CN102719564A - 鸭i型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的三重pcr试剂盒及其应用 - Google Patents

鸭i型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的三重pcr试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的引物对组、试剂盒及其应用。本发明所提供的引物对组由如下三个引物对组成：序列1和序列2、序列3和序列4，以及序列5和序列6分别所示的两条单链DNA组成的三个引物对；所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种。本发明建立一次PCR反应就能同时检测和鉴别番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒三种病原体的三重PCR技术，具有特异性强、灵敏度高（最低检测线1pg）、低成本、高效率等优点，而且在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。

Description

鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的三重PCR试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的引物对组、试剂盒及其应用，特别涉及一种鉴定或辅助鉴定番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒的引物对组、试剂盒及其应用。
背景技术
鸭I型肝炎病毒（Duck Hepatitis Virus type I，DHV I）是雏鸭的一种高度致死性的病毒性传染病的病原。该病主要侵害4周龄以内的雏鸭，死亡率高达90%以上，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。鸭圆环病毒（Duck Circovirus，DuCV）是近年来新发现的病毒之一，是在2003年由德国学者Hattermann等首先发现并测定序列的，之后分别在世界各地被发现报道。Soike等发现DuCV在临床上主要使病鸭表现为生长迟缓、羽毛凌乱、体重减轻等症状，更重要的是可感染禽类的免疫系统，引起免疫抑制。番鸭细小病毒(Muscovy duckling parvovirus，MDPV)，是危害番鸭养殖的重要病原，可引起1周龄~3周龄雏番鸭发病，致死率可达到50%~80%。
目前，这三种病毒的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和ELISA等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。
PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速、简便等特点，已经走进临床诊断实验室并广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于DuCV、MDPV和DHV的检测。三重PCR是一种特殊的PCR形式，其突出特点是，一次PCR反应，能同时检测并鉴别出三种病原体，在临床上具有很高的应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的引物对组。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的引物对组可由三个引物对组成，第一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述番鸭细小病毒的引物对1，第二个引物对是由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述鸭圆环病毒的引物对2，第三个引物对是由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述鸭I型肝炎病毒的引物对3。所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种。
其中，序列1由20个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由18个核苷酸组成；序列4由21个核苷酸组成；序列5由20个核苷酸组成；序列6由25个核苷酸组成。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的引物对组，也可由两个引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述番鸭细小病毒的引物对1，另一个引物对是下述两个引物对中的任一个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述鸭圆环病毒的引物对2，和由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述鸭I型肝炎病毒的引物对3；所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种。
在实际应用中，所述引物对组中的所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3在PCR反应体系中的摩尔比为5：5：3；所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3中各引物对的两条引物均等摩尔。
在本发明的一个实施例中，所述引物对组中，所述引物对1中的两条引物在PCR反应体系中的终浓度均为0.25μM，所述引物对2中的两条引物在PCR反应体系中的终浓度均为0.25μM，所述引物对3中的两条引物在PCR反应体系中的终浓度均为0.15μM。
本发明的再一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定番鸭细小病毒的引物对。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番鸭细小病毒的引物对由两条单链DNA组成，所述两条DNA单链分别为序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的单链DNA。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的试剂盒。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的试剂盒包含上述任一所述的引物对组，或所述的引物对；所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种。
上述任一所述的引物对组，或所述的引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。
该制备方法包括将上述任一所述的引物对组，或所述的引物对中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
上述PCR试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
该制备方法包括如下步骤：将上述任一所述的引物对组，或所述的引物对中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
上述任一所述的引物对组，或所述的引物对，或所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有鸭相关病毒产品中的应用也属于本发明的保护范围。所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种。
在所述应用中，所述鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有鸭相关病毒具体可为利用上述任一所述的引物对组，或所述的引物对，或所述的试剂盒对所述待测样品进行PCR扩增；所述PCR扩增的退火温度为50-60℃。
在本发明的一个实施例中，所述PCR扩增的退火温度具体为55℃。
所述待测样品来自健康的动物或死亡的动物，可为DNA和/或RNA。
实验证明，本发明建立一次PCR反应就能同时检测和鉴别番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒三种病原体的三重PCR技术，具有特异性强、灵敏度高、低成本、高效率等优点，而且本发明在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。本发明最低能同时检出1pg鸭I型肝炎病毒RNA、1pg鸭圆环病毒DNA和1pg番鸭细小病毒DNA，这对于在鸭的鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的发病早期提供准确的诊断结果，切断其传播途径有重要意义，具有广阔的应用前景，对鸭养殖业可持续发展有着重要的现实意义。
附图说明
图1为三重RT-PCR的敏感性试验结果。其中，泳道M为分子量标准100bp DNAladder；泳道1为10ng MDPV、10ng DuCV和10ng DHV I；泳道2为1ng MDPV、1ng DuCV和1ng DHV I；泳道3为100pg MDPV、100pg DuCV和100pg DHV I；泳道4为10pg MDPV、10pg DuCV和10pg DHV I；泳道5为1pg MDPV、1pg DuCV和1pg DHV I；泳道6为100fgMDPV、100fgDuCV和100fgDHV I；泳道7为阴性对照（水）。
图2为三重RT-PCR的特异性试验结果。其中，泳道M为分子量标准100bp DNAladder；泳道1为MDPV DNA；泳道2为DuCV DNA；泳道3为DHV I RNA；泳道4为MDPV DNA和DuCV DNA的混合样品（浓度比1:1）；泳道5为MDPV DNA和DHV I RNA的混合样品（浓度比1:1）；泳道6为DuCV DNA和DHV I RNA的混合样品（浓度比1:1）；泳道7为MDPV DNA、DuCV DNA和DHV I RNA的混合样品（浓度比1:1:1）；泳道8为小鹅瘟病毒DNA；泳道9为新城疫病毒RNA；泳道10为鸭瘟病毒DNA；泳道11为H9亚型禽流感RNA；泳道12为阴性对照水。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
病毒毒株：
鸭I型肝炎病毒AV2111株购自中国兽医药品监察所，产品目录号为AV2111。
番鸭细小病毒（MDPV）记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医,2002,18(6):5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医,2010，37（11):156-158,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
小鹅瘟病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”，上海畜牧兽医通讯,2008，160(06):30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报,2000,(04):23-27,公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸭瘟病毒AV1221株购自中国兽医药品监察所；
H9亚型禽流感记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报,2006,(09):858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
试剂及仪器：
病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒和One Step RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；PUM-T试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；DNA片断胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司。PCR仪为美国Perkin Elmer Cetus公司生产的PE9600仪。
实施例1、引物的设计与合成
根据现有公开的鸭I型肝炎病毒（DHV I），鸭圆环病毒（DuCV）和番鸭细小病毒（MDPV）的基因保守序列，通过Blast验证，设计并合成了3对特异性引物（表1）。
表1鉴定MDPV、DuCV和DHV I的引物序列
Figure BDA00001803763700041
实施例2、三重RT-PCR鉴定鸭I型肝炎病毒，鸭圆环病毒和番鸭细小病毒
一、三重RT-PCR体系的建立
1、待测样品的制备
根据病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒说明书，提取鸭I型肝炎病毒AV2111株的RNA、番鸭细小病毒的DNA和鸭圆环病毒的DNA。参照Sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于-20℃备用。
2、三重RT-PCR反应条件的优化
使用One Step RT-PCR试剂盒采用一步法进行RT-PCR。对RT-PCR各循环参数和各引物浓度等进行优化，以确定最佳的RT-PCR模式。
通过对RT-PCR的引物浓度、各反应温度、时间及循环次数等进行优化，最后确定RT-PCR中MDPV474-1和MDPV474-2引物的最佳工作终浓度均为0.25μM，DuCV351-1和DuCV351-2引物的最佳工作终浓度均为0.25μM，DHV202-1和DHV202-2引物的最佳工作终浓度均为0.15μM。
反应体系（50μl）：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2μl，2×1Step Buffer 25μl，终浓度均为0.25μM的MDPV474-1和MDPV474-2引物，终浓度均为0.25μM的DuCV351-1和DuCV351-2引物，以及终浓度均为0.15μM的DHV202-1和DHV202-2引物，MDPV DNA、DHV I RNA和DuCV DNA共3μL（体积比是1：1：1）作为混合模板，以无RNase的dH2O补足50μl。
RT-PCR的最佳反应模式为50℃反转录30分钟，94℃变性2分钟，然后进入94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟的循环，共进行35个循环，最后再经72℃延伸10分钟后，于4℃结束反应。
二、三重RT-PCR的敏感性试验
将步骤一1中制备得到的作为鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒模板的RNA/DNA，加适量到同一试管中并用水调整使其终浓度一致，然后进行10倍比梯度稀释，按照步骤一2中得到的优化后的PCR反应条件进行扩增，检测其敏感性。同时设置以水代替等量模板的阴性对照。
反应结束后，取50μl RT-PCR产物与5μl溴酚兰混合，在10g/L琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察拍照，与DNA标准分子量作比较，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用DNA片断胶回收试剂盒纯化回收。取适量纯化回收的PCR产物，与PUM-T（来自PUM-T试剂盒）于22℃连接10分钟，转化DH5α大肠埃希氏菌。挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落37℃培养，用PCR方法进行快速鉴定，阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对分析。
琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，该三重RT-PCR最低能检出1pg鸭I型肝炎病毒RNA、1pg鸭圆环病毒DNA和1pg番鸭细小病毒DNA。最低检测线以上各浓度的模板中番鸭细小病毒均扩增得到大小约为500bp的条带，鸭圆环病毒均扩增得到大小约为350bp的条带，鸭I型肝炎病毒均扩增得到大小约为200bp的条带，且测序结果进一步证实了鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒RT-PCR扩增产物，大小分别为202bp、351bp和474bp，与实验设计大小相符，且PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致。以上结果表明利用该三重RT-PCR同时检测鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒具有较高的灵敏度。
三、三重RT-PCR的特异性试验
1、待测样品的制备
根据病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒说明书，提取鸭I型肝炎病毒AV2111株的RNA、番鸭细小病毒的DNA、鸭圆环病毒的DNA、小鹅瘟病毒的DNA、新城疫病毒的RNA、鸭瘟病毒的DNA和H9亚型禽流感的RNA。参照Sambrook方法测定核酸的浓度和纯度，保存于-20℃备用。
2、三重RT-PCR扩增
按照步骤一2中得到的优化后的PCR反应条件进行扩增，不同的是模板分别如下：
MDPV DNA；DuCV DNA；DHV I RNA；MDPV DNA和DuCV DNA的混合样品（浓度比1:1）；MDPV DNA和DHV I RNA的混合样品（浓度比1:1）；DuCV DNA和DHV I RNA的混合样品（浓度比1:1）；MDPV DNA、DuCV DNA和DHV I RNA的混合样品（浓度比1:1:1）；小鹅瘟病毒DNA；新城疫病毒RNA；鸭瘟病毒DNA；H9亚型禽流感RNA；阴性对照水。
反应结束后，取50μl RT-PCR产物与5μl溴酚兰混合，在10g/L琼脂糖凝胶中电泳，经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察拍照，与DNA标准分子量作比较，分析并记录结果。在紫外灯下用刀片切割所需的片段，然后用DNA片断胶回收试剂盒纯化回收。取适量纯化回收的PCR产物，与PUM-T（来自PUM-T试剂盒）于22℃连接10分钟，转化DH5α大肠埃希氏菌。挑取在含氨苄青霉素的选择培养基上长出的白色菌落37℃培养，用PCR方法进行快速鉴定，阳性克隆菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，测序结果进行Blast比对分析。
琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，所有含有鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒核酸模板的样品均能扩增出与试验设计大小相符的扩增条带，即番鸭细小病毒扩增得到大小约为500bp的目的条带，鸭圆环病毒扩增得到大小约为350bp的目的条带，鸭I型肝炎病毒扩增得到大小约为200bp的目的条带；而其它对照病原体在相同位置却无任何扩增条带。测序结果进一步证实了鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒RT-PCR扩增产物，大小分别为202bp、351bp和474bp，与实验设计大小相符，且PCR产物的核酸序列与引物设计模板的基因对应片段的同源性一致。这一结果表明利用该三重RT-PCR检测鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒具有较强的特异性。
因此，本发明所提供的引物对组和方法可应用于鉴定待测样本是否感染鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒：若得到474bp的片段，则待测样本中含有番鸭细小病毒，反之则没有；若得到351bp的片段，则待测样本中含有鸭圆环病毒，反之则没有；若得到202bp的片段，则待测样本中含有鸭I型肝炎病毒，反之则没有。
实施例3、三重RT-PCR检测临床病料
利用实施例2建立的鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT-PCR快速检测方法，对2011年于广西地区鸭群收集的180份病料进行检测，并将PCR产物进行克隆测序分析，评价其临床实用性。
1、待测样品制备
对采集的180份鸭病料（采肝），将其磨成悬液，反复冻融3次后离心收集上清，提取鸭病料DNA和RNA，得到180份待测样品。
2、三重RT-PCR
分别以步骤1制备的180份待测样品作为模板，按照实施例2步骤一2中得到的优化后的PCR反应条件进行扩增。
若得到474bp的片段，则待测样本中含有番鸭细小病毒，反之则没有；
若得到351bp的片段，则待测样本中含有鸭圆环病毒，反之则没有；
若得到202bp的片段，则待测样本中含有鸭I型肝炎病毒，反之则没有。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，180份待测样品中检出鸭I型肝炎病毒2份（目的条带约为200bp，阳性率为1.1%），检出鸭圆环病毒10份（目的条带约为350bp，阳性率为5.6%），检出番鸭细小病毒18份（目的条带约为500bp，阳性率为10%）。其中，鸭圆环病毒和番鸭细小病毒混合感染1份。经RT-PCR产物序列分析后进一步证实了上述结果的准确性，即RT-PCR扩增得到的为鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的特异性片段。
另外，将上述鉴定为鸭I型肝炎病毒阳性的鸭病料用文献1（Fu Yu,Pan Meng,WangXiao-yan,et al.《Molecular detection and typing of duck hepatitis A virus directly fromclinical specimens》.Veterinary Microbiology，2008,131:247257.）中的引物和方法进行鉴定鸭肝炎病毒；将上述鉴定为鸭圆环病毒的鸭病料用文献2（施少华，万春和《鸭圆环病毒感染的检测》，中国家禽2010年第32卷第1期31-33页）中记载的引物和方法鉴定鸭圆环病毒；将上述鉴定为番鸭细小病毒的鸭病料用文献3（娄华,杨德威,贺东升,白挨泉,秦智锋,刘福安.《番鸭细小病毒与鹅细小病毒的PCR鉴别诊断》，中国预防兽医学报,2000,22(6):458-460.）中记载的引物和方法鉴定番鸭细小病毒。其鉴定结果与本发明一致，进一步证实了本发明方法的正确性。
Figure IDA00001803764600011
Figure IDA00001803764600031

Claims (10)

1.鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的引物对组，所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种，其特征在于：所述引物对组由三个引物对组成，第一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述番鸭细小病毒的引物对1，第二个引物对是由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述鸭圆环病毒的引物对2，第三个引物对是由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述鸭I型肝炎病毒的引物对3。
2.鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的引物对组，由两个引物对组成，其中一个引物对是由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述番鸭细小病毒的引物对1，另一个引物对是下述两个引物对中的任一个：由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述鸭圆环病毒的引物对2，和由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的鉴定或辅助鉴定所述鸭I型肝炎病毒的引物对3；所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的引物对组，其特征在于：所述引物对组中的所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3在PCR反应体系中的摩尔比为5：5：3；所述引物对1、所述引物对2和所述引物对3中各引物对的两条引物均等摩尔。
4.鉴定或辅助鉴定番鸭细小病毒的引物对，由两条单链DNA组成，所述两条DNA单链分别为序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的单链DNA。
5.鉴定或辅助鉴定鸭相关病毒的试剂盒，包含权利要求1-3中任一所述的引物对组或权利要求4所述的引物对；所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种。
6.权利要求1-3中任一所述的引物对组或权利要求4所述的引物对的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将权利要求1-3中任一所述的引物对组或权利要求4所述的引物对中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
7.权利要求5所述PCR试剂盒的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1-3中任一所述的引物对组或权利要求4所述的引物对中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
8.权利要求1-3中任一所述的引物对组，或权利要求4所述的引物对，或权利要求5所述的试剂盒的在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有鸭相关病毒产品中的应用；所述鸭相关病毒为番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鸭I型肝炎病毒中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有鸭相关病毒为利用权利要求1-3中任一所述的引物对组，或权利要求4所述的引物对，或权利要求5所述的试剂盒对所述待测样品进行PCR扩增；所述PCR扩增的退火温度为50-60℃。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为55℃。
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