CN102952880A - 一种产气肠杆菌特异性pcr检测引物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测的引物，具体涉及一种用于检测产气肠杆菌PCR检测的引物，属于生物检测技术领域。一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物：正向引物F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’；反向引物R：5’-GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG-3’。采用本发明的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。

Description

一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物
技术领域
本发明涉及一种用于检测的引物，具体涉及一种用于检测产气肠杆菌 PCR检测的引物，属于生物检测技术领域。
背景技术
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)为革兰氏阴性菌，主要存在于人和动物的肠道内，亦可存在水、土壤及腐败物中，同时它也是一种重要的条件致病菌。当宿主机体状态改变或细菌进入肠道以外的部位，往往会引起感染。近年来，由于第三代和第四代头孢菌素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用，使该菌的耐药菌株明显增多，有些菌株已经表现为多重耐药。多重耐药使得临床上对该菌引起的疾病的治疗趋于复杂化。多重耐药的一个主要原因是未能在第一时间辨明病原菌，在不明病原菌的情况下，滥用药物，从而导致细菌的耐药性的出现，导致多重耐药的产生。因此，临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段，辨明病原，从而针对性地防治。
传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读，不利于及时诊断病因，查找病原。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步应用于细菌的快速检测。然而，通过对现有技术的文献检索发现，目前尚未有利用PCR技术检测产气肠杆菌的报道。
发明内容
 本发明的目的在于提供一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物。该引物可用于产气肠杆菌的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判断，实用性强。
本发明是通过以下的技术方案实现的：
一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物：
正向引物F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
反向引物R：5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’。
所述引物在用于产气肠杆菌的PCR检测时，具体如下操作：
步骤一，提取样品DNA，PCR法扩增；
PCR检测体系为20 μL的反应体系，具体为：
10×PCR buffer(含Mg2+)    2 μL，
2.5mmol/L的dNTP       1.6 μL，
5 U/μL 的rTaq酶        0.16 μL，
20 μM的引物对          0.8 μL，
模板DNA               1-2 μL，
最后用灭菌双蒸水补至20 μL；
PCR检测反应程序为：94℃预变性4min；进入循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，结束。
步骤二，取10μL PCR扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品种是否含有产气肠杆菌；所述判断具体为：1%凝胶电泳电泳检测扩增产物，若电泳结果在201bp出现单一条带，则说明样品种含有产气肠杆菌；反之，则样品中不含产气肠杆菌。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。同时，本发明所涉及的仪器设备、试剂等较为常用，一般基层实验室即可开展检测工作，实用性更强。本发明检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，易于判定。 
附图说明
图1为实施例中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图；
图2为实施例中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图；
图3为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图。 
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
步骤一，设计特异性扩增产气肠杆菌的引物对
引物序列为： F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
R：5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’；
步骤二，DNA模板制备
将产气肠杆菌接种于5ml营养肉汤液体培养基中，于35℃恒温摇床中振荡培养12h增菌后，取1ml菌液，放入1.5ml无菌离心管中；12000r/min离心15min，弃尽上清液，加入500μL灭菌双蒸水，用移液器轻轻吹打，重悬菌体，12000r/min离心15min，弃尽上清液，收集细菌；加入100μL灭菌双蒸水，用移液器轻轻吹打，重悬菌体，置于沸水中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。随后35℃解冻，12000r/min离心15min，取上清液放置4℃备用或-20℃保存；
步骤三，产气肠杆菌特异性PCR检测方法建立
PCR检测体系为20 μL的反应体系，具体为：
10×PCR buffer(含Mg2+)    2 μL，
2.5mmol/L的dNTP       1.6 μL，
5 U/μL 的rTaq酶        0.16 μL，
20 μM的引物对          0.8 μL，
模板DNA               1-2 μL，
最后用灭菌双蒸水补至20 μL；
PCR检测反应程序为：94℃预变性4min；进入循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，结束；
步骤四，PCR扩增结果凝胶电泳判定
所述判断具体为：1%凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察电泳结果，如果出现201bp的单一扩增条带，则说明样品种含有产气肠杆菌；反之，则样品中不含产气肠杆菌。
PCR检测方法特异性评估实验
按上述DNA模板制备与PCR检测方法，对本实验室保存的产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、生癌肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、腐败希瓦氏菌进行PCR扩增反应。
特异性检测结果见图1。图中：泳道M为DL2000分子量标准；泳道1为模板为灭菌水蒸水的阴性对照；泳道2-10为产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTH01株、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 315B株、大肠杆菌Escherichia coli DH5株、生癌肠杆菌Enterobacter cancerogenus CX1株、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii CX2株、粘质沙雷菌Serratia marcescens NTH03株、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila NTH071株、温和气单胞菌Aeromonas sobria NTH072株、腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens NTH04株。
图1中电泳结果为只有产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTH01株在201bp处出现特异条带，而其他菌种未出现特异条带。
PCR检测方法灵敏度评价实验
    接种产气肠杆菌于3ml营养肉汤液体培养基中，置于35℃恒温摇床中振荡培养12h增菌后，用灭菌营养肉汤液体培养基10倍梯度稀释后，平板法计数得到细菌浓度为108cfu/ml，取1ml菌液按实施例1提取基因组DNA，用灭菌双蒸水按100-10-7进行10倍梯度稀释基因组DNA，以梯度稀释液为模板进行PCR扩增，凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察凝胶电泳结果，如图2所示。图2中：泳道M为DL2000分子量标准，泳道1为产气肠杆菌阳性对照，泳道2-9为初始模板DNA的100-10-7稀释液PCR扩增结果。由图2可知，在泳道8可以看到清晰条带，相对应检测细菌浓度为102cfu/ml，本法具有较好的灵敏度。
临床疑似菌株检测
利用上述方法建立的产气肠杆菌特异性PCR检测方法对从临床分离到的6株疑似菌株进行检测。检测结果见图3，图中泳道M为DL2000分子量标准，泳道1为产气肠杆菌阳性对照，泳道2-7为6株疑似菌株，泳道8为模板为灭菌双蒸水的阴性对照。
图中可知，3号菌株呈阳性结果。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
 <110>  浙江省淡水水产研究所
 
<120>  一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物
 
<130> 
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gtaaccggtg aaaccgaaag c                                                 21
 
 
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
gatgccgcct tcgtagtgga aatgg                                             25
 
 

Claims (1)

1. 一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物，其特征在于：
正向引物F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’
反向引物R：5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105132561A (zh) * 2015-09-14 2015-12-09 杭州电子科技大学 一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法
CN107012218A (zh) * 2017-04-06 2017-08-04 南方医科大学南方医院 用于检测产气肠杆菌的lamp引物组、试剂盒及快速检测方法
CN107058459A (zh) * 2017-05-24 2017-08-18 中国检验检疫科学研究院 生活饮用水中菌落总数能力验证样品及其制备方法
CN108866215A (zh) * 2017-12-01 2018-11-23 苏州百源基因技术有限公司 一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101096645A (zh) * 2007-06-01 2008-01-02 广东省生态环境与土壤研究所 产气肠杆菌及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101096645A (zh) * 2007-06-01 2008-01-02 广东省生态环境与土壤研究所 产气肠杆菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
叶云等: "PCR技术检测食品有害微生物的应用", 《食品与机械》 *
马笑影等: "产气肠杆菌医院感染现状及耐药性分析", 《福建医药杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105132561A (zh) * 2015-09-14 2015-12-09 杭州电子科技大学 一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法
CN107012218A (zh) * 2017-04-06 2017-08-04 南方医科大学南方医院 用于检测产气肠杆菌的lamp引物组、试剂盒及快速检测方法
CN107012218B (zh) * 2017-04-06 2020-09-15 南方医科大学南方医院 用于检测产气肠杆菌的lamp引物组、试剂盒及快速检测方法
CN107058459A (zh) * 2017-05-24 2017-08-18 中国检验检疫科学研究院 生活饮用水中菌落总数能力验证样品及其制备方法
CN108866215A (zh) * 2017-12-01 2018-11-23 苏州百源基因技术有限公司 一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒
CN108866215B (zh) * 2017-12-01 2022-02-08 苏州百源基因技术有限公司 一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量pcr试剂盒

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