CN102952880A - 一种产气肠杆菌特异性pcr检测引物 - Google Patents
一种产气肠杆菌特异性pcr检测引物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102952880A CN102952880A CN2012104123425A CN201210412342A CN102952880A CN 102952880 A CN102952880 A CN 102952880A CN 2012104123425 A CN2012104123425 A CN 2012104123425A CN 201210412342 A CN201210412342 A CN 201210412342A CN 102952880 A CN102952880 A CN 102952880A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- detection
- pcr
- enterobacter aerogenes
- enteroaerogen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于检测的引物,具体涉及一种用于检测产气肠杆菌PCR检测的引物,属于生物检测技术领域。一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物,包括正向引物和反向引物:正向引物F:5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’;反向引物R:5’-GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG-3’。采用本发明的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测的引物,具体涉及一种用于检测产气肠杆菌 PCR检测的引物,属于生物检测技术领域。
背景技术
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)为革兰氏阴性菌,主要存在于人和动物的肠道内,亦可存在水、土壤及腐败物中,同时它也是一种重要的条件致病菌。当宿主机体状态改变或细菌进入肠道以外的部位,往往会引起感染。近年来,由于第三代和第四代头孢菌素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用,使该菌的耐药菌株明显增多,有些菌株已经表现为多重耐药。多重耐药使得临床上对该菌引起的疾病的治疗趋于复杂化。多重耐药的一个主要原因是未能在第一时间辨明病原菌,在不明病原菌的情况下,滥用药物,从而导致细菌的耐药性的出现,导致多重耐药的产生。因此,临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段,辨明病原,从而针对性地防治。
传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类,需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读,不利于及时诊断病因,查找病原。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点,已逐步应用于细菌的快速检测。然而,通过对现有技术的文献检索发现,目前尚未有利用PCR技术检测产气肠杆菌的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物。该引物可用于产气肠杆菌的PCR检测,具有检测时间短,成本低,检测结果特异性高,结果易判断,实用性强。
本发明是通过以下的技术方案实现的:
一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物,包括正向引物和反向引物:
正向引物F:5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
反向引物R:5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’。
所述引物在用于产气肠杆菌的PCR检测时,具体如下操作:
步骤一,提取样品DNA,PCR法扩增;
PCR检测体系为20 μL的反应体系,具体为:
10×PCR buffer(含Mg2+) 2 μL,
2.5mmol/L的dNTP 1.6 μL,
5 U/μL 的rTaq酶 0.16 μL,
20 μM的引物对 0.8 μL,
模板DNA 1-2 μL,
最后用灭菌双蒸水补至20 μL;
PCR检测反应程序为:94℃预变性4min;进入循环,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环;72℃延伸5min,降温至4℃,结束。
步骤二,取10μL PCR扩增产物,1%琼脂糖凝胶电泳检测,判断样品种是否含有产气肠杆菌;所述判断具体为:1%凝胶电泳电泳检测扩增产物,若电泳结果在201bp出现单一条带,则说明样品种含有产气肠杆菌;反之,则样品中不含产气肠杆菌。
与现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:采用本发明的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。同时,本发明所涉及的仪器设备、试剂等较为常用,一般基层实验室即可开展检测工作,实用性更强。本发明检测靶点具有单一特异性,检测结果特异,易于判定。
附图说明
图1为实施例中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图;
图2为实施例中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图;
图3为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Habor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
步骤一,设计特异性扩增产气肠杆菌的引物对
引物序列为: F:5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
R:5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’;
步骤二,DNA模板制备
将产气肠杆菌接种于5ml营养肉汤液体培养基中,于35℃恒温摇床中振荡培养12h增菌后,取1ml菌液,放入1.5ml无菌离心管中;12000r/min离心15min,弃尽上清液,加入500μL灭菌双蒸水,用移液器轻轻吹打,重悬菌体,12000r/min离心15min,弃尽上清液,收集细菌;加入100μL灭菌双蒸水,用移液器轻轻吹打,重悬菌体,置于沸水中煮15min,立即取出,在-20℃放置30min。随后35℃解冻,12000r/min离心15min,取上清液放置4℃备用或-20℃保存;
步骤三,产气肠杆菌特异性PCR检测方法建立
PCR检测体系为20 μL的反应体系,具体为:
10×PCR buffer(含Mg2+) 2 μL,
2.5mmol/L的dNTP 1.6 μL,
5 U/μL 的rTaq酶 0.16 μL,
20 μM的引物对 0.8 μL,
模板DNA 1-2 μL,
最后用灭菌双蒸水补至20 μL;
PCR检测反应程序为:94℃预变性4min;进入循环,94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,30个循环;72℃延伸5min,降温至4℃,结束;
步骤四,PCR扩增结果凝胶电泳判定
所述判断具体为:1%凝胶电泳检测扩增产物,紫外灯照射下观察电泳结果,如果出现201bp的单一扩增条带,则说明样品种含有产气肠杆菌;反之,则样品中不含产气肠杆菌。
PCR检测方法特异性评估实验
按上述DNA模板制备与PCR检测方法,对本实验室保存的产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、生癌肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、腐败希瓦氏菌进行PCR扩增反应。
特异性检测结果见图1。图中:泳道M为DL2000分子量标准;泳道1为模板为灭菌水蒸水的阴性对照;泳道2-10为产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTH01株、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 315B株、大肠杆菌Escherichia coli DH5株、生癌肠杆菌Enterobacter cancerogenus CX1株、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii CX2株、粘质沙雷菌Serratia marcescens NTH03株、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila NTH071株、温和气单胞菌Aeromonas sobria NTH072株、腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens NTH04株。
图1中电泳结果为只有产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTH01株在201bp处出现特异条带,而其他菌种未出现特异条带。
PCR检测方法灵敏度评价实验
接种产气肠杆菌于3ml营养肉汤液体培养基中,置于35℃恒温摇床中振荡培养12h增菌后,用灭菌营养肉汤液体培养基10倍梯度稀释后,平板法计数得到细菌浓度为108cfu/ml,取1ml菌液按实施例1提取基因组DNA,用灭菌双蒸水按100-10-7进行10倍梯度稀释基因组DNA,以梯度稀释液为模板进行PCR扩增,凝胶电泳检测扩增产物,紫外灯照射下观察凝胶电泳结果,如图2所示。图2中:泳道M为DL2000分子量标准,泳道1为产气肠杆菌阳性对照,泳道2-9为初始模板DNA的100-10-7稀释液PCR扩增结果。由图2可知,在泳道8可以看到清晰条带,相对应检测细菌浓度为102cfu/ml,本法具有较好的灵敏度。
临床疑似菌株检测
利用上述方法建立的产气肠杆菌特异性PCR检测方法对从临床分离到的6株疑似菌株进行检测。检测结果见图3,图中泳道M为DL2000分子量标准,泳道1为产气肠杆菌阳性对照,泳道2-7为6株疑似菌株,泳道8为模板为灭菌双蒸水的阴性对照。
图中可知,3号菌株呈阳性结果。
应当理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtaaccggtg aaaccgaaag c 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatgccgcct tcgtagtgga aatgg 25
Claims (1)
1. 一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物,包括正向引物和反向引物,其特征在于:
正向引物F:5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
反向引物R:5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210412342.5A CN102952880B (zh) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | 一种产气肠杆菌特异性pcr检测引物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210412342.5A CN102952880B (zh) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | 一种产气肠杆菌特异性pcr检测引物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102952880A true CN102952880A (zh) | 2013-03-06 |
CN102952880B CN102952880B (zh) | 2014-05-14 |
Family
ID=47762261
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210412342.5A Active CN102952880B (zh) | 2012-10-25 | 2012-10-25 | 一种产气肠杆菌特异性pcr检测引物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102952880B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105132561A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-12-09 | 杭州电子科技大学 | 一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法 |
CN107012218A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-08-04 | 南方医科大学南方医院 | 用于检测产气肠杆菌的lamp引物组、试剂盒及快速检测方法 |
CN107058459A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-08-18 | 中国检验检疫科学研究院 | 生活饮用水中菌落总数能力验证样品及其制备方法 |
CN108866215A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-11-23 | 苏州百源基因技术有限公司 | 一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101096645A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-01-02 | 广东省生态环境与土壤研究所 | 产气肠杆菌及其应用 |
-
2012
- 2012-10-25 CN CN201210412342.5A patent/CN102952880B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101096645A (zh) * | 2007-06-01 | 2008-01-02 | 广东省生态环境与土壤研究所 | 产气肠杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
叶云等: "PCR技术检测食品有害微生物的应用", 《食品与机械》 * |
马笑影等: "产气肠杆菌医院感染现状及耐药性分析", 《福建医药杂志》 * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105132561A (zh) * | 2015-09-14 | 2015-12-09 | 杭州电子科技大学 | 一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法 |
CN107012218A (zh) * | 2017-04-06 | 2017-08-04 | 南方医科大学南方医院 | 用于检测产气肠杆菌的lamp引物组、试剂盒及快速检测方法 |
CN107012218B (zh) * | 2017-04-06 | 2020-09-15 | 南方医科大学南方医院 | 用于检测产气肠杆菌的lamp引物组、试剂盒及快速检测方法 |
CN107058459A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-08-18 | 中国检验检疫科学研究院 | 生活饮用水中菌落总数能力验证样品及其制备方法 |
CN108866215A (zh) * | 2017-12-01 | 2018-11-23 | 苏州百源基因技术有限公司 | 一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒 |
CN108866215B (zh) * | 2017-12-01 | 2022-02-08 | 苏州百源基因技术有限公司 | 一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102952880B (zh) | 2014-05-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Song et al. | Establishment of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of Brucella spp. and application to milk and blood samples | |
Chomel et al. | Isolation of Bartonella washoensis from a dog with mitral valve endocarditis | |
CN103667498B (zh) | 副溶血性弧菌的检测方法 | |
CN102952881B (zh) | 一种阴沟肠杆菌特异性pcr检测引物 | |
CN102102124B (zh) | 伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光pcr检测试剂盒 | |
CN103468811B (zh) | 小肠结肠炎耶尔森氏菌毒力基因多重pcr检测引物组和试剂盒 | |
CN102363815B (zh) | 运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法 | |
CN102952880B (zh) | 一种产气肠杆菌特异性pcr检测引物 | |
CN101144775B (zh) | 细菌实时荧光定量聚合酶链反应检测试剂盒 | |
CN101363061A (zh) | 检测食品沙门氏菌的Taqman探针荧光定量PCR方法 | |
CN103333903A (zh) | 检测幽门螺杆菌的靶序列、引物和探针及其试剂盒 | |
CN102925548A (zh) | 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌lamp试剂盒及使用方法 | |
CN102080125B (zh) | 用于检测鉴定伤寒沙门氏菌核酸片段的引物、探针及芯片 | |
CN105567821A (zh) | 炭疽芽孢杆菌荧光pcr检测试剂盒 | |
CN103993072B (zh) | 一种快速鉴定致病性香鱼假单胞菌的多重pcr检测试剂盒及其方法 | |
CN103981275A (zh) | 用于同时检测海洋中四种致病菌的多重pcr引物及其设计方法 | |
CN103305613B (zh) | 大鲵致病性嗜水气单胞菌pcr诊断试剂盒 | |
CN103146827B (zh) | 用于同时检测沙门菌枸橼菌变形菌和爱德华菌的多重pcr引物及其设计方法 | |
CN103014156B (zh) | 粪肠球菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒 | |
CN102936621B (zh) | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 | |
CN113774166A (zh) | 猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法 | |
CN102732599A (zh) | 双重聚合酶链反应方法检测海水样品中的创伤弧菌和副溶血弧菌 | |
CN106282392A (zh) | 一种肠炎沙门氏菌pcr检测引物、检测试剂盒及检测方法 | |
CN104894232A (zh) | 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒 | |
CN103103249B (zh) | Q热贝纳柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |