CN102952881B - 一种阴沟肠杆菌特异性pcr检测引物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测的引物，具体涉及一种用于检测阴沟肠杆菌PCR检测的引物，属于生物检测技术领域。一种阴沟肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物：正向引物F：5’-CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT-3’；反向引物R：5’-CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3’。采用本发明的检测方法检测阴沟肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。

Description

一种阴沟肠杆菌特异性PCR检测引物
技术领域
本发明涉及一种用于检测的引物，具体涉及一种用于检测阴沟肠杆菌PCR检测的引物，属于生物检测技术领域。
背景技术
阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)为革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界中，在人和动物粪便、土壤、植物、昆虫中均可检出，它是人和动物肠道正常菌种之一，同时它也是一种重要的条件致病菌。近年来，由于第三代和第四代头孢菌素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用，使该菌在其选择压力下不断发展耐药机制，耐药菌株日益增多，已成为重要的医院感染病原菌，其引起的细菌感染性疾病常累及多个器官，包括皮肤软组织感染、泌尿系统感染、呼吸道感染以及败血症等。已有研究报道，阴沟肠杆菌作为条件致病菌不仅对人具有致病性，同时还对鱼类具有致病性。近年来，本课题组反复研究发现该菌对罗氏沼虾幼体具有极强的致病性，发病幼体主要表现为不吃食、无活力、应激强烈、成活率低。由于该菌的影响，导致许多罗氏沼虾育苗单位育苗不顺，严重者无法出苗，造成的经济损失巨大。在不明病原菌的情况下，滥用药物，一则针对性不强，效果不明显；二则导致细菌耐药性增强。因此，临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段，辨明病原，针对防治。
传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读，不利于及时诊断病因，查找病原，控制病情蔓延。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步应用于细菌的快速检测。已有学者以DnaJ为靶基因建立了阴沟肠杆菌real-time PCR检测方法，但该法的特异性不强。此外，与普通PCR相比real-time PCR需要实时荧光定量PCR仪，且实验成本与实验技术等要求都相对较高。因此，该法在基层使用具有一定局限性。经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的阴沟肠杆菌PCR检测方法、核酸及引物相关报道。本发明建立的检测方法可为临床上阴沟肠杆菌快速诊断和流行病学调查提供技术支撑。
发明内容
 本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种阴沟肠杆菌PCR检测引物。该引物可用于产气肠杆菌的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判断，实用性强。
本发明是通过以下的技术方案实现的：
一种阴沟肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物：
正向引物F：5’-CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT-3’
反向引物R：5’-CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3’。
所述引物在用于产气肠杆菌的PCR检测时，具体如下操作：
步骤一，提取样品DNA，PCR法扩增；
PCR检测体系为20 μL的反应体系，具体为：
10×PCR buffer(含Mg2+)    2 μL，
2.5mmol/L的dNTP       1.6 μL，
5 U/μL 的rTaq酶        0.16 μL，
20 μM的引物对          0.8 μL，
模板DNA               1-2 μL，
最后用灭菌双蒸水补至20 μL；
PCR检测反应程序为：94℃预变性4min；进入循环，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，结束。
步骤二，取10μL PCR扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品种是否含有阴沟肠杆菌；所述判断具体为：1%凝胶电泳电泳检测扩增产物，若电泳结果在385bp出现单一条带，则说明样品种含有阴沟肠杆菌；反之，则样品中不含阴沟肠杆菌。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明的检测方法检测阴沟肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。同时，本发明所涉及的仪器设备、试剂等较为常用，一般基层实验室即可开展检测工作，实用性更强。本发明检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，易于判定。 
附图说明
图1为实施例中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图；
图2为实施例中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图；
图3为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图。 
具体实施方式
    下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
步骤一，设计特异性扩增阴沟肠杆菌的引物对
引物序列为：F：5’-CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT-3’
            R：5’-CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3’。
步骤二，DNA模板制备
将阴沟肠杆菌接种于5ml营养肉汤液体培养基中，于35℃恒温摇床中振荡培养12h增菌后，取1ml菌液，放入1.5ml无菌离心管中；12000r/min离心15min，弃尽上清液，加入500μL灭菌双蒸水，用移液器轻轻吹打，重悬菌体，12000r/min离心15min，弃尽上清液，收集细菌；加入100μL灭菌双蒸水，用移液器轻轻吹打，重悬菌体，置于沸水中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。随后35℃解冻，12000r/min离心15min，取上清液放置4℃备用或-20℃保存。
步骤三，阴沟肠杆菌特异性PCR检测方法建立
PCR检测体系为：20 μL反应体系具体为，10×PCR buffer(含Mg2+)2 μL，2.5mmol/L的dNTP 1.6 μL，5 U/μL rTaq酶0.16 μL，20 μM引物对0.8 μL，模板DNA1-2 μL，最后用灭菌双蒸水补至20 μL；PCR检测反应程序为：94℃预变性4min；进入循环，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，结束。
步骤四，PCR扩增结果凝胶电泳判定
所述判断具体为：1%凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察电泳结果，如果出现385bp的单一扩增条带，则说明样品种含有阴沟肠杆菌；反之，则样品中不含阴沟肠杆菌。
PCR检测方法特异性评估实验
按实施例1中DNA模板制备与PCR检测方法，对本实验室保存的阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、生癌肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、粘质沙雷菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、腐败希瓦氏菌进行PCR扩增反应。
特异性检测结果见图1。图中：泳道M为DL2000分子量标准；泳道1为模板为灭菌水蒸水的阴性对照；泳道2-10为阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 315B株、产气肠杆菌Enterobacter aerogenes NTH01株、大肠杆菌Escherichia coli DH5株、生癌肠杆菌Enterobacter cancerogenus CX1株、弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii CX2株、粘质沙雷菌Serratia marcescens NTH03株、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila NTH071株、温和气单胞菌Aeromonas sobria NTH072株、腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens NTH04株。图1中电泳结果为只有阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 315B株在385bp处出现特异条带，而其他菌种未出现特异条带。
PCR检测方法灵敏度评价实验
    接种阴沟肠杆菌于3ml营养肉汤液体培养基中，置于35℃恒温摇床中振荡培养12h增菌后，用灭菌营养肉汤液体培养基10倍梯度稀释后，平板法计数得到细菌浓度为108cfu/ml，取1ml菌液按实施例1提取基因组DNA，用灭菌双蒸水按10-7-10-1进行10倍梯度稀释基因组DNA，以7个梯度稀释液为模板进行PCR扩增，凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察凝胶电泳结果，如图2所示。图2中：泳道M为DL2000分子量标准，泳道1-8为初始模板DNA的10-7-10-1稀释液PCR扩增结果。由图2可知，在泳道2可以看到清晰条带，相对应检测细菌浓度为102cfu/ml，本法具有较好的灵敏度。
实施例4：临床疑似菌株检测
利用实施例1建立的阴沟肠杆菌特异性PCR检测方法对从罗氏沼虾幼体中分离到的13株疑似菌株进行检测。检测结果见图3，图中泳道M为DL2000分子量标准，泳道1为阴沟肠杆菌阳性对照，泳道2为模板为灭菌双蒸水的阴性对照，泳道3-15为13株疑似菌株。图中可知，5、9、10、11、12、15号等6株菌株呈阳性结果。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
<110>  浙江省淡水水产研究所
 
<120>  一种阴沟肠杆菌特异性PCR检测引物
 
<130> 
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
catgacaccg gtgtttcccc agt                                               23
 
 
<210>  2
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
cggtcggtga agcccagaac cacta                                             25
 
 

Claims (1)

1. 一种阴沟肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物，其特征在于：
正向引物F：5’-CATGACACCGGTGTTTCCCCAGT-3’
反向引物R：5’-CGGTCGGTGAAGCCCAGAACCACTA-3’。
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