CN105567821A - 炭疽芽孢杆菌荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

炭疽芽孢杆菌荧光pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中炭疽芽孢杆菌核酸存在的试剂盒。利用本发明的试剂盒，可快速检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌核酸；该试剂盒对炭疽芽孢杆菌核酸的检测限为10拷贝每反应体系，整个反应可在2小时内完成，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

Description

炭疽芽孢杆菌荧光PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中炭疽芽孢杆菌核酸的试剂盒，属于炭疽芽孢杆菌的体外诊断领域。
背景技术
炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）是有传染性的动物源性细菌，引起动物和人类炭疽的病原菌，主要感染牛和羊等食草动物，人可以通过接触或食用患病动物及畜产品而感染。
根据传播途径的不同，人类炭疽可分为三型。第一型为皮肤炭疽（最多见），因接触患病动物及受染皮毛而感染；病菌从皮肤伤口进入体内并在局部引起炎症，出现水疱、脓疱，最后形成坏死、溃疡，中心有黑色坏死性焦痂，故名炭疽。第二型肠炭疽，多由食入未煮熟的病畜肉而感染，以恶心、呕吐、厌食在先，继以发热、腹痛、频繁腹泻及血便，发病后2-3天可因毒血症而死亡，病死率达25%-60%。第三型肺炭疽，多因处理病畜皮毛时吸入病菌芽孢，在肺组织局部发芽繁殖，引起呼吸道症状及原发性肺炎，并伴发全身中毒症状。各型炭疽均能并发败血症，以传染性休克为特征，心肺功能迅速衰竭而致死。败血症型炭疽亦可引起出血性脑膜炎，患者出现呕吐、惊厥、高热、昏迷和脑膜炎刺激征，脑脊液呈血性或脓性，继发多器官衰竭，多在第2-4天死亡，病死率100%。
在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。
本发明分别针对炭疽芽孢杆菌毒力岛基因序列的保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-timePCR的方法，用来快速检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌的核酸。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在炭疽芽孢杆菌，提供一种特异性检测炭疽芽孢杆菌的荧光PCR试剂盒。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种特异性检测样品中炭疽芽孢杆菌核酸的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含炭疽芽孢杆菌特异性扩增位点的重组质粒。
PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对炭疽芽孢杆菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1，Probe1为针对炭疽芽孢杆菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团X1为FAM，荧光淬灭基团Y1为Eclipse（见表1）。
表1检测炭疽芽孢杆菌的引物和探针序列
本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测炭疽芽孢杆菌的应用方法，包括：
试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA2μl，加灭菌水至终体系20μl。
试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。
质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。
结果判读：
阳性：出现“S”型扩增曲线，Ct值≤35；可疑：出现“S”型扩增曲线，但Ct值＞35；阴性：没有出现“S”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“S”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“S”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
样本要求：采集皮肤炭疽的脓液、渗出物，肺炭疽的咯痰，肠炭疽的粪便以及病人的的血液，疑似生物恐怖袭击的不明来源白色粉末；白色粉末可以室温运输，其余样本采集后应带冰运输；标本应-20℃保存，不能反复冻融；从临床样本提取DNA，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的DNA应立即检测，否则，应将DNA分装后-80℃～-20℃保存。
本发明提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出炭疽芽孢杆菌，但不能检出非炭疽芽孢杆菌病原体的核酸；对炭疽芽孢杆菌核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需要2小时即可完成检测，可为炭疽芽孢杆菌的疾病监测和临床诊断提供实验依据。
附图说明
图1为单重实时荧光PCR检测炭疽芽孢杆菌阳性标准品的扩增曲线图。从左至右的每组曲线对应浓度依次为2×106-2×102copies/μl，试剂盒对炭疽芽孢杆菌的检测限均为10拷贝每反应体系。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的ΔRn值。
图2为单重实时荧光PCR检测体系检测10种细菌基因组DNA的扩增曲线图。10种细菌包括：炭疽芽孢杆菌和9种阴性对照微生物。炭疽芽孢杆菌出现S型扩增曲线，而其他9种病原微生物未出现S型扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本发明范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
、引物和TaqMan探针的设计与合成
利用Blast工具对Genbank和国内外文献中的炭疽芽孢杆菌基因组序列进行分析，分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列。炭疽芽孢杆菌检测靶序列为质粒pXO1基因；并针对检测靶序列设计和合成引物和探针（见表1）。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，炭疽芽孢杆菌的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团。
、检测菌种的准备
本实施例中所使用的炭疽芽孢杆菌以及其他阴性对照菌株（马耳他布鲁菌，鼠疫耶尔森菌，小肠结肠炎耶尔森菌，土拉弗朗西斯菌，肺炎克雷伯菌，大肠杆菌，大肠埃希菌，流感嗜血杆菌，嗜肺军团菌）均购买于中国药品生物制品检定所。
、菌株DNA的抽提
选用Qiagen公司QIAampDNAMiniKit（货号：51306）提取菌株DNA。具体步骤试剂盒参考操作说明书。
、引物和探针的筛选
采用设计的引物和探针检测提取的炭疽芽孢杆菌和阴性对照菌株的基因组DNA，经反复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合。（见序列表，炭疽芽孢杆菌(正向引物P1、反向引物P2和探针Probe1）
5、标准品的构建与制备
利用P1和P2引物扩增炭疽芽孢杆菌基因组DNA，将PCR产物克隆至pMD-18T载体，转化DH5a大肠杆菌，利用碱裂解法提取阳性克隆质粒，利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处DNA的吸光率，然后计算质粒浓度与纯度。然后10倍梯度稀释至200拷贝每微升，制备炭疽芽孢杆菌的阳性标准品。
、反应条件优化
对引物、探针、酶等要素逐一优化，确定的反应体系为：2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、Takara聚合酶混合物0.4μl、模板2ul，加灭菌水至终体系20μl。
根据扩增片段长短、引物和探针的退火温度以及酶的特性，主要对反应退火温度和延伸时间进行了优化，最终确定的循环参数为：94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，40个循环，每个循环在退火阶段采集荧光信号。
在扩增结束后按同一条件分析数据，确定各样品的Ct值。
、检测限的评价
以上述5中的阳性标准品评价本发明提供的试剂盒的检测限，阳性标准品浓度为：2×106copies/μl、2×105copies/μl、2×104copies/μl、2×103copies/μl、2×102copies/μl，本发明提供的试剂盒对炭疽芽孢杆菌核酸的检测下限为10拷贝每反应体系。
8、检测特异性的评价
以上述菌株DNA为模板评价了本试剂盒的特异性。对炭疽芽孢杆菌DNA进行检测时均可见明确扩增曲线，对上述9种其他咽部常见病原微生物DNA检测时，未产生阳性扩增曲线，说明我们使用的探针和引物与我们选定的其他菌株之间不存在交叉反应。
尽管上文中以优选的方式，通过具体实施例示例性说明了本发明的某些实施方式，但是本领域技术人员应了解，本发明并不限于上面所公开的实施方式，而是可以根据本发明所属技术领域的知识对其进行修改，所作修改不会超出本发明要求保护的范围。例如，本发明所使用的荧光实时PCR也可以根据需要采用说明书中所列出的实施例中指出的荧光基团和荧光淬灭基团以外的标记物质，如Tet、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、TxRd、JOE等标记物；或使用Taqman技术之外的其他标记体系，例如MGB探针、分子信标MB探针、蝎形探针、荧光双杂交探针等荧光探针标记技术；或使用染料嵌合法如SYBRGreenI等不饱和染料与LCGreen等饱和染料，只要其使用了本发明所述的特异性引物序列，即可定性或定量检测目的基因的存在，进而特异性地检测炭疽芽孢杆菌的存在。所以，这些本领域技术人员所了解的改变和惯用手段的替换也落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围应由所附的权利要求书所限定。
序列表
<110>江苏和创生物科技有限公司
丁,小静
<120>炭疽芽孢杆菌荧光PCR检测试剂盒
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(25)
<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测
<400>1
caaacagcccagttacaattacatt25
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(21)
<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测
<400>2
tccaggaatcctgctccatct21
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_binding
<222>(1)..(26)
<223>根据基因组保守区设计的引物序列，用于核酸扩增和检测
<400>3
ggcaaggacagtggtgttggagaatt26

Claims (2)

1.一种用于特异性检测样品中炭疽芽孢杆菌核酸的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品；PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下：
P1：5`-CAAACAGCCCAGTTACAATTACATT-3`，
P2：5`-TCCAGGAATCCTGCTCCATCT-3`，
PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下：
Probe：5`-X1-GGCAAGGACAGTGGTGTTGGAGAATT-Y1-3`，
Probe荧光报告基团X1为FAM，荧光淬灭基团Y1为Eclipse。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征还在于PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA2μl，加灭菌水至终体系20μl。
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