CN107988405A - 一种印第安纳沙门氏菌pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法 - Google Patents

一种印第安纳沙门氏菌pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。所述试剂盒包括10×PCR缓冲液、2.5U/μl Taq DNA聚合酶、10mM dNTPs、印第安纳沙门氏菌特异性PCR检测引物、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照物为印第安纳沙门氏菌ATCC51959基因组DNA；所述阴性对照为灭菌双蒸水。本发明还公开了一种应用所述试剂盒检测印第安纳沙门氏菌的PCR方法。本发明方法具有快速、简单、特异性强、灵敏度高的优点，无需沙门氏菌诊断血清即可检测印第安纳沙门氏菌，相比传统的沙门氏菌血清学分型方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。

Description

一种印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒及其非诊断性检测 方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
背景技术
印第安纳沙门氏菌(Salmonella Indiana)最早于1955年分离自美国印第安纳州患呕吐、腹泻和发烧的女孩，其后该病原在北美和欧洲等地又引发了多起人与哺乳动物感染的疫情。在我国，印第安纳沙门氏菌早年的报道较少，但近年来在包括人、动物、食品和环境等不同来源中均具有较高的流行率，已成为仅次于肠炎沙门氏菌的流行血清型，超越了其它几种常见血清型(鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌等)。诸多研究表明，印第安纳沙门氏菌与人畜的呕吐、腹泻、发烧、胃肠炎、局部感染等病症密切相关。目前，印第安纳沙门氏菌在我国的广泛流行，已引起畜禽养殖、食品安全、公共卫生等领域的高度关注。
国内外对于印第安纳沙门氏菌的检测标准都是基于传统培养结合血清学分型的方法(如GB/T 4789.4-2008，SN 0170-92，AOAC 967.25-967.28，ISO 6579:2002/Amd 1:2007等)，由于上述方法包括前处理、预增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学测试等，过程繁琐且费时，不能达到及时发现病原、控制传播途经，消除污染源的疫病防控要求。随着科技的发展，以分子生物学为基础的病原检测方法在实践检验中不断取得新进展，成为取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一，其中PCR方法以其敏感、特异、简便、快速的特点成为在分子生物学水平建立的重要检测技术之一。
经对现有技术的文献检索发现，尚未发现与本发明的印第安纳沙门氏菌血清型PCR检测方法及试剂盒的报道。
发明内容
本发明针对传统技术在沙门氏菌检测分型中存在的不足，特别是如何提高检测效率、灵敏度与特异性，提供了一种特异性检测印第安纳沙门氏菌的PCR试剂盒及其非诊断性检测方法。
本发明技术方案如下：
本发明提供了一种特异性检测印第安纳沙门氏菌的PCR试剂盒及其非诊断性检测方法，所述印第安纳沙门氏菌的PCR试剂盒包括10×PCR缓冲液、2.5U/μl Taq DNA聚合酶、10mM dNTPs、PCR检测引物、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照物为印第安纳沙门菌ATCC51959基因组DNA，所述阴性对照为灭菌双蒸水。
进一步的，所述PCR试剂盒检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×PCR缓冲液2.5μl、dNTPs 2μl、Taq DNA聚合酶0.25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、DNA模板1μl以及适量的灭菌双蒸水。
进一步的，所述印第安纳沙门氏菌PCR检测方法的反应流程为：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸25s；共30个循环，最后72℃延伸10min。
进一步的，所述10×PCR缓冲液含有100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mMTris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40。
进一步的，所述印第安纳沙门氏菌PCR检测方法的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
更进一步的，一种使用印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。
S2：PCR扩增，将10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、检测引物以及DNA模板加入灭菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用PCR仪进行扩增反应；采用2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明根据比较基因组学筛选的印第安纳沙门氏菌特异基因序列设计引物，具有灵敏度高，特异性强的优点。同时，本发明只需通过一次反应，即可对印第安纳沙门氏菌进行快速检测，相比传统的细菌学结合血清学分型的检测方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。
附图说明
图1为实施例1中PCR检测方法的凝胶电泳展示图。图中：M为DL1000 DNA marker，泳道1为印第安纳沙门氏菌，泳道2为阴性对照；
图2为实施例2中PCR特异性评价实验中检测的45株沙门氏菌与非沙门氏菌标准菌株的凝胶电泳图。图中：M为DL 1000 DNA marker；泳道1-45分别为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、蒙特维的亚沙门氏菌、波茨坦沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、德比沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、阿贡纳沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、鸭沙门氏菌、圣保罗沙门氏菌、布洛克利沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌、火鸡沙门氏菌、科特布斯沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、雷丁沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、埃森沙门氏菌、吉夫沙门氏菌、弗雷斯诺沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、明尼苏达沙门氏菌、巴森海德沙门氏菌、邦戈尔沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、双亚利桑那沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、肺炎克雷伯氏菌；泳道46为阴性对照；
图3为实施例2中PCR特异性评价实验中印第安纳沙门菌ATCC51959扩增产物的酶切鉴定图。图中：M为DL 1000 DNA marker；泳道1为印第安纳沙门氏菌PCR产物；泳道2为酶切鉴定产物；泳道3为阴性对照；
图4为实施例3中PCR敏感性评价的凝胶电泳图。图中：M为DL 1000 DNA marker；泳道1-6分别为印第安纳沙门菌ATCC51959基因组DNA梯度稀释样品检测结果；泳道8-13分别为印第安纳沙门菌ATCC51959菌液梯度稀释样品检测结果；泳道7和14为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1印第安纳沙门氏菌PCR检测方法的建立
引物的设计：根据GenBank数据库中已知的不同血清型沙门氏菌基因组DNA序列，通过比较基因组学分析比对后，筛选出印第安纳沙门氏菌的特异性基因片段，在此基础上设计、优选得到用于特异性检测印第安纳沙门氏菌的PCR引物，如下表所示。
表1 印第安纳沙门氏菌PCR检测引物序列
PCR模板制备：将印第安纳沙门菌ATCC51959在脑心浸液肉汤培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。
PCR检测试剂的配制：10×PCR缓冲液(其组分包括100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)、10μM检测引物。
PCR检测体系及扩增程序：检测体系为25μl，具体包括：10×PCR缓冲液2.5μl，dNTPs 2μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，上游引物1μl，下游引物1μl、DNA模板1μl以及适量的灭菌双蒸水。扩增程序的步骤包括：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸25s；共30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR方法检测结果的判定：取5μl扩增产物，加1μl 6×Loading buffer混匀，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像仪下拍照判定。
结果判定标准如图1所示，图1中，M为DL1000 DNAmarker，泳道1为印第安纳沙门菌(片段大小为404bp)，泳道2为阴性对照。
实施例2特异性评价实验
用实施例1的方法进行本发明PCR检测方法的特异性评价，将试验菌株在脑心浸液肉汤培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，按照实施例1所述方法进行PCR检测，结果如图2所示，只有印第安纳沙门氏菌(泳道4)显示出特异性扩增条带，其它沙门氏菌血清型以及非沙门氏菌菌株均无特异性扩增。所用菌株及检测结果如下表所示，表中，检测结果栏目中“+”表示阳性；“－”表示阴性。
表2 本发明特异性评价试验结果
由于本发明的PCR扩增序列中均含有一个酶切位点AluI，可进一步用于印第安纳沙门氏菌扩增产物的特异性鉴定。将印第安纳沙门氏菌ATCC51959扩增产物1μg，加入1μLAluI、2μL缓冲液、灭菌双蒸水补足至20μL，轻轻混合后离心，在37℃条件下酶切1h，使用2.0％琼脂糖凝胶电泳观察结果，结果见图3。由图可见印第安纳沙门氏菌ATCC51959扩增产物可被AluI酶切成289bp和115bp两个条带，而阴性对照则无此现象。
实施例3灵敏度评价实验
用实施例1的方法进行本发明PCR检测方法的敏感性评价。将印第安纳沙门氏菌ATCC51959在脑心浸液肉汤培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组，测定其原始浓度后10倍梯度稀释，对不同稀释梯度细菌基因组DNA进行PCR扩增；同时将菌液进行细菌计数后10倍梯度稀释，取不同浓度细菌进行PCR扩增(PCR检测反应体系见表3)。PCR扩增结束后取5μl扩增产物，加1μl 6×Loading buffer混匀，使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图4所示，M为DL-1000 marker，泳道1-6为印第安纳沙门氏菌ATCC51959基因组DNA扩增结果(反应浓度依次为10ng/反应、1ng/反应、100pg/反应、10pg/反应、1pg/反应和0.1pg/反应)，泳道8-13为印第安纳沙门氏菌ATCC51959菌液扩增结果(反应浓度依次为1×105CFU/反应、1×104CFU/反应、1×103CFU/反应、1×102CFU/反应、1×101CFU/反应、1×100CFU/反应)，泳道7和14为阴性对照。如图4所示，本发明的PCR检测方法对基因组DNA的最低检出限为10pg/反应，对菌液的最低检出限为1×102CFU/反应。
表3 PCR检测反应体系
试剂 用量
10×PCR Buffer 2.5μl
Taq DNA聚合酶 0.25μl
dNTPs 2μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
待检样品(DNA或菌液) 1μl
无菌去离子水 适量
合计 25.0μl/反应
实施例4 PCR检测试剂盒的组装
根据实施例1表中的序列合成印第安纳沙门氏菌特异性检测引物，用灭菌双蒸水稀释为10μM浓度，等体积混合后得到检测引物；使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取印第安纳沙门氏菌ATCC51959基因组DNA作为阳性对照；PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液(其组分包括100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)、检测引物、阳性对照以及阴性对照(灭菌双蒸水)。
将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等)，组装成本发明所述的印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒。
实施例5临床样品检测
从家禽养殖场采集临床病料样品，接种于SBG增菌液中，37℃培养24h，使用商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，按照实施例1中的PCR方法进行印第安纳沙门氏菌检测，设置阳性对照和阴性对照。同时按照沙门氏菌检验国家标准(GB4789.4-2016)中的方法进行沙门氏菌分离鉴定与血清学分型。结果如表4所示，在采集的156份临床样品中，本发明提供的PCR方法与国标检测方法均检测出23例阳性样品，且2种检测方法符合率达100％，表明本发明试剂盒所建立的检测方法具有较好特异性。此外沙门氏菌国标检测方法(GB4789.4-2016)所需时间为4-5天，采用本发明试剂盒检测全程所用时间不足4小时。
表4 临床样品中印第安纳沙门氏菌的检测结果
样品 数量 PCR检测阳性数 国标方法检测阳性数
鸡病料 88 18 18
鸭病料 31 2 2
鹅病料 22 1 1
鸽病料 15 2 2
合计 156 23 23
以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。所以，如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法
<141> 2018-01-11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Salmonella Indiana
<400> 1
gcgaagccac tactcttgat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Salmonella Indiana
<400> 2
atcagtgcga tgtagattca 20

Claims (8)

1.一种印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒，其特征在于：包括缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、印第安纳沙门氏菌特异性PCR检测引物、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照物为印第安纳沙门菌ATCC 51959基因组DNA，所述阴性对照为灭菌双蒸水；所述印第安纳沙门氏菌特异性PCR检测引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR检测体系的组分为：每25μl反应液中包括10×PCR缓冲液2.5μl、dNTPs 2μl、Taq DNA聚合酶0.25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、DNA模板1μl以及适量的灭菌双蒸水。
3.根据权利要求1所述的印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述印第安纳沙门氏菌PCR检测方法的反应流程为：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸25s；共30个循环，最后72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述10×PCR缓冲液含有100mM KCl、80mM(NH4)SO4、pH为9.0的100mM Tris-HCl、15mM MgCl2和0.5％Tergitol-type NP-40。
5.根据权利要求1所述的印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述印第安纳沙门氏菌PCR检测方法的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求1所述的印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
7.根据权利要求1所述的印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒，其特征在于：所述上游引物和下游引物浓度均为10μM。
8.一种使用权利要求1-7任意一项所述的印第安纳沙门氏菌PCR检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。
S2：PCR扩增，将10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、检测引物以及DNA模板加入灭菌PCR反应管中，添加灭菌双蒸水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用PCR仪进行扩增反应；采用2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
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