CN102952880A - 一种产气肠杆菌特异性pcr检测引物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测的引物,具体涉及一种用于检测产气肠杆菌PCR检测的引物,属于生物检测技术领域。一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物,包括正向引物和反向引物:正向引物F:5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’;反向引物R:5’-GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG-3’。采用本发明的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。

Description

一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物
技术领域
本发明涉及一种用于检测的引物,具体涉及一种用于检测产气肠杆菌 PCR检测的引物,属于生物检测技术领域。
背景技术
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)为革兰氏阴性菌,主要存在于人和动物的肠道内,亦可存在水、土壤及腐败物中,同时它也是一种重要的条件致病菌。当宿主机体状态改变或细菌进入肠道以外的部位,往往会引起感染。近年来,由于第三代和第四代头孢菌素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用,使该菌的耐药菌株明显增多,有些菌株已经表现为多重耐药。多重耐药使得临床上对该菌引起的疾病的治疗趋于复杂化。多重耐药的一个主要原因是未能在第一时间辨明病原菌,在不明病原菌的情况下,滥用药物,从而导致细菌的耐药性的出现,导致多重耐药的产生。因此,临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段,辨明病原,从而针对性地防治。
传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类,需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读,不利于及时诊断病因,查找病原。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点,已逐步应用于细菌的快速检测。然而,通过对现有技术的文献检索发现,目前尚未有利用PCR技术检测产气肠杆菌的报道。
发明内容
 本发明的目的在于提供一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物。该引物可用于产气肠杆菌的PCR检测,具有检测时间短,成本低,检测结果特异性高,结果易判断,实用性强。
本发明是通过以下的技术方案实现的:
一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物,包括正向引物和反向引物:
正向引物F:5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
反向引物R:5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’。
所述引物在用于产气肠杆菌的PCR检测时,具体如下操作:
步骤一,提取样品DNA,PCR法扩增;
PCR检测体系为20 μL的反应体系,具体为:
10×PCR buffer(含Mg2+)    2 μL,
2.5mmol/L的dNTP       1.6 μL,
5 U/μL 的rTaq酶        0.16 μL,
20 μM的引物对          0.8 μL,
模板DNA               1-2 μL,
最后用灭菌双蒸水补至20 μL;
PCR检测反应程序为:94℃预变性4min;进入循环,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环;72℃延伸5min,降温至4℃,结束。
步骤二,取10μL PCR扩增产物,1%琼脂糖凝胶电泳检测,判断样品种是否含有产气肠杆菌;所述判断具体为:1%凝胶电泳电泳检测扩增产物,若电泳结果在201bp出现单一条带,则说明样品种含有产气肠杆菌;反之,则样品中不含产气肠杆菌。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:采用本发明的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。同时,本发明所涉及的仪器设备、试剂等较为常用,一般基层实验室即可开展检测工作,实用性更强。本发明检测靶点具有单一特异性,检测结果特异,易于判定。 
附图说明
图1为实施例中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图;
图2为实施例中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图;
图3为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图。 
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Habor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
步骤一,设计特异性扩增产气肠杆菌的引物对
引物序列为: F:5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
R:5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’;
步骤二,DNA模板制备
将产气肠杆菌接种于5ml营养肉汤液体培养基中,于35℃恒温摇床中振荡培养12h增菌后,取1ml菌液,放入1.5ml无菌离心管中;12000r/min离心15min,弃尽上清液,加入500μL灭菌双蒸水,用移液器轻轻吹打,重悬菌体,12000r/min离心15min,弃尽上清液,收集细菌;加入100μL灭菌双蒸水,用移液器轻轻吹打,重悬菌体,置于沸水中煮15min,立即取出,在-20℃放置30min。随后35℃解冻,12000r/min离心15min,取上清液放置4℃备用或-20℃保存;
步骤三,产气肠杆菌特异性PCR检测方法建立
PCR检测体系为20 μL的反应体系,具体为:
10×PCR buffer(含Mg2+)    2 μL,
2.5mmol/L的dNTP       1.6 μL,
5 U/μL 的rTaq酶        0.16 μL,
20 μM的引物对          0.8 μL,
模板DNA               1-2 μL,
最后用灭菌双蒸水补至20 μL;
PCR检测反应程序为:94℃预变性4min;进入循环,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环;72℃延伸5min,降温至4℃,结束;
步骤四,PCR扩增结果凝胶电泳判定
所述判断具体为:1%凝胶电泳检测扩增产物,紫外灯照射下观察电泳结果,如果出现201bp的单一扩增条带,则说明样品种含有产气肠杆菌;反之,则样品中不含产气肠杆菌。
PCR检测方法特异性评估实验
按上述DNA模板制备与PCR检测方法,对本实验室保存的产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、生癌肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、腐败希瓦氏菌进行PCR扩增反应。
特异性检测结果见图1。图中:泳道M为DL2000分子量标准;泳道1为模板为灭菌水蒸水的阴性对照;泳道2-10为产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTH01株、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 315B株、大肠杆菌Escherichia coli DH5株、生癌肠杆菌Enterobacter cancerogenus CX1株、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii CX2株、粘质沙雷菌Serratia marcescens NTH03株、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila NTH071株、温和气单胞菌Aeromonas sobria NTH072株、腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens NTH04株。
图1中电泳结果为只有产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTH01株在201bp处出现特异条带,而其他菌种未出现特异条带。
PCR检测方法灵敏度评价实验
    接种产气肠杆菌于3ml营养肉汤液体培养基中,置于35℃恒温摇床中振荡培养12h增菌后,用灭菌营养肉汤液体培养基10倍梯度稀释后,平板法计数得到细菌浓度为108cfu/ml,取1ml菌液按实施例1提取基因组DNA,用灭菌双蒸水按100-10-7进行10倍梯度稀释基因组DNA,以梯度稀释液为模板进行PCR扩增,凝胶电泳检测扩增产物,紫外灯照射下观察凝胶电泳结果,如图2所示。图2中:泳道M为DL2000分子量标准,泳道1为产气肠杆菌阳性对照,泳道2-9为初始模板DNA的100-10-7稀释液PCR扩增结果。由图2可知,在泳道8可以看到清晰条带,相对应检测细菌浓度为102cfu/ml,本法具有较好的灵敏度。
临床疑似菌株检测
利用上述方法建立的产气肠杆菌特异性PCR检测方法对从临床分离到的6株疑似菌株进行检测。检测结果见图3,图中泳道M为DL2000分子量标准,泳道1为产气肠杆菌阳性对照,泳道2-7为6株疑似菌株,泳道8为模板为灭菌双蒸水的阴性对照。
图中可知,3号菌株呈阳性结果。
应当理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
 <110>  浙江省淡水水产研究所
 
<120>  一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物
 
<130> 
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gtaaccggtg aaaccgaaag c                                                 21
 
 
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gatgccgcct tcgtagtgga aatgg                                             25
 
 

Claims (1)

1. 一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物,包括正向引物和反向引物,其特征在于:
正向引物F:5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
反向引物R:5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’。
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