CN108823334B - 肉食兽阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒二联直接pcr检测试剂与检测试剂盒及应用 - Google Patents

肉食兽阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒二联直接pcr检测试剂与检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了肉食兽阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒二联直接PCR检测试剂与检测试剂盒及应用，属于生物检验检疫领域。本发明提供的病毒检测的检测试剂针对性强、特异性高，能方便快速地检测样本的病毒成分。将上述病毒检测的检测试剂应用于样本病毒成分检测，检测结果更为准确可靠；应用于制备检测样本病毒成分的检测试剂盒，能更快捷准确地检测病毒，检测结果可信度高，具有较高的试剂应用价值和推广价值。

Description

肉食兽阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒二联直接PCR检测 试剂与检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物检验检疫领域，具体而言，涉及肉食兽阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒二联直接PCR检测试剂与检测试剂盒及应用。
背景技术
动物阿留申病毒感染鼬科、臭鼬科、小熊猫科动物，是水貂、雪貂、水獭、臭鼬、貉和小熊猫等的阿留申病的病原，阿留申病毒是感染犬科动物狐属、貉等动物的潜在病原。猫泛白细胞病毒是导致鼬科、犬科、猫科动物等动物的肠炎细小病毒，是肉食动物的重要病原。
两类病毒的传统PCR检测，常规路径需要提取病毒核酸，这增加了检测成本，延迟大样品量检测时间。批量样品提取核酸检样时易交叉污染，微量样品提取过程易丢失目标DNA，降低病毒检出率。
发明内容
本发明的第一目的在于提供病毒检测的检测试剂，利用该检测试剂，能够快速准确的检测到样本中的病毒成分，具有较好的区别度，和特异性。
本发明的第二目的在于提供上述的病毒检测的检测试剂在病毒检测中的应用。
本发明的第三目的在于提供上述的病毒检测的检测试剂在制备病毒检测的检测试剂盒中的应用。
本发明的第四目的在于提供病毒检测的检测试剂盒，能通过配套的检测试剂，方便对样本进行快速的检测，提高检测效率。
本发明的第五目的在于提供上述的检测动物源成分的检测试剂盒在病毒检测中的应用。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
病毒检测的检测试剂，检测试剂包括动物源成分的检测引物组合；检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示，第2引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.3-4所示。
上述的病毒检测的检测试剂在病毒检测中的应用。
上述的病毒检测的检测试剂在制备病毒检测的检测试剂盒中的应用。
病毒检测的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的病毒检测的检测试剂。
上述的病毒检测的检测试剂盒在病毒检测中的应用。
本发明的有益效果为：本发明提供的病毒检测的检测试剂针对性强、特异性高，能方便快速的检测样本的病毒成分，将上述病毒检测的检测试剂应用于样本病毒成分检测，检测结果更为准确可靠；应用于制备检测样本病毒成分的检测试剂盒，更利于快捷准确的病毒检测，具有较高的试剂应用价值和推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。应当理解，以下附图仅展示出本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的两组引物分别PCR产物电泳示意图；
图2为本发明实验例1提供的两组引物联合PCR产物电泳示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员应当理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的肉食兽阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒二联直接PCR检测试剂与检测试剂盒及应用进行具体说明。
病毒检测的检测试剂，检测试剂包括动物源成分的检测引物组合；检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示，第2引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.3-4所示。
针对性的设计了两组特异性较强的引物对，通过该检测引物对能特异性的检测样本中的病毒成分。
检测阿留申病毒第1引物对：
上游引物SEQ ID NO.1为AVF:5-ccaacaagtMatgacaccttggt-3’；
下游引物SEQ ID NO.2为AVR:5’-gttggtttggttgctctccaagga-3’；
产物长度316bp。
其中上游引物中，使用兼并碱基M，表示该位点是腺嘌呤A或胞嘧啶C均可。
检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对：
上游引物SEQ ID NO.3为ParF:5’-tgcacaaattgtaacaccttggtc-3’；
下游引物SEQ ID NO.4为ParR:5’-cacctgttcttagtaagtgtactgg-3’；
产物长度480bp。
上述的病毒检测的检测试剂在病毒检测中的应用。
上述的病毒检测的检测试剂在制备病毒检测的检测试剂盒中的应用。
病毒检测的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的病毒检测的检测试剂。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，至少还包括核酸释放剂、PCR预混缓冲液、DNA聚合酶和pMD18-T+ADV-VP2质粒阳性模板中的一种。
在试剂盒中，包括集成检测引物及相关配套的化学试剂，方便对病毒成分进行检测；同时，通过试剂盒提供相应的检测试剂，能提高检测的稳定性、可靠性和精确度。
核酸释放剂的使用，可以节省DNA提取时间和成本，然后直接获取样本基因组DNA，加速样本检测。
DNA聚合酶可以是各种类型的DNA聚合酶；包括Hot Star TaqTM聚合酶。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，核酸释放剂包括0.4-0.6mM的KOH和0.1％的Triton X-100。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，PCR预混缓冲液为2×PCR预混缓冲液，2×PCR预混缓冲液包括20～30mM的Tris-HCl，8～10mMKCl，4～8mMMgCl2和0.4mM dNTPs；以及2mL/L Triton X-100。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，Tris-HCl的pH值为7.0-7.3。
上述的病毒检测的检测试剂盒在病毒检测中的应用。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，包括以下步骤：
提取待检样本的基因组DNA，以基因组DNA为模板，设立PCR体系阳性模板对照和超纯水阴性对照，用检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对进行二联PCR反应，得到PCR反应产物，将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供病毒检测的检测试剂，检测试剂包括动物源成分的检测引物组合；检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示，第2引物对的碱基序列分别如SEQ IDNo.3-4所示。
检测阿留申病毒第1引物对：
上游引物SEQ ID NO.1为AVF:5-ccaacaagtMatgacaccttggt-3’；
下游引物SEQ ID NO.2为AVR:5’-gttggtttggttgctctccaagga-3’；
产物长度316bp。
检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对：
上游引物SEQ ID NO.3为ParF:5’-tgcacaaattgtaacaccttggtc-3’；
下游引物SEQ ID NO.4为ParR:5’-cacctgttcttagtaagtgtactgg-3’；
产物长度480bp。
上述病毒检测的检测试剂，针对阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒设计，专一性强，具有较高的特异性，能较好的对样本中病毒成分进行检测，因此可以将该检测试剂应用到样本病毒成分检测中。
同时，还可以将病毒检测的检测试剂应用于制备病毒检测的检测试剂盒中。
实施例2
本实施例提供病毒检测的检测试剂盒，该检测试剂盒包括动物源成分的检测引物组合；检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示，第2引物对的碱基序列分别如SEQID No.3-4所示。
实施例3
本实施例提供病毒检测的检测试剂盒，该检测试剂盒包括动物源成分的检测引物组合；检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示，第2引物对的碱基序列分别如SEQID No.3-4所示。
当然上述检测试剂盒还可以包括核酸释放剂、PCR预混缓冲液、DNA聚合酶和pMD18-T+ADV-VP2质粒阳性模板中的至少一种。PCR预混缓冲液为2×的溶液，方便实验操作使用。
核酸释放剂包括0.4M的KOH和0.1％的Triton X-100。
2×PCR预混缓冲液包括20mM的Tris-HCl，Tris-HCl的pH值为7.0；8mM KCl，4mM的MgCl2和0.4mM dNTPs；以及2mL/L Triton X-100。
因此病毒检测的检测试剂盒可应用于样本中病毒成分的检测中。
实施例4
本实施例提供病毒检测的检测试剂盒，该检测试剂盒包括动物源成分的检测引物组合；检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示，第2引物对的碱基序列分别如SEQID No.3-4所示。
当然上述检测试剂盒还可以包括核酸释放剂、PCR预混缓冲液、DNA聚合酶和pMD18-T+ADV-VP2质粒阳性模板中的至少一种。PCR预混缓冲液为2×的溶液，方便实验操作使用。
核酸释放剂包括0.6M的KOH和0.1％的Triton X-100。
2×PCR预混缓冲液包括30mM的Tris-HCl，Tris-HCl的pH值为7.0；10mM KCl，8mM的MgCl2和0.4mM dNTPs；以及2mL/L Triton X-100。
因此病毒检测的检测试剂盒可应用于样本中病毒成分的检测中。
实施例5
本实施例提供病毒检测的检测试剂盒，该检测试剂盒包括动物源成分的检测引物组合；检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示，第2引物对的碱基序列分别如SEQID No.3-4所示。
当然上述检测试剂盒还可以包括核酸释放剂、PCR预混缓冲液、DNA聚合酶和pMD18-T+ADV-VP2质粒阳性模板中的至少一种。PCR预混缓冲液为2×的溶液，方便实验操作使用。
核酸释放剂包括0.4M的KOH和0.1％的Triton X-100。
2×PCR预混缓冲液包括22mM的Tris-HCl，该Tris-HCl的pH值为7.0；6mM KCl，4mM的MgCl2和0.4mM dNTPs；以及2mL/L Triton X-100。
因此病毒检测的检测试剂盒可应用于样本中病毒成分的检测中。
实施例6
本实施例提供病毒检测的检测试剂盒，该检测试剂盒包括动物源成分的检测引物组合；检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-2所示，第2引物对的碱基序列分别如SEQID No.3-4所示。
当然上述检测试剂盒还可以包括核酸释放剂、PCR预混缓冲液、DNA聚合酶和pMD18-T+ADV-VP2质粒阳性模板中的至少一种。PCR预混缓冲液为2×的溶液，方便实验操作使用。
核酸释放剂包括0.4M的KOH和0.1％的Triton X-100。
2×PCR预混缓冲液包括25mM的Tris-HCl，Tris-HCl的pH值为7.0；7mM KCl，6mM的MgCl2和0.4mM dNTPs；以及2mL/L Triton X-100。
因此病毒检测的检测试剂盒可应用于样本中病毒成分的检测中。
实验例1
本实验例对实施例5提供的病毒检测的检测试剂盒进行检测试验。
本实施例中DNA聚合酶选用Hot Star TaqTM聚合酶。
样本：动物血液、血清、分泌物、组织样、粪样或尿液中的任意一种均可。
本实施例中选用血清样本进行试验。
样本处理：取1-1.5μL血清样品直接加入3μL核酸释放剂作用5-10分钟。
其它样品与纯水的体积添加比例为：脏器组织(1:10)、粪样(1:5)和尿液(1:2)匀浆冻融，10000g离心2min取上清液或血清用于检测。取1-2μL上清液加入3μL核酸释放剂混匀，作用5-10分钟，取5μL作模板。103copies/μL的pMD18-T+ADV-VP2质粒作为PCR阳性扩增模板，灭菌去离子水作为PCR阴性模板。
30μL的PCR反应体系：在0.2mL反应管依次添加5μL模板、2×PCR缓冲液15μL、两对引物各自0.3～0.6μM、Hot Star TaqTM聚合酶2～3U至30μL混匀。反应灵敏度为30μL反应体系阳性检出下限为200gcp(基因组拷贝数)。
PCR反应条件：95℃预变性3min，95℃变性40sec、55℃退火30sec、72℃延伸40sec，进行32～35个循环，最后72℃延伸5min。
经过PCR反应后，得到PCR反应产物，取5-10μL的PCR反应产物，通过1.5％～2％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭EB染色，使用100bp梯度的DNA Marker标记分子量；在阴、阳性模板PCR反应产物电泳阴性无特异条带、阳性有316bp条带情况下，若电泳图中316bp和480bp条带均出现，表示样本中含有阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒；出现其中一条条带，表示该样本中含有其中一种病毒样本；病毒具体种类，可以根据电泳条带的大小进行判断。
结果如图1所示，图1左图表示107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL和102copies/μL共6个不同浓度梯度的样本进行猫泛白细胞细小病毒PCR反应检测，可以看出，即使在102copies/μL依然能检测到猫泛白细胞细小病毒，说明具有较好的检测灵敏度。同理，图1右图表示106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL和102copies/μL共5个不同浓度梯度的样本进行阿留申病毒PCR反应检测，可以看出，即使在102copies/μL依然能检测到阿留申病毒，说明具有较好的检测灵敏度。
如图2所示，用两组引物同时进行PCR反应，106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL和101copies/μL共6组浓度梯度样本进行扩增；可以看出，在102copies/μL浓度条件下，联合检测依然有效。
综上所述，本发明实施例提供的病毒检测的检测试剂，以及利用该检测试剂制备的检测试剂盒，具有较好的特异性和较高的灵敏度，使用该检测试剂应用于样本病毒检测，具有较好的检测特异性，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院特产研究所
<120> 肉食兽阿留申病毒和猫泛白细胞细小病毒二联直接PCR 检测试剂 与检测试剂盒及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccaacaagtma tgacaccttg gt 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gttggtttgg ttgctctcca agga 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tgcacaaatt gtaacacctt ggtc 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cacctgttct tagtaagtgt actgg 25

Claims (10)

1.病毒检测的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括动物源成分的检测引物组合；所述检测引物组合包括检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对；所述第1引物对的碱基序列如SEQ ID No.1-2所示，所述第2引物对的碱基序列如SEQID No.3-4所示。
2.如权利要求1所述的病毒检测的检测试剂在制备病毒检测的检测药物中的应用。
3.如权利要求1所述的病毒检测的检测试剂在制备病毒检测的检测试剂盒中的应用。
4.病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的病毒检测的检测试剂。
5.根据权利要求4所述的病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，至少还包括核酸释放剂、PCR预混缓冲液、DNA聚合酶和pMD18-T+ADV-VP2质粒阳性模板中的一种。
6.根据权利要求5所述的病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂包括0.4～0.6M的KOH和0.1%的Triton X-100。
7.根据权利要求5所述的病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR预混缓冲液为2×PCR预混缓冲液，所述2×PCR预混缓冲液包括20~30mM的Tris-HCl，8~10mM KCl，4~8mMMgCl2和0.4mM dNTPs，2mL/L Triton X-100。
8.根据权利要求7所述的病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl的pH值为7.0-7.3。
9.如权利要求4-8任一项所述的病毒检测的检测试剂盒在制备病毒检测的检测药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
提取待检样本的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，设立PCR体系阳性模板对照和超纯水阴性对照，用检测阿留申病毒的第1引物对和检测猫泛白细胞细小病毒的第2引物对进行二联PCR反应，得到PCR反应产物，将所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
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