CN104774969A - 一种鉴定禽源沙门氏菌的多重pcr检测试剂盒及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒，所述多重PCR检测试剂盒包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、Taq DNA聚合酶以及bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对。本发明还公开了一种应用所述试剂盒鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测方法。本发明的多重PCR检测试剂盒能有效地确定待检测样品中是否含有沙门氏菌，还能进一步鉴别家禽生产或者家禽产品中流行的不同沙门氏菌血清型；本发明通过一个PCR反应，能够从样品中同时检测沙门氏菌并进一步鉴定出不同的沙门氏菌血清型，检测反应灵明度高，特异性强，且检测过程快速，高效，适合进行大批量检测。

Description

一种鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒及其方法
技术领域
本发明属于PCR检测技术领域，具体涉及一种鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒及其方法。
背景技术
沙门氏菌是一种常见的人畜共患病病原，部分血清型沙门氏菌在家禽生产过程中的感染和污染严重影响家禽生产效率，危害养禽业；在世界各地的食物中毒事件中，沙门氏菌引起的中毒病例已经上升至首位或者第二位，其中沙门氏菌感染家禽是经食物链传播给人类的重要媒介之一。据美国CDC和FDA的年鉴报道，近5年家禽生产中流行病学调查研究表明，在家禽生产临床样品中，肠炎沙门氏菌是最流行的血清型，而海德堡沙门氏菌是非临床样本中检出率最高的血清型，肯塔基沙门氏菌则流行于临床和非临床样本中。在美国和欧美国家，通过鸡白痢净化措施，基本控制鸡白痢沙门氏菌对家禽生产的影响，但在净化后的家禽养殖过程中，肠炎沙门氏菌占据原有鸡白痢沙门氏菌的生态位，导致肠炎沙门氏菌在家禽中隐性带毒或者爆发疾病，使之成为临床上重要的沙门氏菌流行血清型；而且与西方发达国家的情况明显不同的是，在我国以及众多发展中国家的鸡群中还普遍存在鸡白痢沙门氏菌，肠炎沙门氏菌与鸡白痢在抗原表位上的相似性以及两者引起禽群发病的临床症状和病理学变化相似性，在临床感染中往往把鸡肠炎沙门氏菌感染混淆于鸡白痢或伤寒，加大两者在检测与鉴定上的难度。
鉴于沙门氏菌对家禽生产和食品安全的重要影响，从养殖过程中开始控制与清除这些病原菌是提高生产效率和避免食品污染的关键。近来世界各国都提高了家禽生产各个过程中产品沙门氏菌携带的要求，如美国2015年新的提案要求家禽生产商将生鸡块中沙门氏菌的含量从当前的24％左右降低到16％，而生产中的不同血清型沙门氏菌感染和污染的复杂性，迫切需要一种可同时快速、准确地检测沙门氏菌并同时能区分不同优势血清型沙门氏菌的检测方法。
目前对于沙门氏菌的检测，可以分为细菌学检测、免疫学检测和核酸检测三类。细菌学检测通常是根据沙门氏菌的生长特性，采用选择性的培养基使沙门氏菌成为优势菌群，对菌落分离物进行一系列生化和血清学检测，以作出鉴定，传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4-7天，费时费力；免疫学检测法根据菌体表面抗原特性，抗原-抗体反应的特异性进行沙门氏菌的检测，而个体抗体水平极大影响检测的准确性。目前也有针对部分血清型沙门氏菌建立的PCR等检测方法，市场上的产品(沙门氏菌PCR快速检测试剂盒-北京福德安科技有限公司；沙门氏菌属(salmonella.spp)荧光定量PCR检测试剂盒-杜邦中国-主要用于食品中沙门氏菌的检测)，是根据沙门氏菌的物种特异性基因片段，利用PCR反应后通过核酸电泳确定是否含有目的条带，进而达到检测样品中是否含有沙门氏菌的目的；有部分技术是鉴定单一沙门氏菌血清型技术(如一种肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)检测方法)，但上述均为单一PCR；而其他的多重PCR技术则是同时鉴别不同种属致病菌，如：沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌、大肠杆菌多重PCR快速检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中沙门氏菌检测的不足，提供一种鉴定多种血清型沙门氏菌的PCR检测试剂盒及方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒，所述多重PCR检测试剂盒包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、Taq DNA聚合酶以及bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对；
其中，bcf基因的上下游引物分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；heli基因的上下游引物分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；rhs基因的上下游引物分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；sdf基因的上下游引物分别由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；fla基因的上下游引物分别由SEQID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对的浓度均为10pmole/ml，在PCR反应体系中bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对的最终浓度为0.6pmole/ml、2pmole/ml、2.6pmole/ml、2.6pmole/ml、2.6pmole/ml。
PCR缓冲液为10×PCR缓冲液，10×PCR缓冲液包括100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40。
脱氧核糖核苷三磷酸混合物中dGTP、dCTP、dATP、dTTP的浓度均为25mM，在PCR反应体系中dGTP、dCTP、dATP、dTTP的最终浓度均为0.5mM。
Taq DNA聚合酶的浓度为2.5U/μl，在PCR反应体系中Taq DNA聚合酶的最终浓度0.125U/μl。
本发明还提供了一种鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)从禽源沙门氏菌的增菌培养液中提取基因组DNA，得到PCR待检测模板；
(2)多重PCR扩增：取PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、Taq DNA聚合酶以及基因bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对装入一无菌的PCR反应薄壁管中，补水至25μl，同时设置阳性、阴性对照；PCR仪进行扩增反应；将得到的扩增产物进行电泳检测及结果分析。
25μl的PCR反应体系中，有10×PCR缓冲液2.5μl，脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.5μl，Taq DNA聚合酶1.25μl，bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对混合物1μl。
采用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌基因组，得到PCR待检测模板。
PCR待检测模板制备过程为：取1ml待检测增菌培养液，13000rpm离心处理5min，超纯水洗涤一次后，100μl超纯水重悬待检沉淀，煮沸5min，冰浴5min后，13000rpm离心取上清，得到PCR待检测模板。
PCR扩增反应条件为94℃预变性3min，94℃变性45s，56℃退火30s、72℃延伸45s，共25个循环，最后72℃延伸10min后，取出于4℃保存。
本发明的有益效果为：
(1)本发明的的多重PCR检测试剂盒不仅能有效地确定待检测样品中是否含有沙门氏菌，还能进一步鉴别家禽生产或者家禽产品中流行的不同沙门氏菌血清型，包括肯塔基沙门氏菌，肠炎沙门氏菌，鸡白痢沙门氏菌和海德堡沙门氏菌，上述沙门氏菌血清型，是目前国内外流行病学调查显示的家禽生产(临床样品和非临床样品)及家禽产品中优势血清型。
(2)本发明通过一个PCR反应，能够从样品中同时检测沙门氏菌并进一步鉴定出不同的沙门氏菌血清，检测反应灵明度高，特异性强，且检测过程快速，高效，适合进行大批量检测。
附图说明
图1为禽源沙门氏菌的PCR条带展示图：
图2为同一菌株经不同的模板制备方法所得PCR反应模板对禽源沙门氏菌的电泳检测结果图；
图3为多重PCR对养殖场棉拭子沙门氏菌样品的电泳检测结果图；
图4为多重PCR对农贸市场棉拭子沙门氏菌样品的电泳检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行详细地解释说明。
实施例1
一种禽源沙门氏菌多重PCR检测方法，包括以下步骤：
1、PCR模板的制备方法如下：
(1)沙门氏菌ATCC14028，肠炎沙门氏菌CMCC50336、鸡白痢沙门氏菌CMCC50770、海德堡沙门氏菌CMCC50111、肯塔基沙门氏CMCC50794分别在无菌的亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)中37℃培养12h。
(2)取1ml经增菌液培摇瓶培养12h的菌液，采用商品化试剂盒，细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，天根生化科技)提取细菌基因组，作为多重PCR待检测模板；
2、禽源沙门氏菌多重PCR扩增试剂的配置方法如下：
(1)根据现有技术合成5对特异性引物bcf-F/R、Heli-F/R、rhs-F/R、sdf-F/R、fla-F/R，用超纯水稀释，使其浓度为10pmole/ml，其中5对特异性基因的上下游引物序列见表1；
(2)多重PCR扩增试剂：10×的PCR缓冲液(100mM KCl、80mM(NH4)SO4，pH9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和质量体积比为0.5％的Tergitol-type NP-40)；dNTP混合物(脱氧核糖核苷三磷酸混合物)(浓度均为25mM的dGTP(鸟嘌呤脱氧核糖核苷三磷酸)、dCTP(胞嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸)、dATP(腺嘌呤脱氧核糖核苷三磷酸)和dTTP(胸腺嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸))；引物混合物；DNA聚合酶(2.5U/ULTaq)；
3、特异性鉴定禽源沙门氏菌多重PCR检测试剂盒的装配：
(1)取10×的PCR缓冲液2.5μl，浓度各为25mM的dGTP、dCTP、dATP、dTTP混合物0.5μl，浓度为2.5U/μl Taq DNA聚合酶1.25μl，bcf-F/R、Heli-F/R、rhs-F/R、sdf-F/R、fla-F/R的终浓度分别为：0.6pmole/ml、2pmole/ml、2pmole/ml、2.6pmole/ml、2.6pmole/ml的引物混合物1μl，于一无菌的PCR反应薄壁管中。
(2)加入已制备好的待检测模板1μl，补水至总体积25μl即可。
4、PCR扩增循环参数为：
(1)94℃预变性3min；
(2)然后进入循环：94℃变性45s、56℃退火30s、72℃延伸1min共25个循环，最后72℃延伸10min后，取出于4℃保存。
5、多重PCR检测结果判定
取5μl PCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果判定标准详见图1和图2。
图1中，L1为沙门氏菌/Salmonella，L2为海德堡沙门氏菌/S.Heidelberg，L3为鸡白痢沙门氏菌/S.Pollorum，L4为肠炎沙门氏菌/S.Enteritidis，L5为肯塔基沙门氏菌/S.Kentucky，L6为marker NEB 100bpDNA Ladder(1517bp,1200bp,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp)。
PCR条带组合说明：PCR条带分别标注为条带1(170bp)，条带2(293bp)，条带3(417bp)，条带4(782bp)，条带5(993bp)；分别指示fla基因、sdf基因、rhs基因、heli基因和bcf基因，其中条带5指示为沙门氏菌菌株(待检测模板成功扩增此条带，说明此待检测模板含沙门氏菌基因组)，条带5和条带4组合指示此待检测模板为海德堡沙门氏菌；条带5和条带3组合指示此待检测模板为鸡白痢沙门氏菌血清型，条带5和条带2组合指示此待检测模板为肠炎沙门氏菌血清型，条带5和条带1组合指示此待检测模板为肯塔基沙门氏菌血清型。
图2为同一菌株经不同的模板制备方法所得PCR反应模板对禽源沙门氏菌的电泳检测结果图。lane1-5分别是以肠科沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌)，海德堡沙门氏菌，鸡白痢沙门氏菌，肠炎沙门氏菌和肯塔基沙门氏菌培养物以细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，天根生化科技)，所得基因组为PCR待检测模板，提取操作按说明书进行；lane 7-11以肠科沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌)，海德堡沙门氏菌，鸡白痢沙门氏菌，肠炎沙门氏菌和肯塔基沙门氏菌培养物煮沸法所得基因组模板为PCR待检测模板，L6和L12为NEB100bp DNA Ladder。
表1 bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因和fla基因上下游引物序列
实施例2
检测养殖场棉拭子沙门氏菌流行情况：
(1)无菌采集棉拭子50份；
(2)棉拭子增菌培养：
将棉拭子接种于无菌的增菌培养基(亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC))37℃培养15h。
(3)PCR模板的制备：
取上述1ml菌液于无菌1.5ml EP管中，标记。超纯水洗涤一次，细菌沉淀溶解于500μl，煮沸5min后，冰上冷却，离心13000rpm/5min，上清为多重PCR模板。
(4)多重PCR扩增试剂的组装
取10×的PCR缓冲液2.5μl，浓度各为25mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物0.5μl，浓度为2.5U/μl Taq DNA聚合酶1.25μl，bcf-F/R、Heli-F/R、rhs-F/R、sdf-F/R、fla-F/R的终浓度分别为：0.6pmole/ml、2pmole/ml、2pmole/ml、2.6pmole/ml、2.6pmole/ml的引物混合物1μl，于一无菌的PCR反应薄壁管中。加入步骤(3)制备的PCR待检测模板，补水至总体积25μl即可，同时做阳性和阴性对照各一。
(5)多重PCR扩增
PCR扩增循环参数为：94℃预变性3min后，进入循环：94℃变性45s、56℃退火30s、72℃延伸1min共25个循环，最后72℃延伸10min后，取出于4℃保存。
(6)多重PCR检测结果判定
取5μl PCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定。
(7)检测结果
由图3可知，本次共检测到11份沙门氏菌阳性结果，同时进一步区分出鸡白痢沙门氏菌5株(L2，3，4，6，8，13)，肠炎沙门氏菌3株(L5，9,10)，肯塔基沙门氏菌1株(L11)，海德堡沙门氏菌1株(L7)，未能鉴定出血清型的沙门氏菌1株(L12)。此外，相同样品按照GB 4789.4-2010沙门氏菌检验国家标准推荐的分离鉴定方法，仅得到4株沙门氏菌(鸡白痢沙门氏菌2株，肠炎沙门氏菌和海德堡沙门氏菌各1株)，阳性检出率显著低于本发明的检测方法。其中，L1为NEB 100bp DNA Ladder；L2-L13为待检测样品；L14为空白对照。
实施例3
检测农贸市场棉拭子沙门氏菌流行情况：
(1)无菌采集棉拭子120份；
(2)棉拭子增菌培养
将棉拭子接种于无菌的增菌培养基(亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC))37℃培养18h。
(3)PCR模板的制备
取上述1ml菌液于无菌1.5ml EP管中，标记。超纯水洗涤一次，细菌沉淀溶解于500μl，煮沸5min后，冰上冷却，离心13000rpm/5min，上清为多重PCR模板。
(4)多重PCR扩增试剂的组装
取10×的PCR缓冲液2.5μl，浓度各为25mM的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物0.5μl，浓度为2.5U/μl Taq DNA聚合酶1.25μl，bcf-F/R、Heli-F/R、rhs-F/R、sdf-F/R、fla-F/R的终浓度分别为：0.6pmole/ml、2pmole/ml、2pmole/ml、2.6pmole/ml、2.6pmole/ml的引物混合物1μl，于一无菌的PCR反应薄壁管中。加入步骤(3)制备的多重PCR模板，补水至总体积25μl即可，同时做阳性和阴性对照各一。
(5)多重PCR扩增
PCR扩增循环参数为：94℃预变性3min后，进入循环：94℃变性45s、56℃退火30s、72℃延伸1min共25个循环，最后72℃延伸10min后，取出于4℃保存。
(6)多重PCR检测结果判定
取5μl PCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定。
(7)检测结果
由图4可知，本次共检测到18份沙门氏菌阳性结果，同时进一步区分出鸡白痢沙门氏菌8株(L2，3，9，10，14，16，17，18)，肠炎沙门氏菌5株(L7，8，16，17)，肯塔基沙门氏菌2株(L4和L13)，海德堡沙门氏菌2株(L4和L15)，未能鉴定出血清型的沙门氏菌1株(L6)。此外，相同样品按照GB 4789.4-2010沙门氏菌检验国家标准推荐的分离鉴定方法，仅得到3株沙门氏菌(鸡白痢沙门氏菌2株，肠炎沙门氏菌1株)，阳性检出率显著低于本发明的检测方法。其中，L1为NEB 100bp DNA Ladder；L2-L19为待检测样品；L20为空白对照。
本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述多重PCR检测试剂盒包括PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、TaqDNA聚合酶以及bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对；
其中，bcf基因的上下游引物分别由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；heli基因的上下游引物分别由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；rhs基因的上下游引物分别由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；sdf基因的上下游引物分别由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示；fla基因的上下游引物分别由SEQID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对的浓度均为10pmole/ml，在PCR反应体系中bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对的最终浓度为0.6pmole/ml、2pmole/ml、2.6pmole/ml、2.6pmole/ml、2.6pmole/ml。
3.根据权利要求1所述的鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：PCR缓冲液为10×PCR缓冲液，10×PCR缓冲液包括100mMKCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40。
4.根据权利要求1所述的鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：脱氧核糖核苷三磷酸混合物中dGTP、dCTP、dATP、dTTP的浓度均为25mM，在PCR反应体系中dGTP、dCTP、dATP、dTTP的最终浓度均为0.5mM。
5.根据权利要求1所述的鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：Taq DNA聚合酶的浓度为2.5U/μl，在PCR反应体系中Taq DNA聚合酶的最终浓度0.125U/μl。
6.一种应用如权利要求1-5任一项所述试剂盒鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)从禽源沙门氏菌的增菌培养液中提取基因组DNA，得到PCR待检测模板；
(2)多重PCR扩增：取PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸混合物、Taq DNA聚合酶以及基因bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对装入一无菌的PCR反应薄壁管中，补水至25μl，同时设置阳性、阴性对照；PCR仪进行扩增反应；将得到的扩增产物进行电泳检测及结果分析。
7.根据权利要求6所述的鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测方法，其特征在于：25μl的PCR反应体系中，有10×PCR缓冲液2.5μl，脱氧核糖核苷三磷酸混合物0.5μl，Taq DNA聚合酶1.25μl，bcf基因、heli基因、rhs基因、sdf基因、fla基因的引物对混合物1μl。
8.根据权利要求6所述的鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测方法，其特征在于：采用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取细菌基因组，得到PCR待检测模板。
9.根据权利要求6所述的鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测方法，其特征在于，PCR待检测模板制备过程为：取1ml待检测增菌培养液，13000rpm离心处理5min，超纯水洗涤一次后，100μl超纯水重悬待检沉淀，煮沸5min，冰浴5min后，13000rpm离心取上清，得到PCR待检测模板。
10.根据权利要求6所述的鉴定禽源沙门氏菌的多重PCR检测方法，其特征在于：PCR扩增反应条件为94℃预变性3min，94℃变性45s，56℃退火30s、72℃延伸45s，共25个循环，最后72℃延伸10min后，取出于4℃保存。
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