CN106282392A - 一种肠炎沙门氏菌pcr检测引物、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肠炎沙门氏菌PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法，所述检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物。检测试剂盒组分包括所述肠炎沙门氏菌PCR检测引物。检测方法以待检测样品DNA为模板，所述肠炎沙门氏菌PCR检测引物为引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外线下观察电泳结果，若在488bp处出现单一扩增条带，则判定待检测样品中含有肠炎沙门氏菌；若未出现相应的扩增条带，则样品中不含肠炎沙门氏菌。采用本发明的检测方法检测肠炎沙门氏菌，所需时间短，成本低，检测结果特异，结果判断简单。

Description

一种肠炎沙门氏菌PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及肠炎沙门氏菌检测技术领域，具体涉及一种肠炎沙门氏菌PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

肠炎沙门氏菌是最常见的沙门氏菌感染类型之一，是一种人兽共患的重要病原菌，其主要引起胃肠炎以及食物中毒。肠炎沙门氏菌在自然界广泛存在，无宿主特异性，各种动物源性食物是引起沙门氏菌感染的最常见媒介物。各种家禽、家畜在饲养、屠宰、加工、运输等处理过程中均有污染的可能，人类通常是由于摄入被污染的蛋类或未完全煮熟的肉类而被感染的。

近年来，由肠炎沙门氏菌致病的病例不断增多，已经引起了公共卫生的关注，建立实用、快速、高效的肠炎沙门氏菌检验方法尤为必要。传统的肠炎沙门氏菌的检测主要是依靠细菌，通过生化反应及血清学特征来进行鉴定，整个操作过程费时费力，复杂繁琐，通常需要3-5天才能出检测结果。PCR技术以其操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，逐步应用于肠炎沙门氏菌的检测中。目前，已针对一些靶基因建立了相应的PCR检测方法，但是，现有技术中选择的许多靶点特异性不强，易出现假阳性。虽然，也有用多重PCR方法检测肠炎沙门氏菌的报道，但多重PCR在实验成本和技术要求上都较普通PCR高，因而也存在一定的不足之处。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术中肠炎沙门氏菌PCR检测方法或特异性不强、容易出现假阳性，或存在实验成本和技术要求高的技术问题，而提供一种特异性强、检测灵敏度高、实验成本低、操作简便的肠炎沙门氏菌PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种肠炎沙门氏菌PCR检测引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的下游引物。本发明针对现有技术中PCR反应检测肠炎沙门氏菌选择的靶基因不合理，容易造成检测特异性低、容易出现假阳性的技术问题，特别通过生物信息学分析，从肠炎沙门氏菌基因组DNA序列中找到了特异性更好的DNA序列（如SEQ ID NO.1所示），将该序列作为本发明肠炎沙门氏菌的检测靶点，并针对该靶点设计了检测引物，经过检测采用本发明检测引物检测靶点基因具有单一特异性，检测结果特异性强的优异效果，检测结果更加真实可靠。

一种肠炎沙门氏菌检测试剂盒，组分包括所述肠炎沙门氏菌PCR检测引物。本发明肠炎沙门氏菌检测试剂盒中的PCR检测引物特异性强，检测精度高，采用本发明检测试剂盒对肠炎沙门氏菌进行PCR扩增检测，无需使用抗血清，降低了检测成本，且检测时间短，避免了采用传统检测方法繁琐、耗时的缺点。

进一步，其组分还包括dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。这些组分可以为扩增反应提供碱基原料，催化PCR反应扩增，使扩增反应的反应环境更加适宜扩增，增强扩增的特异性，并为扩增反应提供能量，促进扩增反应更快进行。

更进一步，所述肠炎沙门氏菌PCR检测引物的浓度为10 μM，所述dNTP的浓度为2.5mM，所述Mg²⁺的浓度为25 mM，所述PCR反应缓冲液为10×PCR反应缓冲液。采用这样浓度的组分，可以使扩增反应的稳定性和特异性更强，能够获得清晰的扩增片段，电泳中不容易出现弥散背景，电泳产物判断结果更加准确。

一种肠炎沙门氏菌的PCR检测方法，以待检测样品DNA为模板，所述肠炎沙门氏菌PCR检测引物为引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外线下观察电泳结果，若在488 bp处出现单一扩条带，则判定待检测样品中含有肠炎沙门氏菌。这样，以待检测样品DNA为模板，本发明检测引物为引物进行PCR扩增，若待检测样品中含有肠炎沙门氏菌，则会在引物和PCR反应作用下进行肠炎沙门氏菌特征基因片段的扩增，进而扩增产物进行电泳分析时，能够在488 bp处检测到单一扩条带，若待检测样品中没有肠炎沙门氏菌，则不会进行PCR反应扩增出特定基因片段，进而不能在488 bp处检测到单一扩条带，达到了对待检测样品中是否含有肠炎沙门氏菌进行检测的目的。

作为优化，所述待检测样品DNA采用如下方法获得：将待检测样品接种于LB液体培养基中培养，对培养菌液进行离心和沉淀重悬处理后，将重悬菌液煮沸后冷却，将冷却后的重悬菌液离心取上清液，获得待检测样品DNA。采用这样的方法获取待检测样品DNA，方法简单易于操作，且获得的样品DNA模板在后续PCR扩增过程中扩增效果好，检测结果可靠性强。

作为优化，将待检测样品于接种于LB液体培养基中于37℃下培养8 h，取培养菌液于10000 r/min下离心2 min后弃上清液，重悬沉淀菌体得到重悬菌液，对重悬菌液再次于10000 r/min下离心2 min后再次重悬菌液，得到二次重悬菌液，将二次重悬菌液于沸水中煮沸，于-20 ℃冷却，将冷却后的二次重悬菌液于12000 r/min下离心10 min后取上清液，得到待检测样品DNA。采用多次离心重悬的方法，可以使获得的待检测样品DNA中杂质更少，避免了在PCR反应中带来干扰问题。

作为另一优化，PCR反应体系以25 μL计，组分为：灭菌双蒸水12 μL、10×PCR反应缓冲液2.5 μL、10 μM权利要求1所述上游引物1.0 μL、10 μM权利要求1所述下游引物1.0 μL、2.5 mM dNTP 1.5 μL、Taq酶1.0 μL、25 mM Mg²⁺ 2.0 μL和待检测样品DNA 4.0 μL。

作为进一步改进，所述PCR反应的条件为：先于94℃预变性5min；接着开始循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共30个循环；循环结束后于72℃延伸5min，最后降温至16℃，完成PCR反应操作。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、采用本发明的检测引物和PCR检测方法检测肠炎沙门氏菌，检测时间短，无需使用抗血清，降低了检测成本，避免了采用传统检测方法繁琐、耗时等缺点。

2、本发明的检测方法可以用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷。

3、本发明PCR检测方法的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异性好，不容易产生误判；且检测方法操作简便，耗时短，无需进行大量的结果分析步骤，检测结果判断简单。

4、采用本发明PCR扩增检测方法进行检测成本低，试验技术要求不高，便于进行市场化推广。

附图说明

图1为PCR检测方法特异性评价实验凝胶电泳图；

图2为PCR检测方法灵敏性评价实验凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

1、引物设计

针对现有技术中PCR反应检测肠炎沙门氏菌靶基因选择不合理，检测特异性低，容易出现假阳性的技术问题，本发明申请人通过生物信息学分析，从肠炎沙门氏菌基因组DNA序列中寻找特异的DNA序列（序列如SEQ ID NO.1所示），将其作为检测肠炎沙门氏菌的靶点，将此序列输入Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物，设置GC范围为40-60%，产物大小范围为100-1000bp，从备选引物中选择引物，结果选择的肠炎沙门氏菌检测引物如下：如SEQ ID NO.2所示的上游引物，核苷酸序列为5’tgtcagaaaccgctctggttatcg 3’；如SEQ IDNO.3所示的下游引物，核苷酸序列为5’attccaggtggaaagcattaacgac 3’。引物由宝生物工程大连有限公司合成。

2、模板准备

将肠炎沙门氏菌接种至20 mL LB液体培养液中，于37℃摇床培养8 h；取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，10,000 r/min离心2min，弃上清；向离心沉淀物中加入500 μL灭菌双蒸水重悬菌体，再次于10,000 r/min离心2min，弃上清，向离心沉淀中加100 μL灭菌双蒸水再次重悬菌体；将再次重悬菌体于沸水中煮6min，立即取出，于-20℃冷却后，再以12,000 r/min离心10min，取上清液于1.5mL离心管中，放置-20℃作为PCR扩增的DNA模板。

3、方法建立

肠炎沙门氏菌检测试剂盒，其组分包括如SEQ ID NO.2所示的上游引物、如SEQ IDNO.3所示的下游引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、水和PCR反应缓冲液。

25 μL PCR样品检测体系组成为：灭菌双蒸水12 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上游引物（10 μM） 1.0 μL，下游引物（10 μM） 1.0 μL，dNTP（2.5mM）1.5 μL，Taq酶1.0 μL，Mg²⁺（25mM） 2.0 μL，模板DNA 4.0 μL。

以无菌水为模板作为阴性对照，即25 μL PCR阴性对照体系组成为：灭菌双蒸水12μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，上游引物（10 μM） 1.0 μL，下游引物（10 μM） 1.0 μL，dNTP（2.5mM）1.5 μL，Taq酶1.0 μL，Mg²⁺（25mM） 2.0 μL，无菌水4.0 μL。

PCR反应参数为：首先94℃预变性5min；接着开始循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共30个循环；循环结束后72℃延伸5min，最后降温至16℃，结束操作。

依据下述判断标准确定样品中是否含肠炎沙门氏菌：取3 μL上述PCR扩增产物，经1.5 wt.%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下进行观察，如果PCR扩增产物电泳后在488 bp处出现单一扩条带，则表面样品中含肠炎沙门氏菌，如果在488 bp处未出现单一扩条带，则表面样品中不含肠炎沙门氏菌。

以上述“2、模板准备”得到的肠炎沙门氏菌DNA作为模板DNA，按照“3、方法建立”建立的体系组成和PCR反应方法进行PCR扩增，扩增结果显示在488 bp处观察到单一扩增条带，说明所建立的PCR方法能够成功检测出肠炎沙门氏菌。

4、特异性评价

取肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteriditis)、鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)、鼠伤寒沙门氏菌 (SalmonellaTyphimurium)、甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi A) 、乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi B) 、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorosis) 、都柏林沙门氏菌(Salmonella Dublin) 、伤寒沙门氏菌 (Salmonella Typhi) 、鸭沙门氏菌(Salmonella Anatum)等11株菌，其血清型及菌株编号见表1，按照“2、模板准备”的方法培养各菌株并提取各菌株基因组DNA模板。

按照与“3、方法建立”中相同的体系和反应方法对提取得到的各菌株基因组DNA模板分别进行PCR扩增，分别取4 mL各菌株基因组DNA作为模板加入PCR反应体系中进行PCR反应，反应产物经1.5 wt.%凝胶电泳，紫外灯下观察，结果如图1和表1所示，图1中1泳道:DNAMarker；2泳道:ddH₂O阴性对照；3泳道:鼠伤寒沙门氏菌；4泳道:鸡沙门氏菌；5泳道:猪霍乱沙门氏菌；6泳道:伤寒沙门氏菌；7泳道:肠炎沙门氏菌；8泳道:肠炎沙门氏菌。图1可见，肠炎沙门氏菌的PCR扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳后在488bp处出现单一条带，而其它菌株的PCR扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳后无任何条带，说明所建立的PCR检测方法可以特异检测到肠炎沙门氏菌。

表1 特异性试验所用菌株及结果

菌株	编号	菌数	结果
				Salmonella Typhimurium	ATCC14028	1	-
Salmonella Gallinarum	CMCC 50770	1	-
				Salmonella Choleraesuis	AS1.1190	1	-
Salmonella Typhi	CMCC 50086	1	-
				Salmonella Enteriditis	CVCC 3377	1	+
Salmonella Enteriditis	CMCC 50335	1	+
				Salmonella Pullorosis	CVCC 2001	1	-
Salmonella Paratyphi A	ATCC 9150	1	-
				Salmonella Paratyphi B	CMCC 50004	1	-
Salmonella Dublin	CVCC 2199	1	-
				Salmonella Anatum	CMCC 50774	1	-

-: PCR结果为阴性；+: PCR结果为阳性

5、灵敏性试验

按照“2、模板准备”的方法提取肠炎沙门氏菌基因组DNA模板，经测定所提取的DNA模板溶液中DNA浓度为 18.73 μg/mL，用无菌水10倍稀释该模板DNA，共稀释4个梯度，每个稀释度分别取4 mL作为模板DNA加入与“3、方法建立”中相同的PCR反应体系中进行PCR反应，反应产物经1.5 wt.%凝胶电泳，紫外灯下观察，结果如图2所示，图2中1泳道:DNA Marker；2泳道:ddH₂O阴性对照；3泳道:74.92ng；4泳道:7.492ng；5泳道:749.2pg；6泳道:74.92pg。图2表明，3-5泳道在488bp处能看到清晰的条带，其对应的DNA浓度分别为74.92ng/PCR、7.492ng/PCR和0.7492ng/PCR，浓度低于0.7492ng/PCR以后泳道在该处看不到条带，说明PCR检测灵敏度为749.2pg /PCR，具有较高的灵敏度。

6、肠炎沙门氏菌疑似菌株检测

利用所建立的肠炎沙门氏菌特异性PCR检测方法，对从食品中自行分离的45株疑似沙门氏菌进行了检测，这些食品样品采集于乡村农贸市场，参照国标GB 4789.4-2010进行样品处理和疑似菌株分离。

按照与“2、模板准备”相同的方法提取各个分离得到的菌株的基因组DNA模板，采用与“3、方法建立”中相同的体系和反应方法对提取得到的各个分离菌株的基因组DNA模板分别进行PCR扩增，结果从中检出6株疑似菌株肠炎沙门氏菌阳性，进一步对这6株疑似菌株进行沙门氏菌属诊断血清（兰州生物制品研究所）鉴定，结果是9：g,m:-，与肠炎沙门氏菌的血清型（1,9,12：g,m:-）相符合，判断其为肠炎沙门氏菌（血清鉴定步骤参见产品说明书及国标GB 4789.4-2010），其它疑似菌株经鉴定都不是肠炎沙门氏菌，说明所建立的肠炎沙门氏菌特异性PCR检测方法具有非常高的可靠性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110> 重庆理工大学；

<120> 一种肠炎沙门氏菌PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法；

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.1的核苷酸序列

<400> 1

ttgagagtta ttgatatgtc agaaaccgct ctggttatcg taaaattcct aattggtaaa 60

tccgtcggac aatttatgct cacagtggct ttatttttct taattatcat cttcattcct 120

agagatatta cggagcttat tgaggcgcgt agcgatttac catatgccgt tcagattttt 180

agttttgctg tggcttacct tatagtgctg atcctcaaag tcactggtta ttttttcgtg 240

tcggcgctgc cgttgtgcca gcgtaggggc agggcaaaac gcatgttaaa aacgcttaat 300

tcattgagta ctgaacagct gtttttactt gaaccctttc ttaaaactca ttctcccact 360

ttccgggcgt cctgggataa ccctgatgca gatgctctgg ttaaggcagg tatcgttcgt 420

ccggctggtt cgtgtatcga cggtgtttct gtgatgttca aaatcgaacc cgagtatgag 480

tcgttaatgc tttccacctg gaatccctgc acaaaacggt tcgatattag ccgttag 537

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物

<400> 2

tgtcagaaac cgctctggtt atcg 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物

<400> 3

attccaggtg gaaagcatta acgac 25

Claims (9)

1.一种肠炎沙门氏菌PCR检测引物，其特征在于，所述引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的下游引物。

2.一种肠炎沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，其组分包括权利要求1所述肠炎沙门氏菌PCR检测引物。

3.根据权利要求2所述肠炎沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，其组分还包括dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

4.根据权利要求3所述肠炎沙门氏菌检测试剂盒，其特征在于，所述肠炎沙门氏菌PCR检测引物的浓度为10 μM，所述dNTP的浓度为2.5 mM，所述Mg²⁺的浓度为25 mM，所述PCR反应缓冲液为10×PCR反应缓冲液。

5.一种肠炎沙门氏菌的PCR检测方法，其特征在于，以待检测样品DNA为模板，权利要求1所述肠炎沙门氏菌PCR检测引物为引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外线下观察电泳结果，若PCR扩增产物电泳后在488 bp处出现单一扩条带，则判定待检测样品中含有肠炎沙门氏菌。

6.根据权利要求5所述肠炎沙门氏菌的PCR检测方法，其特征在于，所述待检测样品DNA采用如下方法获得：将待检测样品接种于LB液体培养基中培养，对培养菌液进行离心和沉淀重悬处理后，将重悬菌液煮沸后冷却，将冷却后的重悬菌液离心取上清液，获得待检测样品DNA。

7.根据权利要求6所述肠炎沙门氏菌的PCR检测方法，其特征在于，将待检测样品于接种于LB液体培养基中于37℃下培养8 h，取培养菌液于10000 r/min下离心2 min后弃上清液，重悬沉淀菌体得到重悬菌液，对重悬菌液再次于10000 r/min下离心2 min后再次重悬菌液，得到二次重悬菌液，将二次重悬菌液于沸水中煮沸，于-20 ℃冷却，将冷却后的二次重悬菌液于12000 r/min下离心10 min后取上清液，得到待检测样品DNA。

8.根据权利要求5所述肠炎沙门氏菌的PCR检测方法，其特征在于，PCR反应体系以25 μL计，组分为：灭菌双蒸水12 μL、10×PCR反应缓冲液2.5 μL、10 μM权利要求1所述上游引物1.0 μL、10 μM权利要求1所述下游引物1.0 μL、2.5 mM dNTP 1.5 μL、Taq酶1.0 μL、25 mMMg²⁺ 2.0 μL和待检测样品DNA 4.0 μL。

9.根据权利要求5所述肠炎沙门氏菌的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：先于94℃预变性5min；接着开始循环，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸40s，共30个循环；循环结束后于72℃延伸5min，最后降温至16℃，完成PCR反应操作。