包括但不限于FITC、FAM或Cy3等等，3’端的荧光猝灭标记，包括但不限于DABCYL、BDH、BHQ1或TANRA等，荧光基团或荧光猝灭基团可以根据现有技术进行添加。

本发明的分子信标探针能够用于检测的样本范围广泛，包括但不限于，痰、咽拭子、胃灌洗液、支气管灌洗液、活体组织、吸引物、咳出物、体液(脊髓、胸腹水、心包液等)、血液、脓液、骨髓、尿液、组织切片、食物样本、来自土壤、空气和水的样本，以及它们的培养物。这些样本经相应处理后，原则上是只要保持细胞形态完整并且靶核酸未被破坏，均可使用本发明的分子信标探针检测。这些样本的处理方法是本领域技术人员所掌握的，例如：

痰：痰液涂片法；

脓液：同痰液涂片法；

病灶组织：先用组织研磨器磨碎后再行涂片；

尿液：留全量夜尿，静置4～5h后，弃上清液，取沉淀部分尿液10ml，3000rpm，离心30min,取沉淀物涂片；

胸、腹水标本：参照尿液涂片法；

脑脊液：无菌操作收集脑脊液，放置冰箱或室温24h，待薄膜形成后涂片。也可将脑脊液离心沉淀，3000rpm,离心30min,弃上清液,取沉淀物涂片。

本发明的分子信标探针信号强度高，并且特异性高，可以有效、快速地检测非结核分枝杆菌。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：分子信标探针及寡聚核苷酸序列的设计与合成

选择出能特异性地检测非结核分枝杆菌的靶序列，在该段靶序列上设计与其完全互补的分子信标探针：

BeaconNTM：(5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’)；

该分子信标是由碱基组成的颈环结构的特异序列，其中探针的5’端用Cy3标记，3’端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长570nm；人工设计合成分子信标及与其完全互补的寡核苷酸(5’-GTCCGGAATTACTGGGCGTA-3’)。通过对分子信标和寡聚核苷酸做热变性曲线实验，确定荧光原位杂交的最佳反应温度为52℃，去离子甲酰胺的最佳浓度为20％。

实施例2：使用分枝信标探针FISH检测分枝杆菌标准菌株。

分枝杆菌标准菌株购自ATCC，共检测5种结核分枝杆菌和12种非结核分枝杆菌。

检测试剂盒包括：

(1)裂解液：4％(w/v)氢氧化钠；

(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mMNaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mMNa2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mMTris/HCl(pH7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：

BeaconNTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

(3)终止液：1％(v/v)甲稀硫酸；

(4)洗涤液：5mMTris，15mMNaCl，0.1％(v/v)TritonX-100，pH值为10。

检测方法：

(1)吸取10μL痰液样品滴在载玻片上，自然风干；

(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；

(3)在样品上加入10μL杂交液，置于杂交炉中52℃杂交10分钟；

(4)用终止液侵泡1分钟，终止反应；

(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。在暗色背景中，非结核分枝杆菌发出红色荧光。

结果判定方法：

非结核分枝杆菌阴性(-)：连续观察50个不同视野，未发现结核分枝杆菌。

非结核分枝杆菌阳性(报告杆菌数)：1-9条/50视野。

非结核分枝杆菌阳性(1+)：10-99条/50视野。

非结核分枝杆菌阳性(2+)：1-9条每视野。

非结核分枝杆菌阳性(3+)：10-99条每视野。

非结核分枝杆菌阳性(+)：>100条每视野。

检测结果如表1所示。

表1使用非结核分枝杆菌分子信标探针FISH检测分枝杆菌标准菌株

检测结果分析：5种结核分枝杆菌检测结果全为阴性，12种非结核分枝杆菌，检测结果全为阳性，说明本检测方法检测非结核分枝杆菌有很好的特异性。

SEQUENCELISTING

<110>洪,冉

<120>一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法

<130>

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cattgtacgcccagtaattccggaccaatg30

Claims (3)

1.一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：

BeaconNTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

所述探针的5’端用Cy3标记，3’端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长570nm。

2.如权利要求1所述的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标浓度为10ng/μL。

3.一种快速检测非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)裂解液：4％(w/v)氢氧化钠；

(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mMNaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mMNa2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mMTris/HCl(pH7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：

BeaconNTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

(3)终止液：1％(v/v)稀硫酸；

(4)洗涤液：5mMTris，15mMNaCl，0.1％(v/v)TritonX-100，pH值为10。