JP5133991B2 - エビ病原体の診断用配列 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条に基づき、２００６年８月２４日出願の米国仮特許出願第６０／８３９８６４号明細書からの優先権を主張する。

本発明は、診断検査の分野に関する。より具体的には、エビのタウラ症候群ウイルス病原体の検出に用いるための新規プライマーが開発されている。

商業的なエビ養殖場は、数多くの一般的な病原体の影響により多大な損失を被っている。タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）は養殖クルマエビの最も深刻なウイルス性病原体の１つである。このウイルスは多くの国に広く分布しており、広範な宿主域を有する。ＴＳＶに最も感染し易いエビ種は、パシフィックホワイトシュリンプ（リトペナエウス・バナメイ（Ｌｉｐｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ））及びホワイトシュリンプ（リトペナエウス・スクミッティ（Ｌｉｐｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｃｈｍｉｔｔｉ））である。その他の感染し易い種としては、ブラウンシュリンプ（ファルファンテペナエウス・アズテクス（Ｆａｒｆａｎｔｅｐａｎａｅｕｓ ａｚｔｅｃｕｓ））、ピンクシュリンプ（ファルファンテペナエウス・デュオラルム（Ｆａｒｆａｎｔｅｐａｎａｅｕｓ ｄｕｏｒａｒｕｍ））、及びホワイトシュリンプ（リトペナエウス・セティフェルス（Ｌｉｐｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｓｅｔｉｆｅｒｕｓ））が挙げられる。ＴＳＶは一本鎖ＲＮＡウイルスであり、その完全ゲノムは配列決定されている（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２７７６７５）。

ＴＳＶは養育池又は養育槽の中に入れられた２〜４週齢以内の稚エビに感染し、高い死亡率を引き起こし得る。孵化場の種親及び後期幼生においてＴＳＶを検出することで、商業生産システムに侵入する前に感染したエビを除去することが可能となる。その結果、エビにおけるＴＳＶを検出するための様々な方法が開発されており、核酸ベースの方法及び免疫学的方法が挙げられる（非特許文献１及び２）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法は単純で高速、且つ感度が高いことから特に興味深い。ＴＳＶを検出するための、ゲノムの種々の診断領域の増幅に基づく逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法については、説明がなされている（例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；及び非特許文献７を参照）。

Ｙｏｕら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４：６３−７３頁（２００４年） Ｌｉｇｈｔｎｅｒら、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ １６４（１）：２０１−２２０頁（１９９８年） Ｔａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１５（１）：１０９−１１４頁（２００４年） Ｍｏｕｉｌｌｅｓｓｅａｕｘら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１（２）：１２１−１２７頁（２００３年） Ｎｕｎａｎら、Ｄｉｓ．Ａｑｕａｔ．Ｏｒｇ．３４（２）：８７−９１頁（１９９８年） Ｄｈａｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０４（１）：６９−８２頁（２００２年） Ｎｕｎａｎら、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ２２９（１−４）：１−１０頁（２００４年）

上記の方法はいずれもＴＳＶの検出に有用であるが、概して、特異性、感度の不足が弱点となっているか、又は複雑で時間がかかる。加えて、ウイルスは遺伝子の突然変異率が高いため、ゲノムの種々の領域を対象とした検査が有用であり得る。従って、ＴＳＶについての高速で正確、且つ現場での使用が容易な高感度アッセイが必要とされている。本明細書では、指摘された問題が、ＴＳＶゲノムの新規部分に基づくプライマーの発見により対処される。本明細書で同定されるプライマーをプライマー特異的増幅法又は核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法で使用することにより、先行の方法論に付随する問題なしにＴＳＶを検出できる。

一実施形態において、本発明は配列番号１〜６のいずれか１つに記載の単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列、又は配列番号１〜６と完全に相補的な単離核酸分子を提供する。

別の実施形態において、本発明は本明細書に開示されるとおりの２つの異なるＴＳＶ診断用プライマー配列の対を提供し、この対は、ＴＳＶゲノム内の核酸領域を増幅する核酸増幅反応をプライムする能力を有する。

別の実施形態において、本発明はＴＳＶの検出用キットを提供し、これは本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つの対を含む。

別の実施形態において、本発明は試料中のＴＳＶの存在を検出するための方法を提供し、これは、
（ｉ）ＴＳＶを含むことが疑われる試料からＲＮＡを提供するステップと、
（ｉｉ）好適なハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜６のいずれかの単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列に由来するプローブを用いてＲＮＡを探索するステップと、を含み、ここでハイブリダイズ可能な核酸断片が同定されると、それがＴＳＶの存在の確証となる。

他の実施形態において、この検出方法はＴＳＶに感染していないＤＮＡ試料を同定する。

別の実施形態において、本発明は試料中のＴＳＶの存在を検出するための方法を提供し、これは、
（ｉ）ＴＳＶを含むことが疑われる試料からＲＮＡを提供するステップと、
（ｉｉ）逆転写酵素及び本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つを使用して前記ＲＮＡと相補的なＤＮＡを合成するステップと、
（ｉｉｉ）増幅産物が生成されるよう、本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つの対により前記相補ＤＮＡを増幅するステップと、
を含み、増幅産物が存在すると、それがＴＳＶの存在の確証となる。

別の実施形態において、本発明は試料中のＴＳＶの量を定量するための方法を提供し、これは、
（ｉ）ＴＳＶを含むことが疑われる試料からＲＮＡを提供するステップと、
（ｉｉ）逆転写酵素及び本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つを使用して前記ＲＮＡと相補的なＤＮＡを合成するステップと、
（ｉｉｉ）核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブの存在下での少なくとも変性温度と伸長温度との間の熱サイクリングによって、本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つの対により前記相補ＤＮＡを増幅するステップと、
（ｉｖ）熱サイクリング中に核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブにより生成される蛍光量を測定するステップと、
（ｖ）核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブにより生成された蛍光量が基礎値を上回る固定閾値に達するときの閾値サイクル数を決定するステップと、
（ｖｉ）試料中のＴＳＶについて決定された閾値サイクル数を、既知の濃度の標準溶液を用いて決定された鋳型濃度の対数に対する閾値サイクル数の標準曲線と比較することにより試料中のＴＳＶの量を計算するステップと、
を含む。

図面の簡単な説明及び配列説明
本発明の様々な実施形態が、本願の一部をなす以下の詳細な説明及び添付の配列説明からさらに十分に理解され得る。

Ａは、実施例８に記載されるとおり、ＴＳＶウイルスＲＮＡとアクチンＤＮＡとの同時ＰＣＲ増幅により形成されたＴＳＶ２産物及びアクチン試料内部対照産物についての融解曲線を示す。ＴＳＶ２産物及びアクチン産物の融解温度（Ｔｍ）の値は、それらの対応する融解曲線上に示される。 Ｂは、実施例８に記載されるとおり、ＴＳＶウイルスＲＮＡとアクチンＤＮＡとの同時ＰＣＲ増幅により形成されたＴＳＶ２産物及びアクチン試料内部対照産物を含む試料のアガロースゲル電気泳動による分離結果を示す。ＴＳＶ及びエビＤＮＡの量は各レーンの上側に示される。「Ｍ」は１００ｂｐのＤＮＡラダーである。

以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願に関する要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）及びＥＰＯ及びＰＣＴの配列列記要件（規則５．２及び４９．５（ａの２）、並びに実施細則の第２０８条及び付録Ｃ）と整合性を有している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データに使用される記号及び形式は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定められる規則に従う。

配列番号１〜６は、ＴＳＶの検出に有用なＴＳＶ診断用プライマーのヌクレオチド配列である。

配列番号７〜９は、実施例の一般的方法の節に記載されるＴＳＶ合成鋳型のヌクレオチド配列である。これらの配列は、本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマーの対を使用して得られる増幅産物のヌクレオチド配列でもある。

配列番号１０〜１３は、実施例８に記載される試料内部対照プライマーのヌクレオチド配列である。

配列番号１４〜１５は、実施例９及び１０に記載される蛍光標識プローブのヌクレオチド配列である。

本明細書では、タウラ症候群ウイルスを検出するためのアッセイにおいて有用なプライマーが開示される。このプライマーを核酸増幅法並びにハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することにより、毒性タウラ症候群ウイルスを効率的に検出し、定量し得る。

本開示では、数多くの用語及び略語が使用される。以下に定義が提供され、これらは特許請求の範囲及び本明細書を解釈するために参照されるものとする。

「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。

「タウラシンドロームウイルス」はＴＳＶと略記される。

用語「単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列」は、ＴＳＶゲノムのなかでＴＳＶの存在について診断される部分に相当する配列を指す。

本明細書で使用されるとき、「単離核酸断片」は、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡの重合体であり、場合により合成の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡの重合体の形態の単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１つ又は複数のセグメントからなり得る。

用語「増幅産物」又は「アンプリコン」は、プライマー特異的増幅反応において産生される核酸断片を指す。典型的なプライマー特異的増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又は他の等温増幅プロセスが挙げられる。ＰＣＲ法が選択される場合、複製の組成は典型的には、例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸、然るべき配列の２つのプライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びタンパク質を含み得る。これらの試薬及び核酸の増幅におけるその使用についての手順を説明する詳細は、米国特許第４，６８３，２０２号明細書（１９８７年、Ｍｕｌｌｉｓら）及び米国特許第４，６８３，１９５号明細書（１９８６年、Ｍｕｌｌｉｓら）に提供される。ＬＣＲ法が選択される場合、核酸複製の組成は、例えば、耐熱性リガーゼ（例えば、Ｔ．アクアチカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ）、２組の隣接オリゴヌクレオチド（ここで各組のうち一方のメンバーは標的鎖の各々と相補的である）、トリス−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオスレイトール及びサケ精子ＤＮＡを含んでなり得る（例えば、Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１０７４−１０７８頁（１９８５年）を参照）。

用語「逆転写後ポリメラーゼ連鎖反応」、又は「ＲＴ−ＰＣＲ」は、遺伝子発現、クローニング、ｃＤＮＡライブラリ構築、プローブ合成、及びインサイチュハイブリダイゼーションにおけるシグナル増幅を定量分析するための高感度技術を指す。この技術は２つの部分、すなわち、逆転写（ＲＴ）によるＲＮＡからのｃＤＮＡの合成、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による特異的ｃＤＮＡの増幅からなる。逆転写酵素は、鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを用いてヌクレオチドの重合を触媒するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。有意な量のゲノムＤＮＡ混入のないＲＮＡをもたらす完全なＲＮＡ単離技術を利用することが重要であり、これは続くＰＣＲでは逆転写により合成されたｃＤＮＡ標的とゲノムＤＮＡの混入とを区別できないためである。

用語「プライマー」は、相補鎖（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔａｎｄ）の合成がポリメラーゼにより触媒される条件下に置かれると、相補鎖に沿った核酸合成又は複製の開始点として作用する能力を有するオリゴヌクレオチド（合成又は天然）を指す。

用語「熱サイクリング」は、ＰＣＲ及びＬＣＲなどの特定の核酸増幅法において用いられる温度の全体的な変化パターンを指す。この過程は一般的であり、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）；並びにＭｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，２０２号明細書及びＭｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号明細書を参照のこと。一般にＰＣＲ熱サイクリングは、高温での初期変性ステップと、それに続く、鋳型変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼによるアニールされたプライマーの伸長を可能にするよう設計された温度サイクルを含む。

用語「閾値サイクル数」は、本明細書では「ＣＴ」とも称され、産物形成による蛍光量が基礎値を上回る固定閾値に達するときの熱サイクリングにおけるサイクル数を指す。

用語「プローブ」は、標的配列と相補性の高いオリゴヌクレオチド（合成又は天然）を指し、本明細書では「断片」とも称され（すなわち、検出対象の配列又は検出対象の配列の一部分）、標的配列の少なくとも１本の鎖とハイブリダイズすることにより二重鎖構造を形成する。プローブは、例えば蛍光標識又はリガンド標識を使用して標識されることにより、検出が容易になり得る。

用語「複製阻害部分」は、オリゴヌクレオチドの３’末端ヒドロキシル基に結合する任意の原子、分子又は化学基を指し、核酸鎖を複製するための鎖伸長の開始を阻止するものである。例としては、限定はされないが、３’デオキシヌクレオチド（例えば、コルジセピン）、ジデオキシヌクレオチド、リン酸塩、リガンド（例えば、ビオチン及びジニトロフェノール）、レポーター分子（例えば、フルオレセイン及びローダミン）、炭素鎖（例えば、プロパノール）、ミスマッチヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド、又はペプチド核酸単位が挙げられる。

用語「非関与型」は、核酸分子を増幅するための反応におけるプローブ又はプライマーの関与の欠如を指す。具体的には、非関与型プローブ又はプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの基質として働いたり、又はＤＮＡポリメラーゼによって伸長されたりすることのないものである。「非関与型プローブ」は本質的にポリメラーゼによる鎖伸長が不可能である。これは複製阻害部分を有することも、又は有しないこともある。

温度及び溶液のイオン強度が好適な条件下で一本鎖形態の核酸分子が他の核酸分子にアニールできるとき、その核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）、特にこの文献中の第１１章及び第１１．１表に例示される（全体として参照により本明細書に援用される）。温度及びイオン強度の条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同的な核酸の予備スクリーニングについては、５５℃の融解温度（Ｔｍ）に相当する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を用いることができ、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％乳、及びホルムアミド無し；又は３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳである。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件はより高いＴｍに相当し、例えば、４０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＳＣである。ハイブリダイゼーションでは２つの核酸が相補配列を含むことが要求されるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間のミスマッチは可能である。核酸のハイブリダイゼーションに適したストリンジェンシーは、核酸の長さ及び相補性の程度といった当該技術分野において周知の変数に依存する。２本のヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッド用のＴｍ値は上がる。核酸のハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順に低下する。１００ヌクレオチド長より大きいハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、９．５０〜９．５１を参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、１１．７〜１１．８を参照）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり、及び最も好ましくは長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブの長さなどの因子に従い必要に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。

「遺伝子」は、特異的タンパク質を発現する核酸断片を指し、調節配列をコード配列の前（５’非コード配列）、及び後ろ（３’非コード配列）に含む。「天然遺伝子」は、独自の調節配列を有する天然に存在するとおりの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を指し、天然には同時に存在しない調節配列及びコード配列を含んでなる。従ってキメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが天然に存在するものとは異なる様式で配列されている調節配列及びコード配列を含んでなり得る。「内在性遺伝子」は、生物体のゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物中には通常存在しないが、遺伝子導入により宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、天然でない生物体に挿入される天然遺伝子か、又はキメラ遺伝子を含んでなり得る。「導入遺伝子」は、形質転換手法によりゲノムに導入された遺伝子である。

用語「機能的に連結された」は、一方の機能が他方により影響を受けるような単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現を生じさせる能力を有する（すなわち、そのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、当該コード配列と機能的に連結される。コード配列はセンス方向又はアンチセンス方向で調節配列に機能的に連結できる。

用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定的な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。

用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、多くの場合に細胞の中央代謝の一部ではなく、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態の遺伝子を保有する染色体外要素を指す。かかる要素は、直鎖状又は環状の、任意の供給源に由来する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってもよく、ここでは多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のプロモーター断片及びＤＮＡ配列を然るべき３’非翻訳配列と共に細胞中に導入する能力を有する独自の構造と連結されるか、又はそれに組み換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含み、さらに外来遺伝子に加え、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含み、さらに外来遺伝子に加え、外来宿主中での当該遺伝子の発現を可能にする要素を有する特異的ベクターを指す。

用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものであってもよく、又は独自に開発したものであってもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はされないが、ＧＣＧ ｓｕｉｔｅプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）、ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、及びＶｅｃｔｏｒ ＮＴｉ（登録商標）バージョン７．０を挙げることができる。本願に関連するなかで、配列分析ソフトウェアを用いて分析される場合、特記されない限り、分析の結果は参照されるプログラムの「初期値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用されるとき、「初期値」は、初めて初期化したときに最初にソフトウェアに取り込まれる任意の値又はパラメータのセットを意味するものとする。

本明細書で用いられる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローン技術は、当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）（これ以降、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発刊（１９８７年）により記載される。

タウラ症候群ウイルスゲノム
タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）は高死亡率及び広範な宿主域を伴う主要なエビ病原体である。ＴＳＶの完全ゲノムは配列決定されている（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２７７６７５）。ゲノムは１０，２０５塩基及び２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む一本鎖ＲＮＡからなる。

ＴＳＶ診断用プライマー配列
本明細書には、ＴＳＶの高感度検出のための様々なアッセイフォーマットにおいて有用な診断用プライマー配列が開示される。これらのプライマーは、ＴＳＶゲノムのなかでこれまでＴＳＶ検出に使用されていない領域を対象とする。

一連の「インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃａ）」（すなわちコンピュータベースの）配列分析ツールを使用して、プライマー配列を実験的に同定した。このプロセスでは、既知のあらゆるＴＳＶ配列を含むデータベースを構築した。まず初めにこれらの配列を整列させ、次にプライマー部位について、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）ソフトウェア（ＩｎｆｏｒＭａｘ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して、他のＴＳＶ配列との相同性、特定のアンプリコンの長さ、塩濃度、Ｔｍ（融解温度）、Ｃ＋Ｇ含量並びにヘアピン及び二次構造パラメータの不在に基づき分析した。次に有望なプライマーをＧｅｎＢａｎｋ配列に対しスクリーニングした。他の非標的遺伝子配列との相同性が５塩基未満しか含まれないことが確立されたプライマーを、ＰＣＲ増幅効率及び最小限のプライマーダイマー形成から実験的調査のために選択した。高い増幅効率及び最小限のプライマーダイマー形成の双方を示したプライマーを、様々なエビ病原体に感染したエビから単離されたＤＮＡ及び疾患にかかっていないことが証明されているエビ由来のＤＮＡのパネルによる検査のために選択した。全てのＴＳＶ株を増幅し、且つ非ＴＳＶ病原体に感染したエビ由来のＤＮＡ及び様々な種の疾患にかかっていないことが証明されているエビから単離されたＤＮＡのいずれにも反応を示さなかったプライマーを、有用なプライマーとして選択した。

ＴＳＶの検出に有用であることが分かったプライマー配列、及びそれらのＴＳＶゲノムにおける位置が、表１に示される。これらのプライマーは標準的なホスホラミダイト化学反応を用いて合成してもよく、又はＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）などの企業から購入してもよい。

アッセイ法
本明細書に開示されるプライマー配列は、様々なアッセイフォーマットで用いてＴＳＶを検出及び定量し得る。最も簡便な２つのフォーマットは、核酸ハイブリダイゼーションの方法か、又はＰＣＲなどのプライマー特異的増幅法を利用するものである。

プライマー特異的増幅アッセイ法
一実施形態において、本ＴＳＶ診断用プライマー配列はプライマー特異的核酸増幅において使用することによりＴＳＶの存在を検出し得る。ＴＳＶはＲＮＡウイルスであるため、逆転写を用いることでＲＮＡ配列が二本鎖ＤＮＡコピーに転換され、次に二本鎖ＤＮＡコピーが以下に記載される核酸増幅法の１つを用いて増幅され得る。逆転写及び核酸増幅は２つの別個のステップで実施されてもよく、又は双方のステップに必要な全ての試薬が存在する１つのステップにまとめて組み合わされてもよい。

逆転写は典型的には、標的ＲＮＡとハイブリダイズすることにより、コピーＤＮＡ、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ）の混合物、ＭｇＣｌ_２、逆転写酵素及び逆転写酵素緩衝液の合成をプライムするプライマーを含んでなる組成で行われる。加えて、組成は場合により、イソチオシアン酸グアニジニウム、ジエチルピロカーボネート、ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、ＲＮａｓｅ Ｂｌｏｃｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、ブタ肝臓ＲＮａｓｅ阻害剤（タカラミラスバイオ（Ｔａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、抗ＲＮａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、リボヌクレアーゼＩｎｈｉｂ ＩＩＩ（ＰａｎＶｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ）又はＲＮＡ保護細菌試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）などのＲＮａｓｅ阻害剤を含み得る。好適な逆転写酵素は当該技術分野において周知であり、限定はされないが、ＨＩＶ逆転写酵素（Ａｍｂｉｏｎ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。

逆転写及び増幅が２つのステップとして行われるか、又は１つのステップとして行われるかに関わらず、最初は逆転写ステップが実行され、これは典型的には約３７℃〜約７０℃の温度での単一温度のインキュベーションからなる。当業者に周知のとおり、異なる逆転写酵素及び異なるプライマーには異なる温度が適する。

様々なプライマー特異的核酸増幅法が当該技術分野において周知であり、本明細書に開示されるプライマーと共に使用するのに好適である。これらの核酸増幅法としては、熱サイクリング法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））、並びに等温法及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）が挙げられる。

ＬＣＲ法は当該技術分野において周知である（例えば、Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１０７４−１０７８頁（１９８５年）を参照）。典型的には、ＬＣＲ核酸複製の組成は、例えば、耐熱性リガーゼ（例えば、Ｔ．アクアチカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼ）、２組の隣接オリゴヌクレオチドプライマー（各組のうち一方のメンバーは標的鎖の各々と相補的である）、トリス−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＮＡＤ、ジチオスレイトール及びサケ精子ＤＮＡを含んでなる。

ＳＤＡ法もまた当該技術分野において周知である。ＳＤＡの方法論についての詳しい考察は、Ｗａｌｋｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２頁（１９９２年））により提供される。典型的には、ＳＤＡでは２つのオリゴヌクレオチドプライマーが使用され、各々が標的中の一方の鎖のみに相補的な領域を有する。熱変性後、一本鎖の標的断片は過剰に存在するそれぞれのプライマーと結合する。双方のプライマーとも、標的結合配列の５’に位置する非対称の制限酵素認識配列を含む。各プライマー−標的複合体は、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ並びに３つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び１つのデオキシヌクレオチドα−チオ三リン酸（ｄＮＴＰ［ａＳ］）の存在下で、ニッキング及び重合／置換ステップを繰り返す。

本明細書に開示される診断用プライマー配列を用いてＴＳＶを検出するための好ましい方法はＰＣＲであり、これは参照により具体的に本明細書に援用されるＭｕｌｌｉｓらによる米国特許第４，６８３，２０２号明細書及び米国特許第４，６８３，１９５号明細書に記載されている。ＰＣＲ法では、本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマー配列及びそれらの完全相補（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）配列が、ＴＳＶゲノム内の領域を増幅する核酸増幅反応をプライムすることが可能な対で用いられる。様々な組み合わせのＴＳＶ診断用プライマー配列及びそれらの相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）が使用され得る。好適なプライマー対としては、限定はされないが、配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、並びに配列番号３及び６が挙げられる。概して、２つのプライマーは、上記のとおり逆転写により生成される試料ＤＮＡ；４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ）の混合物；耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと緩衝溶液中に混合される。次にこの混合物はサーマルサイクラー機を用いて熱サイクルにかけられ、所望の標的領域が増幅される。サーマルサイクラーは多くの供給元から市販されている（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）；ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））。

一般に、ＰＣＲ熱サイクリングは高温での初期変性ステップと、それに続く、鋳型変性、プライマーのアニーリング、及びアニーリングされたプライマーのポリメラーゼによる伸長を可能にするよう設計された一連の温度サイクルの繰り返しを含む。一般的には、試料は最初に約２〜１０分間、約９５℃の温度で加熱され、二本鎖ＤＮＡ試料が変性される。次に、各サイクルの始めに、試料及び使用される機器のタイプに応じて試料が約１０〜６０秒間変性される。変性後、プライマーがより低温の約４０℃〜約６０℃で約２０〜６０秒間、標的ＤＮＡにアニールされる。ポリメラーゼによるプライマーの伸長は、多くの場合に約６０℃〜約７２℃の温度範囲で行われる。伸長にかかる時間はアンプリコンのサイズ及び増幅に使用される酵素の種類に依存し得るが、所定の実験により容易に決定される。加えて、アニーリングステップを伸長ステップと組み合わせて２ステップサイクリングとすることができる。熱サイクリングはまた、ＰＣＲアッセイにおいてさらなる温度変更も含み得る。アッセイで用いられるサイクル数は多くの要因に依存し、使用されるプライマー、存在する試料ＤＮＡの量、及び熱サイクリング条件が挙げられる。任意のアッセイで用いられるサイクル数は、所定の実験を用いて当業者により容易に決定され得る。場合により、全ての増幅産物の合成を確実にするため、熱サイクリングの完了後に最終伸長ステップが追加されてもよい。

増幅後、増幅されたヌクレオチド配列は好適なベクターにライゲートされ、続いて前記ベクターにより好適な宿主生物が形質転換され得る。これにより、増幅された配列がより容易に利用可能な供給形態で確保される。或いは、増幅後、増幅された配列又はその一部分は、以下に記載されるとおり、ハイブリダイゼーションアッセイ用のヌクレオチドプローブとして使用するために化学的に合成されてもよい。いずれの場合にも、可変領域のＤＮＡ配列がジデオキシ法などの方法を用いて構築され得る（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７頁（１９７７年））。得られる配列を用いることでその生物体に対するプローブの選択肢が導かれ、最も適切な配列が選択される。

逆転写とプライマー特異的核酸増幅法との組み合わせを用いてＴＳＶを含むことが疑われる試料（例えば、エビ又は他の甲殻類）中のＴＳＶの存在を検出するためには、試料からのＲＮＡが逆転写及び続く増幅に好適な形態で提供されなければならない。典型的には、ＲＮＡは無細胞でなければならず、タンパク質及び他の細胞成分を除去する処理が施され得る。ＲＮＡは任意の好適な組織、液体又は試料材料から得ることができ、限定はされないが、エビ組織（例えば、鰓、腹肢、血リンパ、筋肉、尾、眼柄、胃、脚、及び結合組織）、洗浄液、及び池水試料が挙げられる。試料は、既知の汚染物質に近接していることなどを含む様々な理由からＴＳＶを含むことが疑われ得るか、又は単にエビ産業にＴＳＶの存在がよく見られることから汚染が疑われ得る。従って、ＴＳＶを含むことが疑われる試料は上記の任意のＲＮＡ試料であり得る。

使用に好適なＲＮＡを組織から提供するための方法は、当該技術分野において周知である。こうした方法は、試料材料又は組織を緩衝液でホモジナイズし、遠心して固形細片を除去し、フェノール／クロロホルム−イソアミルアルコール、遠心、クロロホルム抽出、沈殿、乾燥及び再懸濁を用いてＲＮＡを抽出することを含み得る。典型的には、ＲＮＡはＤＮａｓｅで処理され、混入したあらゆるＤＮＡが除去される。加えて、ＲＮＡは、市販のＲＮＡ単離キット、例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）又はＴＲＩ試薬（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｃ．、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いるのに好適な形態で提供され得る。

次に、提供されたＲＮＡと相補的なＤＮＡが、上記のとおり逆転写酵素を使用して、本明細書に開示される単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つを用いることにより合成される。好適なＴＳＶ診断用プライマー配列としては、限定はされないが、配列番号１、３、及び５が挙げられる。

次に、生成された相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡが、上記のとおり別個のステップか、又は同じステップで、上記のとおり核酸増幅法を用いて本明細書に開示される診断用プライマー配列の少なくとも１つの対により増幅される。診断用プライマー配列の異なる対の組み合わせもまた用いられ得る。増幅産物の存在が以下に記載されるとおり検出されると、それが試料中のＴＳＶの存在の確証となる。一実施形態においては、ＰＣＲを用いてＤＮＡが増幅される。

核酸増幅法においては、試薬の不具合、手順の間違い、及び機器の誤動作から検査結果が誤って解釈され得る。加えて、試料材料中の阻害物質の存在、又は試料を処理し、核酸を回収する間の試料ＤＮＡ若しくはＲＮＡの分解によって問題が生じる。これらの問題を克服するため、ＴＳＶアッセイと組み合わせて内部対照試験を実施することで、使用者にこの種のエラーに対する注意を喚起し、検査結果の定量を補助することができる。

２種類の内部対照試験を用いることができる。一手法は、「鋳型内部対照」（ＩＴＣ）の共増幅に基づき、ＩＴＣは反応前に核酸増幅試薬混合物に添加される。第２の手法は試料に含まれる「試料内部対照」（ＩＳＣ）の共増幅に基づく。いずれの場合にも、内部対照ＤＮＡ又はＲＮＡの配列はＴＳＶ ＲＮＡの配列と異なる。

試料内部対照は、試料材料（例えばエビ組織及び血リンパ）中に保存された、又は常に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ遺伝子配列であり得る。ＩＳＣ標的ＤＮＡ又はＲＮＡを増幅するために使用されるプライマーは、ＴＳＶ ＲＮＡを増幅しないよう選択され、ＴＳＶ検査プライマーは試料内部対照ＤＮＡ又はＲＮＡ標的を増幅しないよう選択される。このようにして、ＩＳＣ標的及びＴＳＶ標的が独立して増幅する。アッセイでは、ＩＳＣ標的及びＴＳＶ標的の双方が同じ試薬及び条件を用いてプロセシングされる。さらに、双方の標的鋳型とも、同じ試薬及び反応条件を用いて増幅される。ＩＳＣ鋳型及びプライマーは検査試料中に存在するため、増幅中にＩＳＣ産物が産生されるはずである。ＩＳＣ産物が形成されない場合、それは検査の化学反応が正しく機能しなかったことを示すものであり、そのＴＳＶ検査結果は誤っており、信頼してはならない。正しいＩＳＣ産物形成が生じた場合、それは検査の化学反応が正しく作用したことを示すものであり、そのＴＳＶ試料のプロセシング及び検査反応は正しく機能したと考えられ、従ってそのＴＳＶ検査はより正確に解釈され得る。

ＩＳＣプライマーは、ＴＳＶに感染し易い病原体宿主種の構造タンパク質、代謝酵素又はリボソーム産物をコードする遺伝子の遺伝子配列から選択できる。例えば、ＩＳＣプライマーは、エビアクチン遺伝子、又はエビの１８Ｓ、２３Ｓ若しくは５Ｓリボソーム遺伝子、又は他の構成遺伝子に由来する遺伝子配列であり得る。ＩＳＣプライマー対の好適な例としては、限定はされないが、表２に示されるとおりのウシエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ）アクチン１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ１００９８６）に由来する配列番号１０，１１、及び配列番号１２，１３が挙げられる。

一実施形態において、増幅反応で試料内部対照産物が産生されるよう、ＩＳＣプライマーの少なくとも１つの対が核酸増幅試薬混合物に含まれる。一実施形態において、ＩＳＣプライマーの少なくとも１つの対は、配列番号１０，１１、及び配列番号１２，１３からなる群から選択される。

加えて、鋳型内部対照（ＩＴＣ）をＴＳＶ検査プライマーと共に有利に使用することにより、検査反応の定量を補助できる。ＩＴＣについてのプライマー要件は、ＩＴＣ鋳型とプライマーとの双方が増幅試薬混合物に添加される点を除いてＩＳＣプライマーの要件と同じである。ＩＴＣプライマーは、ＴＳＶに感染し易いエビなどの被験種由来のゲノムＤＮＡ又はＲＮＡを増幅しないように選択される。ＩＴＣ鋳型は既知の濃度で添加されるため、１反応当たりのコピー数が分かる。ＩＴＣ鋳型は増幅試薬混合物中に含まれるため、増幅中にＩＴＣ産物が産生される。ＩＴＣ産物の量は反応の増幅効率及び他の変数に応じて反応毎に異なり得る。これらの同じ変数はＴＳＶ ＤＮＡ増幅にも影響するため、産生されるＴＳＶ産物の量は反応で産生されるＩＴＣ産物の量に比例することになる。従って、アッセイにおけるＴＳＶ鋳型のコピー数は、当初加えられたＩＴＣと、形成されたＩＴＣ産物と、産生されたＴＳＶ産物との間の比例関係から推測できる。相対的な産物形成は、標識された内部プローブが用いられる場合はＣＴ単位で、又は産物それぞれの融解温度における融解曲線の微分係数により決定できる。

ＩＴＣプライマー配列は理論的に設計されてもよく、又は被験試料に存在しない植物及び動物からの他のウイルス又は遺伝子などの非被験種からの遺伝子配列に由来してもよい。このように、試料材料はＩＴＣプライマーによって増幅される可能性のある他のＤＮＡ又はＲＮＡを含まない。

一実施形態において、増幅反応で少なくとも１つのＩＴＣ産物が産生されるよう、少なくとも１つの鋳型内部対照及びＩＴＣプライマーの少なくとも１つの対が核酸増幅試薬混合物に含まれる。

当該技術分野において周知の様々な検出方法が、本明細書に開示される方法に用いられ得る。これらの検出方法としては、限定はされないが、標準未変性ゲル電気泳動法（例えば、アクリルアミド又はアガロース）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、温度勾配ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、及び蛍光検出が挙げられる。

蛍光検出方法は高速で高感度の増幅産物の検出を提供する。蛍光検出はまた、リアルタイムでの検出能力も提供し、ここでは熱サイクリングプロセス中の増幅産物の形成がモニタされる。加えて、初期標的の量が蛍光検出を用いて定量され得る。蛍光検出は、熱サイクリングプロセスの前か、又はその後に、核酸結合性蛍光剤を反応混合物に添加することにより行われ得る。好ましくは、核酸結合性蛍光剤は、核酸の二重らせんにおける積み重なった塩基対の間への非共有結合性の挿入が可能なインターカレート色素である。しかしながら、インターカレートされない核酸結合性蛍光剤もまた好適である。本発明の方法において有用な核酸結合性蛍光剤の非限定的な例は、臭化エチジウム及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから入手可能）である。熱サイクリング前に反応混合物に核酸結合性蛍光剤を添加することで、Ｈｉｇｕｃｈｉ（米国特許第５，９９４，０５６号明細書）により記載されるとおり、増幅産物の形成をリアルタイムでモニタすることが可能となる。リアルタイム蛍光測定が可能なサーマルサイクラーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）などの企業から市販されている。増幅後の増幅産物の確認は、当該技術分野において周知の方法を用いて、例えば、蛍光測定値を使用して融解曲線を生成することにより、産物の融解温度を決定することで評価できる。

増幅産物の蛍光検出は当該技術分野において周知の他の方法、例えば蛍光標識プローブの使用を用いても達成され得る。プローブは増幅産物の少なくとも一部分と相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）配列を含んでなる。かかるプローブの非限定的な例としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎｓ（Ｇｏｅｌら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９９（３）：４３５−４４２頁（２００５年））が挙げられる。例えば、本明細書に開示されるＴＳＶプライマーと共に使用される蛍光標識プローブを構築するための遺伝子配列は、以下の実施例９及び１０に詳細に記載されるとおり、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｖ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ カリフォルニア州）などの市販の分析ソフトウェアを使用したＴＳＶ遺伝子及び被験アンプリコンの分析により選択され得る。プローブ配列は特異的ＴＳＶ被験アンプリコンの近位末端の範囲内に収まるよう選択される。好適なプローブ配列としては、限定はされないが、配列番号１４及び１５に示される配列が挙げられる。プローブは、以下に記載されるハイブリダイゼーションプローブを標識するための方法など、当該技術分野において周知の方法を用いて蛍光標識されてもよい。リアルタイム蛍光検出用には、プローブは二重標識され得る。例えば、プローブの５’末端を６ＦＡＭ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）などのフルオロフォアで標識でき、３’末端を６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などのクエンチャー色素で標識できる。副溝結合性プローブの場合、３’末端をクエンチャー色素と副溝結合剤との複合体で標識できる。蛍光標識プローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓなどの商業的供給元から入手してもよい。

一実施形態において、本発明は、試料中のＴＳＶの量を定量するための方法を提供する。本実施形態において、ＲＮＡは上記のとおり、ＴＳＶを含むことが疑われる試料から提供され、相補的ＤＮＡが逆転写酵素を使用して生成される。ＤＮＡは、核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブの存在下での少なくとも変性温度と伸長温度との間の熱サイクリングによって、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つの対により増幅される。熱サイクリング中、核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブにより生成される蛍光量が測定される。蛍光測定から、核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブにより生成される蛍光量が基礎値を上回る固定閾値に達するときの閾値サイクル数が決定される。閾値サイクル数は本明細書ではＣＴ数又はＣＴ値と称される。ＣＴ数は手動で決定されてもよく、又は機器により自動的に決定されてもよい。ＣＴ数を決定するため、初回の増幅サイクル中に各試料についてベースラインの蛍光が決定される。次に数学的アルゴリズムを用いて、蛍光シグナルがバックグラウンドを上回るには蛍光にどのような統計的に有意な変化が必要とされ得るかが設定される。蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）がこの閾値を超えるときのサイクル数がＣＴ数と称される。典型的には、熱サイクリングの開始時の試料中に存在するＤＮＡが多いほど、閾値に達するために費やすサイクル数が少なくなる。従って、ＣＴ数は試料中のＴＳＶの初期量に反比例する。ＴＳＶ試料についてＣＴ数が決定されると、試料中のＴＳＶについて決定された閾値サイクル数を、当該技術分野において周知のとおり既知の濃度の標準溶液を使用して決定された鋳型濃度の対数に対する閾値サイクル数の標準曲線と比較することにより、試料に当初存在するＴＳＶの量を計算できる。

核酸ハイブリダイゼーション法
ＴＳＶについての核酸ハイブリダイゼーション検査の基本要素としては、ＤＮＡプローブ、ＴＳＶを含むことが疑われる試料、及び特異的ハイブリダイゼーション法が挙げられる。本発明のプローブは、検出対象の核酸配列と相補的であり、且つそれと「ハイブリダイズ可能」な一本鎖核酸配列である。典型的にはハイブリダイゼーション法では、プローブの長さは５塩基ほどの短いものから数キロベースまで異なり得るとともに、これは行われる特異的な検査に依存するであろう。検出対象の核酸配列と相補的である必要があるのは、プローブ分子の一部のみである。加えて、プローブと標的配列との間の相補性は完全でなくともよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間にも確かに起こり、その結果、ハイブリダイズされた領域の塩基のうちある割合は適切な相補塩基と対合しない。

本明細書に開示されるＤＮＡプローブは、上記のＴＳＶ診断用プライマー配列に由来する。本明細書で使用されるとき、語句「ＴＳＶ診断用プライマー配列に由来する」は、そのＤＮＡプローブが、ＴＳＶ診断用プライマー配列、それから核酸増幅法を用いて得られる増幅産物配列、ＴＳＶ診断用プライマー配列若しくは増幅産物配列の一部分、又は前述の配列のいずれかの完全相補配列であり得ることを意味する。上記で使用されるときの用語「一部分」は、ＴＳＶ診断用プライマー配列又はそれから得られる増幅産物の完全配列より短い任意の一部を指す。好ましくは、プローブとして使用するための一部分の長さは、少なくとも約１５塩基、より好ましくは、少なくとも約２０塩基である。ＴＳＶ診断用プライマー配列に由来するＤＮＡプローブの非限定的な例としては、配列番号１〜６として示されるＴＳＶ診断用プライマー配列、配列番号７、８、及び９として示される増幅産物配列、及び配列番号１〜９の完全相補（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）配列が挙げられる。

プローブが標識されることで検出が促進され得る。核酸プローブに標識を結合させる方法は、当該技術分野において周知である。例えば、プローブは標識されたヌクレオチドを取り込むことによって合成中に標識できる。或いは、プローブ標識はニックトランスレーション又は末端標識により行うことができる。標識は蛍光検出用のフルオロフォア、又はリガンド、例えばビオチンを含んでなってもよく、リガンドはハイブリダイゼーション後にリガンド（例えば、酵素標識ストレプトアビジン）と結合する酵素標識された結合分子を使用して検出される。

エビ又は他の甲殻類などのＴＳＶを含むことが疑われる試料中のＴＳＶの存在を検出するため、上記のとおり、試料からＲＮＡが提供される。試料ＲＮＡは、プローブと標的分子との任意のハイブリダイゼーションが起こり得る前に、プローブとの接触が可能となる。従って、ＲＮＡは無細胞で、ハイブリダイゼーションが起こり得る前は適切な条件下に置かれなければならない。加えて、ある実施形態においては、ＲＮＡを精製してタンパク質、脂質、及び他の細胞成分を除去することが望ましいこともある。様々な核酸精製方法、例えばフェノール−クロロホルム抽出が当業者には周知である（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）。加えて、ＲＮＡ抽出及び精製用のキットを上記のとおりの商業的供給元から入手できる。プレハイブリダイゼーション精製は、特に標準フィルターハイブリダイゼーションアッセイに有用である。

一実施形態において、ハイブリダイゼーションアッセイは核酸抽出の必要なしに細胞溶解物上で直接行われ得る。これにより試料処理プロセスから数ステップが削減され、アッセイの速度が速まる。かかるアッセイを粗細胞溶解物上で実施するため、典型的にはカオトロピック剤が上記のとおり調製された細胞溶解物に添加される。カオトロピック剤はヌクレアーゼ活性を阻害することにより核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック剤は短鎖オリゴヌクレオチドプローブのＲＮＡとの室温での高感度及びストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ Ｎｅｓｓ及びＣｈｅｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１頁（１９９１年））。好適なカオトロピック剤としては、とりわけ、塩化グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、及びトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的には、カオトロピック剤は約３Ｍの最終濃度で存在する。必要に応じて、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを、典型的には３０〜５０容量％で添加できる。

ハイブリダイゼーション法は確立されており、溶液（すなわち、同種）及び固相（すなわち、異種）ハイブリダイゼーション法が挙げられる。典型的には、試料ＲＮＡが本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマー配列に由来するプローブにより探索される（すなわち核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブと接触する）。これは、無機塩又は有機塩の存在下で適切な濃度及び温度条件のもとプローブと試料ＲＮＡとを接触させることを伴う。プローブ及び試料核酸は十分に長い時間接触させて、プローブと試料核酸との間のあらゆる可能なハイブリダイゼーションが起こり得るようにしなければならない。混合物中のプローブ又は標的の濃度により、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間が決定され得る。プローブ又は標的の濃度が高いほど、ハイブリダイゼーションで必要なインキュベート時間は短くなる。

様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的には、これらは約２０〜６０容量％、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含んでなり得る。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０容量％のホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液、例えばクエン酸ナトリウム、トリスＨＣｌ、ＰＩＰＥＳ又はＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲は約６〜９）、約０．０５〜０．２％の界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）（分子量が約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（分子量が約２５０〜５００キロダルトン）、及び血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸、断片化された核ＤＮＡ（例えば、仔ウシ胸腺若しくはサケ精子ＤＮＡ、又は酵母ＲＮＡ）、及び場合により単位容量当たり約０．５〜２重量％のグリシンも含まれ得る。様々な極性水溶剤又は膨潤剤（例えば、ポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えば、ポリアクリレート又はポリメチルアクリレート）、及びアニオン性糖ポリマー（例えば、硫酸デキストラン）を含む体積排除剤などの他の添加剤が含まれてもよい。

核酸ハイブリダイゼーションは様々なアッセイフォーマットに適応性を有する。最も好適な１つはサンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチアッセイは特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適応性を有する。サンドイッチ型アッセイの主な要素は固体担体である。固体担体は、標識されておらず試料ＲＮＡ配列の一部分と相補的な固定化された核酸捕捉プローブに吸収されているか、又はそれと共有結合している。本発明において特に有用なプローブは、上記のとおりの、本ＴＳＶ診断用配列に由来するものである。捕捉されたＲＮＡは、上記のとおり標識されていて、且つ試料ＤＮＡ配列の異なる部分と相補的な第２のプローブを使用して検出される。標識は当該技術分野において周知の方法（例えば、蛍光、化学発光及び結合対酵素アッセイなど）を用いて検出され得る。

ハイブリダイゼーション法はまた、ＲＴ−ＰＣＲなどの核酸増幅法と組み合わせて用いられてもよい。例えば、本ＴＳＶ診断用配列は、同種又は異種アッセイフォーマットのいずれにおいても３’末端がブロックされた検出プローブとして用いられ得る。例えば、本配列から生成されたプローブは３’末端がブロックされているか、又は非関与型であってもよく、核酸増幅反応によっては伸長されないか、又はそれに関与しないであろう。加えて、プローブは、プローブ／分析物ハイブリッドを固定化するための結合点として、又は検出可能なシグナルを生成するためのレポーターとして作用する反応性リガンドとして働き得る標識を取り込む。従って、ＴＳＶを保因していると疑われる試料から単離されたＲＮＡは逆転写を用いて相補ＤＮＡに転換され、そのＤＮＡが、過剰量の３’末端がブロックされた検出プローブの存在下で標準的なプライマー特異的増幅プロトコルにより増幅され、増幅産物が産生される。プローブは３’末端がブロックされているため、標的の増幅に関与したり、又はそれを妨害したりすることはない。最後の増幅サイクルの後、検出プローブが増幅されたＤＮＡの関連する部分にアニールされ、次にアニールされた複合体が反応性リガンドを介して担体に捕捉される。

本プローブは用途が広く、いくつかの代替的形態で設計され得る。プローブの３’末端は、複製阻害部分の結合によってプライマー伸長反応への関与が阻止され得る。典型的な複製阻害部分としては、限定はされないが、ジデオキシヌクレオチド（ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｌｅｏｔｉｄｅ）、３’デオキシヌクレオチド、ミスマッチヌクレオシド又はヌクレオチドの配列、３’リン酸基及び化学剤、例えば、ビオチン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、ローダミン、及び炭素鎖が挙げられる。複製阻害剤は標準シアノエチルホスホラミダイト化学反応を用いて、化学合成中に非関与プローブの３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基と共有結合する。このプロセスは固相合成化学反応を用いるもので、ここでは３’末端が不溶性担体（コントロールド・ポア・グラス、すなわち「ＣＰＧ」）と共有結合し、一方で新しく合成された鎖が５’末端に成長する。本発明に関連するなかでは、３−デオキシリボヌクレオチドが好ましい複製阻害剤である。コルジセピン（３−デオキシアデノシン）は最も好ましい。コルジセピンはプローブの３’末端の終端に結合するため、合成は、ＣＰＧと共有結合したコルジセピン、５−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−３−デオキシアデノシン（コルジセピン）、２−サクシノイル−長鎖アルキルアミノＣＰＧ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）から開始される。ジメトキシトリチル基が外れ、鎖合成の開始が固相コルジセピンの脱保護された５’ヒドロキシル基から始まる。合成の完了後、オリゴヌクレオチドプローブは固体担体から切断されて外れ、３’末端に結合したコルジセピンの遊離２’ヒドロキシル基が残る。他の試薬もまた非関与型プローブの合成中に３’末端に結合して複製阻害剤として働くことができる。これらとしては、限定はされないが、他の３−デオキシリボヌクレオチド、ビオチン、ジニトロフェノール、フルオレセイン、及びジゴキシゲニンが挙げられる。これらの試薬の各々で誘導体化されたＣＰＧ担体は、商業的供給元から入手可能である（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ；及びＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。

或いは、非対称増幅を使用して検出プローブと相補的な鎖を生成してもよい。一本鎖ＤＮＡを産生するための非対称ＰＣＲ条件はＰＣＲについての上記の条件と同様だが、プライマー濃度は一方のプライマーが過剰で、他方のプライマーが限定的であるように調整される。この手順により方法の感度が高まるであろうことが企図される。この感度の向上は、検出プローブとの結合に利用可能な一本鎖の数が増えることにより起こり得る。

感染リスク及びＲＮＡ損傷又はＴＳＶ不活化の評価
本明細書に開示される試料中のＴＳＶの存在を検出し、その量を定量するための方法は、ＲＮＡ損傷又はＴＳＶ不活化の程度を評価するために用いられ得る。例えば、本明細書に開示される方法は化学的処置と組み合わせて用いることによりエビの健康及び発育を向上させ得る。具体的には、エビを生産し、発育させる間に、生産施設から採取された試料、又はエビの生存環境から採取された試料がサンプリングされ、ＴＳＶの存在について本明細書に開示される方法を用いて検査され得る。ＴＳＶが見つかった場合、施設及び／又はエビには、ウイルスを死滅させるか、又は制圧するための処置が施され得る。この検査は高感度であるため、ＴＳＶはその生産群が壊滅し損失を被る前に早期に検出され得る。従って、本明細書に開示される方法を化学的介入と組み合わせて用いることで、生産の効率性及び生産高を向上させることができる。化学的な処置の例としては、限定はされないが、Ｖｉｒｋｏｎ（登録商標）Ｓ殺菌剤（Ｅ．Ｉ． Ｄｕ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｃｏ．の登録商標）、過酢酸、過酸化水素、過マンガン酸塩、一過硫酸カリウム、次亜塩素酸、次亜塩素酸塩及びヨウ素などの酸化殺菌剤；プロバイオティクス、免疫賦活剤、飼料補助剤、及びウイルスの宿主結合を妨げる組換えタンパク質／核酸が挙げられる。化学的処置の後、生産環境のエビはサンプリングされ、再検査によって処置が成功してウイルスが根絶されたかどうかが判定され得る。

別の実施形態においては、プライマーを様々な組み合わせで使用することにより、完全性及び化学的処置によって生じるウイルスゲノムの損傷程度を確認し得ることが考えられる。例えば、ＴＳＶ２（配列番号１）のフォワードプライマーとＴＳＶ３（配列番号４）のリバースプライマーとを組み合わせて用いることによりおよそ５０００塩基の増幅産物が産生され得る。このより長い産物は、ウイルスゲノムが無傷で損傷を受けていない状態にある場合にのみ形成され得る。従って、より小さい産物（配列番号７又は配列番号８）の、増幅中に形成されたより長い産物（又はより長い産物の不在）に対する比を比較することにより、化学的処置又は介入によって生じたウイルスゲノムの損傷の程度を評価できる。これは化学的処置又は介入の効力を確定するのに役立つ。

検出キット
別の実施形態において、本発明は核酸増幅法に基づくＴＳＶの検出用キットを提供する。このキットは、上記のとおりのＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つの対を含む。加えて、このキットはさらに、以下の試薬、すなわち、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、４つの異なるデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、核酸結合性蛍光剤、試料内部対照プライマーの少なくとも１つの対、少なくとも１つの鋳型内部対照及び鋳型内部対照プライマーの少なくとも１つの対、及びキットに含まれるＴＳＶ診断用プライマー配列による増幅が可能なＴＳＶゲノム内の核酸の少なくとも１つの領域の一部分と相補的な配列を含んでなるプローブのなかの少なくとも１つを含む。キットのプライマー及び他の試薬は、液状、乾燥状態、又は錠剤などの様々な形態であってもよく、バイアル、試験管などの１つ又は複数の任意の好適な容器中に存在し得る。

別の実施形態において、本発明はサンドイッチアッセイハイブリダイゼーション法に基づくＴＳＶの検出用キットを提供する。このキットは、ＴＳＶにかかっていることが疑われるエビ又は他の甲殻類から試料を採取するための第１の要素と、試料を投入（ｄｉｓｂｕｒｓｅｍｅｎｔ）し、溶解させるための緩衝液とを含む。第２の要素としては、標的核酸とプローブ核酸とをハイブリダイズすると同時に、望ましくない、ハイブリダイズしない形態のものを洗浄により除去するための、乾燥形態又は液状形態の媒質が挙げられる。第３の要素としては固体担体（例えば、ディップスティック、ビーズなど）が挙げられ、その上に本明細書に開示される単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列に由来する未標識核酸プローブが固定される（又はそれとコンジュゲートされる）。第４の要素は同じＤＮＡ鎖のなかの第２の異なる領域と相補的な標識プローブを含み、それに対し、第３の要素の固定化された未標識の核酸プローブがハイブリダイズされる。標識プローブはまた、本明細書に開示される単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列に由来してもよい。
以下、本発明を要約すると下記の通りである。
１．配列番号１に記載の単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列又は配列番号１と完全に相補的な単離核酸分子。
２．配列番号２に記載の単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列又は配列番号２と完全に相補的な単離核酸分子。
３．配列番号３に記載の単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列又は配列番号３と完全に相補的な単離核酸分子。
４．配列番号４に記載の単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列又は配列番号４と完全に相補的な単離核酸分子。
５．配列番号５に記載の単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列又は配列番号５と完全に相補的な単離核酸分子。
６．配列番号６に記載の単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列又は配列番号６と完全に相補的な単離核酸分子。
７．ＴＳＶゲノム内の核酸の領域を増幅する核酸増幅反応をプライムする能力を有する、前記１〜６のいずれかに記載の２つの異なるＴＳＶ診断用プライマー配列の対。
８．配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、並びに配列番号３及び６からなる群から選択される、前記７に記載の２つの異なるＴＳＶ診断用プライマー配列の
対。
９．前記７に記載のＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つの対を含むＴＳＶの検出用キット。
１０．逆転写酵素、耐熱性ポリメラーゼ、４つの異なるデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、核酸結合性蛍光分子、試料内部対照プライマーの少なくとも１つの対、少なくとも１つの鋳型内部対照及び鋳型内部対照プライマーの少なくとも１つの対、並びにＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つの対により増幅可能なＴＳＶゲノム内の核酸の少なくとも１つの領域の一部分と相補的な配列を含むプローブからなる群から選択された少なくとも１つの試薬をさらに含む、前記９に記載のＴＳＶの検出用キット。
１１．試料中のＴＳＶの存在を検出するための方法であって、
（ｉ）ＴＳＶを含むことが疑われる試料からＲＮＡを提供する工程、及び
（ii）好適なハイブリダイゼーション条件下で、前記１〜６のいずれかに記載の単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列に由来するプローブにより上記ＲＮＡを探索する工程、
を含み、ハイブリダイズ可能な核酸断片が同定されると、それがＴＳＶの存在の確証となる、上記方法。
１２．単離されたＴＳＶ診断用プライマー配列に由来するプローブが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及びそれらの完全相補配列からなる群から選択される、前記１１に記載の試料中のＴＳＶの存在を検出するための方法。
１３．プローブが３’末端に複製阻害部分を含む、前記１１に記載の方法。
１４．複製阻害部分が、ジデオキシヌクレオチド、３’デオキシヌクレオチド、ミスマッチヌクレオシド又はヌクレオチドの配列、３’リン酸基及び化学剤からなる群から選択される、前記１３に記載の方法。
１５．３’デオキシヌクレオチドがコルジセピンである、前記１４に記載の方法。
１６．試料中のＴＳＶの存在を検出するための方法であって、
（ｉ）ＴＳＶを含むことが疑われる試料からＲＮＡを提供する工程、
（ii）逆転写酵素及び前記１〜６に記載のＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つを用いて上記ＲＮＡと相補的なＤＮＡを合成する工程、及び
（iii）増幅産物が生成されるよう、前記７に記載のＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つの対により上記相補ＤＮＡを増幅する工程、
を含み、増幅産物が存在すると、それがＴＳＶの存在の確証となる上記方法。
１７．（iii）の増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、前記１６に記載の試料中のＴＳＶの存在を検出するための方法。
１８．（iii）の増幅工程が核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブの存在下で行われ、増幅産物の存在が蛍光検出を用いて確認される、前記１６に記載の試料中のＴＳＶの存在を検出するための方法。
１９．蛍光標識プローブが、配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択される、前記１８に記載の方法。
２０．試料内部対照プライマーの少なくとも１つの対が（iii）の増幅工程に含まれることにより試料内部対照産物が産生される、前記１６に記載の方法。
２１．試料内部対照プライマーの少なくとも１つの対が、配列番号１０、１１及び配列番号１２、１３からなる群から選択される、前記２０に記載の方法。
２２．鋳型内部対照プライマーの少なくとも１つの対及び少なくとも１つの鋳型内部対照が、（iii）の増幅工程に含まれることにより鋳型内部対照産物が産生される、前記１６に記載の方法。
２３．試料中のＴＳＶの量を定量するための方法であって、
（ｉ）ＴＳＶを含むことが疑われる試料からＲＮＡを提供する工程、
（ii）逆転写酵素及び前記１〜６に記載のＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つを用いて上記ＲＮＡと相補的なＤＮＡを合成する工程、
（iii）核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブの存在下での少なくとも変性温度と伸
長温度との間の熱サイクリングによって、前記７に記載のＴＳＶ診断用プライマー配列の少なくとも１つの対により上記相補ＤＮＡを増幅する工程、
（iv）上記熱サイクリング中に上記核酸結合性蛍光剤又は上記蛍光標識プローブにより生成された蛍光量を測定する工程、
（ｖ）上記核酸結合性蛍光剤又は上記蛍光標識プローブにより生成される蛍光量が基礎値を上回る固定閾値に達するときの閾値サイクル数を決定する工程、及び
（vi）上記試料中のＴＳＶについて決定された上記閾値サイクル数を、既知の濃度の標準溶液を用いて決定された鋳型濃度の対数に対する閾値サイクル数の標準曲線と比較することにより、該試料中のＴＳＶの量を計算する工程、
を含む、上記方法。
２４．蛍光標識プローブが、配列番号１４及び配列番号１５からなる群から選択される、前記２３に記載の方法。
２５．ＲＮＡ損傷又はＴＳＶ不活化の評価に用いられる、前記１１、１６、又は２３のいずれかに記載の方法。
２６．エビの健康及び発育を向上させるために化学的処置と組み合わせて用いられる、前記１１、１６、又は２３のいずれかに記載の方法。

本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示として提示されるに過ぎないことは理解されたい。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認でき、且つ本発明の趣旨及び精神から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を行って本発明を様々な用途及び条件に適応させることができる。

略語の意味は次のとおりである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「ｎＭ」はナノモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｆｇ」はフェムトグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＵ」はミリ単位を意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｒｘｎ」は反応を意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ＯＤ」は光学濃度を意味し、「ＯＤ_２６０」は２６０ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味し、「ＯＤ_２８０」は２８０ｎｍの波長で測定された光学濃度を意味し、「ＯＤ_{２８０／２６０}」はＯＤ_２８０値のＯＤ_２６０値に対する比を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「ＣＴ」は反応における蛍光の増加が検出閾値を超えるときのサイクル数を意味し、及び「ＳＰＦ」は特定病原体を含まないことが証明されていることを意味する。

一般的方法
本実施例で用いられる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローン技術は当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年と、Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、及びＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８４年と、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９８７年とにより記載されている。

ゲノム配列の分析及びプライマーの指定は、ＩｎｆｏｒＭａｘ Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から入手可能なＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅを使用して達成された。

本明細書において使用される酵素及び試薬は、以下の業者から購入した：
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ：ＡｍｐｌｉＴａｑ（カタログ番号Ｎ８０８−０１６０）；
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ：デオキシヌクレオチド溶液混合物（カタログ番号Ｎ０４４７Ｓ）；
Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ、Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ：オリゴヌクレオチド；
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ：４％アガロースＥ−ｇｅｌ（カタログ番号Ｇ６０１８−０２）；
Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ：プロテイナーゼＫ（カタログ番号１９１３１）；及びＲＮａｓｅ Ａ、ＤＮａｓｅフリー（カタログ番号１９１０１）及びＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（カタログ番号７９２５４）；
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ：ＲＮａｓｅ阻害剤（カタログ番号Ｎ８０８０１１９）。ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（カタログ番号４３１１２３５）、ＡｍｐｌｉＴａｑ（カタログ番号Ｎ８０８−０１６０、ジエチルプロカーボネート（ＤＥＰＣ）水（カタログ番号１０８１３−０１２）。

加えて、キット及び試薬は以下の業者から購入した：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ；カタログ番号４３０９１５５）；ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ；カタログ番号７４７０４）及びＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ；カタログ番号５１３０４）。

エビＲＮＡ及びＤＮＡ試料は、Ｄｏｎａｌｄ Ｖ．Ｌｉｇｈｔｎｅｒ、アリゾナ大学獣医学・微生物学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ ８５７２１、米国から入手した。これらには、疾患にかかっていないことが証明されているエビ（ＳＰＦ）、並びに（ペナエウス）モノドン（（Ｐｅｎａｅｕｓ）ｍｏｎｏｄｏｎ）型バキュロウイルス（ＭＢＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、ホワイトスポットシンドロームウイルス（ＷＳＳＶ）、Ｐ．モノドン（Ｐ．ｍｏｎｏｄｏｎ）のイエローヘッド病ウイルス（ＹＨＶ）、伝染性皮下造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）及び伝染性筋壊死ウイルス（ＩＭＮＶ）を含む感染エビからの試料が含まれた。加えて、ＴＳＶに感染したエビの乾燥組織もまたＤｏｎａｌｄ Ｖ．Ｌｉｇｈｔｎｅｒから入手した。

鋳型及びプライマー
ＴＳＶ合成鋳型を合成するためのＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ２７７６７５）から調製した；Ｍａｒｉ，Ｊ．、Ｐｏｕｌｏｓ，Ｂ．Ｔ．、Ｌｉｇｈｔｎｅｒ，Ｄ．Ｖ．及びＢｏｎａｍｉ，Ｊ．Ｒ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３（第４部）：９１５−９２６頁（２００２年）。これらはそれぞれ、塩基４７５〜５９２及び４９５３〜５０７６及び７３７７〜７４９５から合成した。ＴＳＶ合成標的は、標準的なホスホラミダイト化学反応を用いて合成するか、又は市販品を購入した（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）。ＴＳＶ合成標的は単一の反応において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける定量のために陽性対照及び標準として使用した。

合成鋳型標的の濃度及びコピー数を２６０ｎｍにおける分光光度計測値（ＯＤ_２６０）から決定した。鋳型は特定のコピー数まで精製水で希釈し、これらをアッセイ定量の陽性対照及び標準として使用した。表３は、ゲノム位置、配列番号、及び鋳型標的の長さを提示する。

プライマー配列を同様に合成するか、又は市販品を購入した（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）。ＴＳＶ検出に有用なプライマーの配列は、配列番号１〜６として示される。

エビ組織からのＲＮＡの単離
ＲＮｅａｓｙ線維組織Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．カタログ番号７４７０４）を用いてエビ組織からＲＮＡを単離した。キット試薬及び製造者の手順を用いて全てのＲＮＡを回収した。概してこれは、製造者の指示どおりに調製した３００μＬのβメルカプトエタノールＲＴＬ緩衝液混合物を１．５ｍＬの微量遠心管内の１０ｍｇのエビ組織に添加することを伴った。組織は製造者により提供される棒で破砕することにより割り砕き、組織をホモジナイズした。溶解物を２ｍＬの収集管に入ったＱＩＡシュレッダー・スピンカラム上に直接移し、２分間、最大速度で遠心した。次にＲＮａｓｅフリー水（５９０μＬ）及び１０μＬのプロテイナーゼＫ溶液（２．５μｇ／１０μＬ）を試料に添加し、ピペッティングすることにより試料を完全に混合した。試料管は５６℃で１０分間インキュベートし、次に８０００×ｇで２０〜２５℃において３分間遠心した。５００μＬのエタノール（９６〜１００％）を静澄な溶解物に添加し、混合した。試料液をＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉスピンカラムに移し、８０００×ｇで１５秒間遠心した。溶出物は廃棄した。次にＲＷ１洗浄緩衝液（３５０μＬ）をカラムに添加し、そのカラムを８０００×ｇで１５秒間遠心した。溶出物は廃棄した。スピンカラムを清浄な収集管に入れた後、３０Ｕ／８０μＬのＤＮａｓｅ Ｉ溶液をスピンカラムに添加し、そのカラムを反転させて混合を促進した。次にスピンカラムの内容物を室温で１５分間インキュベートした。次に、さらに３５０μＬのＲＷ１洗浄緩衝液を添加し、カラムを８０００×ｇで１５秒間遠心した。溶出物は廃棄した。ＲＰＥ緩衝液（５００μＬ）を添加し、カラムを８０００×ｇで２分間遠心した。溶出物は廃棄した。スピンカラムを清浄な１．５ｍＬの微量遠心管に入れた後、５０μＬのＲＮａｓｅフリー水をスピンカラムに添加し、その遠心管を８０００×ｇで１分間遠心した。精製されたＲＮＡを含む溶出物を１．５ｍＬの微量遠心管に収集した。精製されたＲＮＡは使用するまでＲＮＡａｓｅフリー水中に−２０℃で保存した。

精製されたＲＮＡの純度及び含量を従来どおりのＯＤ_{２８０／２６０}比計測値により評価し、ＲＮＡ量をＯＤ_２６０計測値から決定した。ある場合には、検査のため試料をＲＮａｓｅフリー水で希釈した。

実施例１〜３
ＲＴ−ＰＣＲ増幅条件を用いたＴＳＶ合成ＤＮＡ標的の検出
これらの実施例の目的は、本明細書に開示されるＲＴ−ＰＣＲ増幅条件及びプライマーを用いたＴＳＶ合成ＤＮＡ鋳型の検出を実証することであった。

ＴＳＶ合成鋳型（上記）をＤＮａｓｅフリー水で１０倍連続希釈することにより、鋳型標準を調製した。概して、標準の鋳型濃度は１０^７〜０コピー／μＬの範囲であった。２５μＬのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ；カタログ番号４３０９１５５）に対し、表４に示されるとおりの各々３１．３ｎＭの然るべきＴＳＶフォワードプライマー及び６２．５ｎＭの適切に適合するリバースプライマー、１２．５ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素、２０ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ ＲＮａｓｅ阻害剤及び４５μＬ／反応の最終容量を作成するのに十分なＤＥＰＣ水を添加することにより、マスター混合物を調製した。マスター混合物は使用するまで氷上で保管した。

各反応について、まず初めに５μＬの鋳型標準をＰＣＲ反応ウェルに添加し、次に４５μＬのマスター混合物を添加した。次に反応液を、４８℃で３０分間の初期ステップ、続いて９５℃で１０分間の初期変性ステップで、次に９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の温度プログラムを用いた４０サイクルの熱サイクルにかけた。増幅は、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学９６ウェル反応プレートにおいて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行った。各サイクル中、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎレポーター色素のＤＮＡ増幅産物との相互作用から生じる蛍光の増加をモニタすることにより、ＰＣＲ産物の形成を検出した。ＰＣＲの完了後、６０℃〜９５℃の範囲にわたり解離曲線（融解曲線）を生成した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ ＳＤＳソフトウェアを用いてデータを分析した。さらに、ＰＣＲ産物の形成について、４％アガロースＥｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ番号Ｇ６０１８−０２）を用いたアガロースゲル電気泳動によりゲル製造者のプロトコルに従い分析した。

表４に要約される結果は、然るべきＴＳＶ鋳型が存在したときは、各プライマーセットについて然るべきサイズのアンプリコン産物が産生されたことを実証している。鋳型の最小検出レベルは１〜１０コピー／ｒｘｎであった。鋳型を含まない試料は検出可能な正しいＴＳＶ産物を産生しなかった。

増幅（ＣＴ）及びアンプリコン産物の形成は、鋳型の出発濃度の対数にそれぞれ反比例及び正比例した。

実施例４〜６
ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いた感染エビ組織からのＴＳＶウイルスの検出及び定量
これらの実施例の目的は、本明細書に開示されるプライマーによるＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いた感染エビ組織におけるＴＳＶの検出及び定量を実証することであった。

これらの実施例では、実施例１〜３に記載される条件を用いて、１反応当たり１０^６〜１０^０コピーの範囲の然るべき合成鋳型ＤＮＡ（上記）の連続希釈液を増幅した。合成鋳型濃度の各々から決定されたＣＴ値を用いて、９５％信頼区間のＣＴ値を標準における初期鋳型コピー数の対数に対しプロットすることにより標準曲線（図示せず）を生成した。次にこの曲線の傾き（すなわち、ｌｏｇ濃度に対するＣＴ）を用いて、未知の試料におけるウイルスゲノムのコピーをそれぞれのＣＴ値から推定した。

ゲノムＲＮＡは、Ｄｏｎａｌｄ Ｖ．Ｌｉｇｈｔｎｅｒ（アリゾナ大学獣医学・微生物学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ）、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ ８５７２１、米国）から得られたものか、又は上記のとおり、ＴＳＶのメキシコ分離株に感染させたエビから単離されたものを使用した。ＴＳＶ感染エビ鰓の全てのＲＮＡ（７１ｎｇ／μＬ）をＲＮａｓｅフリー水で連続希釈し、これを用いてＲＮＡ濃度が総ＲＮＡの１ｎｇ／μＬ〜１ｆｇ／μＬの範囲の一連の試料を提供した。陰性対照としては、鋳型を含まない水対照、並びに非感染（ＳＰＦ）エビの２つの株（バナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ ｖａｎｎａｍｅｉ）（２６ｎｇ／μＬ）及びウシエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ）（３１μｇ／μＬ））からＲＮＡを抽出することにより得られた２つのＲＮＡエビ試料（１０ｎｇ／ｒｘｎ）が含まれた。

次に、プライマー対の１つ（表５を参照）及び実施例１〜３に指定されたものと同じ増幅、マスター混合物、熱サイクリングの条件及び機器を用いて、希釈した試料を増幅した。次に、希釈した各ＲＮＡ試料についてのＣＴ値をＰＣＲ増幅反応から評価した。次に、試料中のウイルスゲノムのコピーを、鋳型のｌｏｇ濃度プロットに対する標準ＣＴのＣＴ値及び傾きから推定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物についてもまた、実施例１〜３に記載されるとおり、アガロースゲル電気泳動により分析した。

結果は表５に要約される。表では、１反応当たりのＴＳＶコピー数は、３回の反復の平均値として示される。この結果は、全てのプライマーセットが感染エビのＲＮＡから正しいアンプリコン産物サイズを産生し、感染エビの試料中にＴＳＶ ＲＮＡを検出したことを示す。検出限界は使用されるプライマー対に応じて約１０コピー／ｒｘｎ〜約１０００コピー／ｒｘｎのウイルスゲノムの範囲であった。水対照試料又は２つのＳＰＦエビ試料には増幅産物は検出されなかった。陰性対照試料で得られた結果は、このアッセイが２つの被験エビ株からの非ウイルス性ＲＮＡに反応性を有しないことを実証している。

実施例７
ＴＳＶプライマーの特異性
この実施例の目的は、本明細書に開示されるプライマーが、世界の種々の地域からのＴＳＶ株由来の相補ＲＮＡは増幅するが、他のエビ病原体に感染したエビのＲＮＡは増幅しないことを実証することであった。

この実施例では、他のエビ病原体に感染したエビから単離されたＲＮＡが使用された。具体的には、種々の地理的領域（すなわち、ハワイ、タイ、メキシコ、ベリーズ及びベネズエラ）からのＴＳＶ株、並びに非ＴＳＶエビウイルス（ＭＢＶ、ＷＳＳＶ、ＹＨＶ、ＩＨＨＮＶ、及びＩＭＮＶ）に感染したエビから単離されたＲＮＡ試料を、実施例４〜６に記載されるプライマー及びＲＴ−ＰＣＲ法を用いて試験した。

全てのＴＳＶ株が実施例４〜６に記載される株と同様の検出限界で検出された。非ＴＳＶに感染したエビのＲＮＡ試料を検査したときは、増幅は観察されなかった。これらの所見をまとめて考えると、これは本明細書に開示されるＴＳＶ診断用プライマー配列及び方法がＴＳＶについて選択性を有し、このプライマーがエビＲＮＡ又は他の被験エビ病原体に反応しないことを実証している。

実施例８
ＰＣＲを用いた試料内部対照との組み合わせによるＴＳＶ ＲＮＡの検出
この実施例の目的は、本明細書に開示されるＴＳＶプライマーが試料内部対照（ＩＳＣ）プライマーと組み合わせて使用することにより、ＴＳＶ産物に加えＩＳＣ産物を産生できることを実証することであった。以下に提示される結果は、ＩＳＣプライマーが独立して試料ＤＮＡを増幅し、ＴＳＶ ＲＮＡの増幅を妨害しないことを実証している。ＩＳＣ産物の存在により、検査に十分な量及び質の試料ＲＮＡが回収されたことの指標として用いることのできるマーカーが提供される。

ＩＳＣプライマーはウシエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ）アクチン１遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ１００９８６）に由来した。ＩＳＣプライマーは、ＴＳＶアンプリコンの選択的増幅を促進するため、ＤＮＡ断片をそれほど効率的には増幅しないか、又は標的ＴＳＶアンプリコンより大きいＤＮＡ断片を増幅するよう設計された。ＩＳＣプライマー配列は、配列番号１０，１１、及び配列番号１２，１３として示される（表２を参照）。

ＴＳＶに感染したエビ（ウシエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｄｏｎ））からのゲノム調製物をＤＮａｓｅフリー水で１０倍連続希釈することにより、ＴＳＶ ＲＮＡ及びエビアクチン（ａｃｉｔｎ）ＤＮＡを含む試料を調製した。試料のＲＮＡ含量は１反応当たり０．１ｎｇ〜０．１ｐｇの範囲であった。次に非感染エビからのエビゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ）を各ＴＳＶ試料及びＴＳＶ ＲＮＡを含まない陰性対照試料に添加した。

１５μＬ／反応のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ；カタログ番号４３０９１５５）を、３１ｎＭのＴＳＶ２フォワードプライマー及び６２ｎＭのリバースプライマー（それぞれ、配列番号１及び２）及びそれぞれ３１ｎＭのアクチン１フォワードプライマー及び６２ｎＭのリバースプライマー（配列番号１０及び１１）の最終濃度を得るのに十分な量のプライマー原液（ＴＳＶプライマーの各々について２０μＭ及びアクチンプライマーの各々について１０μＭ）、０．２５ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素、２０ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ ＲＮａｓｅ阻害剤と組み合わせることによりマスターＰＣＲ混合物を調製し、ＤＮａｓｅフリー水を添加して２５μＬ／反応の最終容量を作成した。マスター混合物は使用するまで氷上で保管した。

各反応について、まず初めに５μＬの試料をＰＣＲ反応ウェルに添加し、次に２５μＬのマスター混合物を添加した。次に反応液を、４８℃で３０分間、９５℃で５分間、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルの温度プログラムを用いた４０サイクルの熱サイクルにかけた。増幅は、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学９６ウェル反応プレートにおいて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行った。

各サイクル中、上記のとおりＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎレポーター色素のＤＮＡ増幅産物との相互作用により生じる蛍光の増加から決定されるＣＴ値により、産物の形成をモニタした。４０サイクル後、６０℃〜９５℃の範囲にわたり解離曲線（融解曲線）を生成した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ ＳＤＳソフトウェアを用いてデータを分析した。さらに、ＰＣＲ産物の形成について、４％アガロースＥｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ番号Ｇ６０１８−０２）及びゲル製造者のプロトコルを用いたアガロースゲル電気泳動により分析した。

ＩＳＣアクチンＦ２（配列番号１０）及びアクチンＲ２（配列番号１１）を用いて得られた結果が図１Ａ及び１Ｂに示され、これらの結果は双方の鋳型標的の同時増幅を実証している。特異的ＴＳＶ ＲＮＡが７７．２℃の融解温度で１１８ｂｐの産物を産生した。アクチンＩＳＣは１３９ｂｐの産物を産生した（Ｔｍ＝８４．４℃）。ＴＳＶ産物及びアクチン内部対照産物は、融解曲線分析（図１Ａ）及びゲル電気泳動（図１Ｂ）の双方によりそれらのサイズ及び融解温度の差に基づき検出された。ＴＳＶ標的の不在下、様々なＴＳＶ標的濃度において、ＩＳＣ産物の形成は８４．４℃での単一の融解温度ピークとして（図１Ａに示されるとおり）、及び電気泳動法により（図１Ｂに示されるとおり）検出された。ＴＳＶ鋳型を含む全ての試料において、特異的ＴＳＶアンプリコンが、融解温度（Ｔｍ＝７７．２℃）及びゲル電気泳動の双方により検出された。これらの結果は、アクチンＩＳＣ鋳型がＴＳＶ鋳型と共増幅し、ＲＴ−ＰＣＲ増幅及びＲＴ−ＰＣＲアッセイの検出限界（０．００１ｎｇ／ｒｘｎ）がＩＳＣの存在によって影響されなかったことを実証している。

実施例９及び１０
蛍光標識プローブを用いたＴＳＶの検出
この実施例は、本明細書に開示されるＴＳＶプライマーが蛍光標識プローブと組み合わせてＴＳＶのリアルタイム検出及び定量に使用できることを実証した。

蛍光標識プローブを構築するための遺伝子配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ９４４０４）から購入したＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ｖ２．０ソフトウェアを用いたＴＳＶ遺伝子及び被験アンプリコンの分析により選択した。プローブ配列は、特異的ＴＳＶ被験アンプリコンの近位末端の範囲内に収まるよう選択し、アンプリコンのサイズ及び配列に応じて３０〜１１０塩基長であった。プローブ配列の選択性は、Ｇ／Ｃ含量が３０〜８０％で、Ｃ含量がＧ含量より高く、且つ５’末端のＧがない領域に付与した。概して、プローブ配列はＴｍが被験プライマーのそれぞれのＴｍを上回る８〜１０℃であるものを選択した。使用に際し他の種とクロスハイブリダイズするプローブ配列は選択しなかった。これらの基準を満たすよう選択されたプローブ配列が、表６に列挙される。

リアルタイム検出のため、プローブ配列を二重標識した。２つの異なる標識手法を用いた。プローブの５’末端はフルオロフォア（６ＦＡＭ（商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識した。３’末端は、クエンチャー色素で標識するか、又は副溝（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｖｅ）結合性（ＭＧＢ）プローブの場合には、３’末端はクエンチャー色素と副溝（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｖｅ）結合剤の複合体で標識した。標識プローブを調製し、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓから購入した。

ＴＳＶ合成鋳型（上記）をＤＮａｓｅフリー水で１０倍連続希釈することにより鋳型標準を調製した。概して、標準の鋳型濃度は１０^７〜０コピー／μＬの範囲であった。２５μＬ／反応のＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ；カタログ番号４３２６７０８）を、それぞれ３１ｎＭのＴＳＶフォワードプライマー及び６２ｎＭのＴＳＶリバースプライマーの反応最終濃度を提供する量の表７に示される然るべき原液、５０ｎＭのプローブ及び０．２５ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素、２０ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ ＲＮａｓｅ阻害剤と組み合わせることにより、マスター混合物を調製した。ＤＮａｓｅフリー水を添加して２５μＬ／反応の最終容量を作成した。マスター混合物は使用するまで氷上で保管した。

各反応について、まず初めに５μＬの試料をＰＣＲ反応ウェルに添加し、次に２５μＬのマスター混合物を添加した。次に反応液を、４８℃で３０分間、９５℃で５分間、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の４０サイクルの温度プログラムを用いて４０サイクルの熱サイクルにかけた。増幅は、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学９６ウェル反応プレートにおいて、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行った。

各サイクル中、蛍光標識プローブから生じる蛍光の増加をモニタすることによりＰＣＲ産物の形成を検出した。ＡＢＩ ＳＤＳ ２．２ソフトウェアを用いてデータを分析した。さらに、ＰＣＲ産物の形成について、４％アガロースＥｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログ番号Ｇ６０１８−０２）及び製造者のプロトコルを用いたアガロースゲル電気泳動により分析した。

表７に要約されるゲルデータ（本明細書では示さない）及び結果は、然るべきＴＳＶ鋳型が存在するとき、各プライマー／プローブセットについて然るべきサイズのアンプリコン産物が産生されたことを実証している。鋳型の最小検出レベルは、使用されるプライマー及びプローブに応じて１００〜１０００コピー／ｒｘｎであった。鋳型を含まない試料は、検出可能な産物を産生しなかった。

増幅（ＣＴ）及びアンプリコン産物の形成は、鋳型の出発濃度の対数にそれぞれ反比例及び正比例した。

Claims (4)

1. 配列番号１に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号２に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せ、配列番号３に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号４に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せ、又は配列番号５に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号６に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せから選択される２つの異なるＴＳＶ診断用プライマーの対。
2. 請求項１に記載のＴＳＶ診断用プライマーの少なくとも１つの対を含むＴＳＶの検出用キット。
3. 試料中のＴＳＶの存在を検出するための方法であって、
   （ｉ）ＴＳＶを含むことが疑われる試料からＲＮＡを提供する工程、
   （ii）逆転写酵素及び配列番号１に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマー、配列番号３に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマー、又は配列番号５に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーから選択されるＴＳＶ診断用プライマーの少なくとも１つを用いて上記ＲＮＡと相補的なＤＮＡを合成する工程、及び
   （iii）増幅産物が生成されるよう、請求項１に記載のＴＳＶ診断用プライマーの少なくとも１つの対により上記相補ＤＮＡを増幅する工程であって、
   ここで、（ii）工程中、使用するＴＳＶ診断用プライマーが配列番号１に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーであるとき、ＴＳＶ診断用プライマーの対は、配列番号１に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号２に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せであり、（ii）工程中、使用するＴＳＶ診断用プライマーが配列番号３に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーであるとき、ＴＳＶ診断用プライマーの対は、配列番号３に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号４に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せであり、（ii）工程中、使用するＴＳＶ診断用プライマーが配列番号５に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーであるとき、ＴＳＶ診断用プライマーの対は、配列番号５に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号６に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せである工程、を含み、増幅産物が存在すると、それがＴＳＶの存在の確証となる上記方法。
4. 試料中のＴＳＶの量を定量するための方法であって、
   （ｉ）ＴＳＶを含むことが疑われる試料からＲＮＡを提供する工程、
   （ii）逆転写酵素及び配列番号１に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマー、配列番号３に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマー、又は配列番号５に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーから選択されるＴＳＶ診断用プライマーの少なくとも１つを用いて上記ＲＮＡと相補的なＤＮＡを合成する工程、
   （iii）核酸結合性蛍光剤又は蛍光標識プローブの存在下での少なくとも変性温度と伸長温度との間の熱サイクリングによって、請求項１に記載のＴＳＶ診断用プライマーの少なくとも１つの対により上記相補ＤＮＡを増幅する工程であって、
   ここで、（ii）工程中、使用するＴＳＶ診断用プライマーが配列番号１に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーであるとき、ＴＳＶ診断用プライマーの対は、配列番号１に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号２に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せであり、（ii）工程中、使用するＴＳＶ診断用プライマーが配列番号３に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーであるとき、ＴＳＶ診断用プライマーの対は、配列番号３に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号４に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せであり、（ii）工程中、使用するＴＳＶ診断用プライマーが配列番号５に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーであるとき、ＴＳＶ診断用プライマーの対は、配列番号５に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーと配列番号６に記載の配列からなる単離核酸分子からなるプライマーとの組合せである工程、
   （iv）上記熱サイクリング中に上記核酸結合性蛍光剤又は上記蛍光標識プローブにより生成された蛍光量を測定する工程、
   （ｖ）上記核酸結合性蛍光剤又は上記蛍光標識プローブにより生成される蛍光量が基礎値を上回る固定閾値に達するときの閾値サイクル数を決定する工程、及び
   （vi）上記試料中のＴＳＶについて決定された上記閾値サイクル数を、既知の濃度の標準溶液を用いて決定された鋳型濃度の対数に対する閾値サイクル数の標準曲線と比較することにより、該試料中のＴＳＶの量を計算する工程、
   を含む、上記方法。

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