ES2717793T3 - Método para la detección específica del virus de la clásica peste porcina - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la detección específica del virus de la clásica peste porcina

Estado de la técnica

La peste porcina clásica (PPC) es una enfermedad infecciosa muy contagiosa y a menudo fatal en cerdos y jabalíes. Los brotes en industrias productoras de cerdos están controlados mediante medidas sanitarias y el sacrificio a gran escala de los cerdos infectados, por lo que causan importantes pérdidas económicas (Edwards, S., Fukusho, A , Lefevre, P.C., Lipowski, A., Pejsak, Z., Roehe, P., Westergaard, J., 2000. Classical swine fever: the global situation. Vet. Microbiol. 73 (2-3), 103-119; Fauquet C.M. et al. 2005. Virus Taxonomy, VIIIth Report of the International Committee of Taxonomy of Viruses. Elsevier I Academic press, 2005; Vandeputte, J. and Chappuis, G., 1999. Classical swine fever: the European experience and a guide for infected areas. Rev. Sci. Tech. 18 (3), 638-647). Los brotes de PPC tienen que ser reportados a la OIE (Oficina Internacional de Epizootia) y dentro de la Unión Europea (UE) la enfermedad se controla mediante una política de supresión sin vacuna profiláctica. A pesar de los continuos esfuerzos para su erradicación, los brotes de PPC todavía ocurren regularmente en cerdos europeos.

El virus de la PPC (“VPPC”) pertenece al género pestivirus de la familia Flaviviridae, y está estrechamente relacionado con el virus de la diarrea viral bovina (“VDVB”) y con el virus de la enfermedad de la frontera (“VEF”) (Fauquet, C.M. and Fargette, D., 2005. International Committee on Taxonomy of Viruses and the 3,142 unassigned species. Virol. J. 2, 64). Los hospedadores naturales del VDVB y VEF son el ganado bovino y el ovino, respectivamente, pero además ambos virus suelen infectar naturalmente a cerdos. Es importante diferenciar entre el VPPC y el VDVB o VEF.

Los pestivirus son pequeños virus de ARN monocatenario positivo con un genoma de aproximadamente 12.3 kb (Meyers, G. and Thiel, H.J., 1996. Molecular characterization of pestiviruses. Adv. Virus Res. 47, 53-118). Su genoma comprende un marco de lectura abierta codificando a una única poliproteína de 3898 aminoácidos que esta bordeada por una región no traducida en el extremo 5' (“UTR” del inglés untraslated región) y una UTR 3'-terminal. La poliproteína está procesada de manera co- y post-translacional por proteasas celulares y virales (Meyers, G. and Thiel, H.J., 1996. Molecular characterization of pestiviruses. Adv. Virus Res. 47, 53-118). Esta poliproteína se escinde en cuatro proteínas estructurales (C, ERNS, E1 y E2) y en siete proteínas no estructurales (Npro, p7, NS2, NS3, NS4A, NS5A y NS5B) (Tautz, N., Elbers, K., Stoll, D., Meyers, G., Thiel H.J., 1997. Serine protease of pestiviruses: determination of cleavage sites. J. Virol. 71(7), 5415-22).

Para un control y una prevención eficaz de la propagación del virus durante los brotes de la peste porcina clásica (PPC), es sumamente importante la detección rápida, sensible y fiable del VPPC. El VPPC puede ser detectado mediante protocolos de aislamiento del virus, mediante la identificación de antígenos por ELISA, mediante RT-PCR basada en gel y RT-PCR en tiempo real. (Aguero, M., Femandez, J., Romero, L.J., Zamora, M.J., Sanchez, C., Belak, S., Arias, M., Sanchez-Vizcaino, J.M., 2004). A highly sensitive and specific gel-based multiplex RTPCR assay for the simultaneous and differential diagnosis of African swine fever and Classical swine fever in clinical samples. Vet. Res. 35 (5), 551-563; Hergarten, G., Hurter, K.P., Hess, R.G., 2001. [Detection of infection with classical swine fever virus in wild boar: a comparison of different laboratory diagnostic methods.]. Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 108 (2), 51-54).

Se dispone de diferentes protocolos RT-PCR en tiempo que se usan en laboratorios de diagnosis. (Barlic-Maganja, D. and Grom, J., 2001. Highly sensitive one-tube RT-PCR and microplate hybridisation assay for the detection and for the discrimination of classical swine fever virus from other pestiviruses. J. Virol. Methods 95 (1-2), 101-110; Hoffmann, B., Beer, M., Schelp, C., Schirrmeier, H., Depner, K., 2005. Validation of a real-time RTPCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever. J. Virol. Methods 130 (1-2), 36-44; Hoffmann, B., Depner, K., Schirrmeier, H., Beer, M., 2006. A universal heterologous internal control system for duplex real-time RT -PCR assays used in a detection system for pestiviruses. J. Virol. Methods 136 (1-2), 200-209; Leifer, I., Depner, K., Biome, S., Le Potier, M.F., Le, D.M., Beer, M., Hoffmann, B., 2009a. Differentiation of C-strain "Riems" or CP7 E2alf vaccinated animals from animals infected by classical swine fever virus field strains using real-time RT-PCR. J. Virol. Methods 158 (1-2), 114- 122; Zhao, J.J., Cheng, D., Li, N., Sun, Y., Shi, Z., Zhu, Q.H., Tu, C., Tong, G.Z., Qiu, H.J., 2008. Evaluation of a multiplex real-time RT -PCR for quantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine of Classical swine fever virus. Vet. Microbiol. 126 (1-3), 1-10). En todos los protocolos establecidos se usa la región conservada 5'-UTR como molde para la detección de cepas de campo del VPPC. Recientemente, se ha descrito un protocolo especifico de la cepa-C que usa la región del genoma ERNS para la detección específica del virus de la vacuna de la cepa C “Riems” de PPC (Leifer, I., Depner, K., Biome, S., Le Potier, M.F., Le, D.M., Beer, M., Hoffmann, B., 2009a. Differentiation of C-strain "Riems" or CP7 E2alf vaccinated animals from animals infected by classical swine fever virus field strains using real-time RT-PCR. J. Virol. Methods 158 (1-2), 114­ 122). En situaciones con elevada producción de material de muestra positiva, la contaminación de amplicones por la propia RT-PCR en tiempo real o por otras aplicaciones RT-PCR centradas en la detección de la misma región genómica, como el análisis de secuencias, puede interferir en el diagnóstico de detección del VPPC. Por lo tanto, existe la necesidad de otro método específico para la detección del VPPC. El nuevo método ha de ser compatible con la detección de los genes de referencia, es decir, la detección de un gen de referencia no ha de interferir en el nuevo método de detección.

El estudio publicado por Haegeman et al. (Characterisation of the discrepancy between PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection". Journal of Virological Methods, vol. 136, no. 1-2, September 2006 (2006-09), pages 44-50) describe el mismo problema, pero como se detallará y se mostrará experimentalmente más adelante, no resuelve el problema.

WO 2011/151404 describe un método para determinar la presencia del virus de la peste porcina clásica (VPPC) en un sujeto. Tal método comprende la detección de la región NS5A de al menos un genoma VPPC en una muestra derivada de dicho sujeto.

Wong Min-Liang et al. (Molecular cloning and nucleotide sequence of 3'-terminal region of classical swine fever virus LPC vaccine strain" Virus Gene, vol. 17, no. 3, 1998, pages 213-218) describe dos ensayos por PCR para la detección de VPPC. Los objetivos para una PCR diagnostica son: una región de 1887 pares de bases, que contiene el gen completo amplificado de NS5A junto con la pareja de iniciadores P2/C4, y una región de 134 pares de bases, que contiene parte de la región 3' del gen amplificado NS5A y de la región 5' del gen amplificado NS5B junto con la pareja de iniciadores P3/C5. Sin embargo, tal y como se detallará más adelante y además se mostrará experimentalmente los estudios desarrollados por Wong Min-Liang et al. tampoco resolvieron el problema.

En la presente invención, los inventores descubrieron inesperadamente que el VPPC puede detectarse específicamente mediante la detección de la región NS5A o partes de la misma. De este modo, los inventores fueron capaces de detectar cepas del virus de la peste porcina clásica (VPPC) de las cuales se desconocía la región NS5A (ID. SEC. n° 37 a 41). Este ensayo no solo permite la detección de nuevos aislados, sino también la confirmación del genoma independiente del VPPC a través de la región 5'UTR y excluye falsos positivos causados por contaminación con amplicones 5' UTR.

En 2013 los resultados del ensayo interlaboratorio del laboratorio de referencia europeo para PPC (CRL, PPC, Universidad de Medicina de Veterinaria, Hannover) mostraron que el sistema dado de iniciador/sonda para la detección del VPPC fallaba en la detección de una cepa particular del virus, es decir, en la detección del genotipo PPC10472.1 aislado en Israel 2009. Por lo tanto, existe una necesidad de un nuevo ensayo que permita llevar a cabo dicha detección pero que al mismo tiempo no interfiera con la detección de otras cepas. Entonces, los inventores descubrieron que la actual secuencia iniciadora puede modificarse de manera compleja e inesperada, tal que el genotipo PPC 1047 2.1 (aislado en Israel 2009) pueda detectarse por primera vez y que esta secuencia iniciadora modificada pueda utilizarse sola o en combinación con los iniciadores actuales para proporcionar un método capaz de detectar simultáneamente nuevas cepas del virus de VPPC o de un conjunto ampliado de cepas del mismo.

Objeto de la invención

La presente invención describe un método para determinar la presencia del virus de la peste porcina clásica (VPPC) en un sujeto. Este método comprende:

Amplificación de la región NS5A de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC) en una muestra procedente de dicho sujeto y detección de la región NS5A;

en donde la detección de la región NS5A de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC) se atribuye a la presencia del virus de la peste porcina clásica (VPPV) en dicho sujeto, en donde la amplificación se realiza a través de un primer iniciador de amplificación que se hibrida mediante condiciones estrictas con la región de acuerdo a la ID. SEC. n° 45 y en donde el primer iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo a la ID. SEC. n° 44, o a una secuencia que es 80 % idéntica a la misma y comparte todos los primeros 18 nucleótidos, contados desde el extremo terminal 3' de la ID. SEC. n° 44.

Una “muestra” en el contexto de la invención puede ser cualquier tejido biológico y cualquier fluido tal como linfa, orina, fluido cerebral, sangre, saliva, suero, heces, plasma y sobrenadante de cultivo celular. Los tejidos pueden ser, por ejemplo, tejidos de órganos tales como el bazo, los riñones, las amígdalas, los ganglios linfáticos, el tejido epitelial, el tejido conectivo como el hueso o la sangre, el tejido muscular tal como el músculo liso o visceral y el músculo esquelético y el tejido nervioso. Un tejido puede ser además seleccionado del grupo constituido por la médula ósea, el cartílago, la piel, la mucosa y el pelo. La muestra se recoge del paciente o sujeto en que se determinará la presencia de VPPC de acuerdo a la invención. Cuando sea apropiado, como por ejemplo en el caso de muestras sólidas, puede ser necesario solubilizar la muestra, homogeneizarla, o extraerla con un disolvente para obtener una muestra líquida previo a su uso en la presente invención. Una muestra líquida puede ser una disolución o una suspensión. Las muestras líquidas pueden someterse a uno o más tratamientos, previo a su uso en la presente invención. Tales pre­ tratamientos incluyen, pero no se limitan a, dilución, filtración, centrifugación, concentración, sedimentación, precipitación, diálisis. Tales pre-tratamientos pueden también incluir la adición de una sustancia química o bioquímica a la disolución, tales como ácidos, bases, tampones, sales, disolventes, marcadores reactivos, detergentes, emulsificadores y agentes quelantes.

Por región NS5A se entiende cualquier región del genoma del virus de la peste porcina clásica que muestre una identidad secuencial de al menos 70 % con respecto a la región de los nucleótidos 8423 a 9913 de la ID. SEC. n° 1, preferiblemente una identidad secuencial de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad secuencial de al menos el 90 %, aún más preferiblemente una identidad secuencial de al menos el 95% (incluyendo, pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos el 96%, una identidad secuencial de al menos 97 %, una identidad secuencial de al menos 98 %, una identidad secuencial de al menos 99%, una identidad secuencial de al menos 99.5% y una identidad secuencial de 100 %). La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo por diferentes métodos y algoritmos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, utilizando el algoritmo matemático de Karlin y Alschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 58735877. Tal algoritmo está incorporado en el programa BLASTN y BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Las búsquedas de nucleótidos en BLAST se realizan con el programa BLASTN, puntuación = 100, longitud de la palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos que muestran una identidad secuencial dada con respecto a la región del genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC) descrito aquí. Para obtener alineamientos con espacios para propósitos comparativos se utiliza Gapped BLAST, tal y como describen Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25: 3389-3402. Cuando se utiliza los programas BLAST y Gapped BLAST, se aplican los parámetros definidos por defecto de los respectivos programas.

En un aspecto preferido, la región NS5A del genoma de al menos un virus de la peste porcina clásica es la región NS5A de al menos uno de los genomas de las cepas de los virus de la peste porcina clásica, las cuales son seleccionadas desde el grupo compuesto por las siguientes cepas conocidas: AY072924 "Paderbom", EU490425 "Thiverval", EU497410 "JL1(06)", AY775178 "Shimen/HVRI", AY646427 "IL/94/TWN", AY805221 "C/HVRI", DQ127910 "SWH", X8793 "Alfort/187", 104358 "Alfort/Tueb", X96550 "CAP", AY578688 "RUPPCPLUM", A Y578687 "BRESCIAX", A Y55439796 "TD", A Y663656 "China", AY259122 "Riems", AF326963 "Eystrup" (ID. SEC. n° 1), AY382481 "China vacc.", AY568569 "CH/01/TWN", AY367767 "GXWZ02", AF531433 "HCLV", AF407339 "strain 39", AF333000 "cF114", AF099102 "Russian vacc.", AF092448 "Shimen", AF091507 "HCLV", AF091661 "Brescia", U90951 "Alfort A19", U45478 "Glentorf', U45477 "Riems", así como las cepas recientemente identificadas y secuenciadas con la región NS5A PPCV Koslov, PPCV Hennef, PPCV Borken, PPCV Roesrath, y PPCV Bergen.

En un aspecto de la invención, la región NS5A es opcional y adicionalmente multiplex detectada mediante la detección de una o más de las secuencias seleccionadas del grupo formado por las ID. SEC. números 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41, o fragmentos de las mismas. En un aspecto adicional dicho fragmento comprende al menos una secuencia de acuerdo a la ID. SEC. n ° 2. Multiplex detectada, en el contexto de la presente invención, se refiere a mas de una reacción de amplificación simultanea teniendo lugar en un tubo.

Los métodos y medios para la detección específica de secuencias dentro de una muestra que comprende una mezcla de ácidos nucleicos son generalmente conocidos por expertos en la materia. Tal método puede comprender métodos de secuenciación (incluyendo el método de Sanger (Sanger, F. et al. (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Seiences US 74, 5463-5467), secuenciación aleatoria (shot-gun) y piro- secuenciación (Ronaghi, M (2001): Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Research 11, 3-11; Bankier AT (2001) Shotgun DNA sequencing. Methods Mol. Biol.

167, 89-100, GS FLX Pyrosequencing (Droege, M. Hill, B. (2008): The Genome Sequencer FLX Systemlonger reads, more applications, straight forward bioinformatics and more complete data sets. J. Biotechnol.

136, 3-1 0) y otras técnicas de secuenciación de siguiente generación como Illumina/Solexa, ABI/Solid (Morozova, 0., Marra, M.A. (2008): Applications of next-generation sequencing technologies in functional genomics. Genomics 92, 255-64), hibridacion “in situ”, Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), análisis cuantitativo por PCR (qPCR), PCR en tiempo-real, PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), RT-PCR en tiempo real, análisis microarray.

En un aspecto, la detección de la región NS5A comprende el uso de una muestra de ácido nucleico que se hibrida con la región NS5A de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC) y /o al ácido nucleico complementario de al menos una región NS5A de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VCPP).

De acuerdo a la presente invención, la definición de “ácido nucleico”, incluye ADN, tal como ADNc o ADN genómico, y ARN. Se entiende que el término “ARN” en el contexto de la presente invención comprende todas las formas de ARN incluyendo el ARNm, así como el ARN genómico (ARNg) de los virus. Preferiblemente, aquellos aspectos que aluden al “ARN” se refieren al ARNg del virus. En relación con el ADN, se aplican las reglas de la nomenclatura establecida por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada “IUPAC” (del inglés, International Union of Pure and Appliedd Chemistry): A es adenina, C es citosina, G es guanina. T es timina, R es G o A, Y es T o C, K es G o T, M es A o C, S es G o C, W es A o T, B es G o T o C (todos excepto A), H es A o C o T (todos excepto G), V es G o C o A (todos excepto T), N es A o G o C o T (cualquiera). Estos símbolos son además validos para el ARN, aunque U substituye a T (uracilo en lugar de timina).

De acuerdo a la presente invención, “sonda de ácido nucleico” es un oligonucleótido, un ácido nucleico o un fragmento del mismo que se hibrida específicamente con una secuencia objetivo de una molécula de ácido nucleico, por ejemplo, ARNg de un VPPC o ADNc o productos de amplificación del mismo. Por tanto, de acuerdo a la presente invención, una sonda de ácido nucleico es un oligonucleótido, un ácido nucleico o un fragmento del mismo, el cual es substancialmente complementario a una secuencia-objetivo específica. Sin embargo, además se pueden permitir desapareamientos de uno o mas nucleótidos, siempre que la sonda de ácido nucleico pueda hibridarse específicamente a la(s) secuencia(s) objetivo bajo condiciones estrictas. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico de la presente invención incluye oligonucleótidos que tienen una identidad secuencial con respecto a la secuencia-objetivo de al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, incluso más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 95 % (incluyendo, pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos 96 %, una identidad secuencial de al menos 99.5 % y una identidad secuencial de 100 %). Puede ser también deseable que la sonda de ácido nucleico se una a una variedad de secuencias que difieren en uno o más nucleótidos. Una manera de afrontar este problema es mediante el uso de sondas de ácidos nucleicos degeneradas. Dichas sondas de ácidos nucleicos degeneradas son mezclas de oligonucleótidos que difieren en una o más posiciones de su secuencia. Los oligonucleótidos de sondas de ácidos nucleicos degenerados pueden diferir en su longitud o pueden ser todos de la misma longitud. En un aspecto de la presente invención, la sonda de ácido nucleico es una sonda de ácido nucleico degenerada y se hibrida con regiones NS5A de esencialmente todos los genomas del virus de la peste porcina clásica (VCPP).

Uno de los posibles primeros iniciadores de amplificación que hibrida con una región de acuerdo a la ID. SEC. n° 45 bajo condiciones estrictas, es el iniciador de acuerdo a la ID. SEC. n° 44.

Como bien sabe una persona experta en la materia, hay cierto margen para modificar ligeramente los iniciadores sin afectar su afinidad de unión a una secuencia de ácido nucleico bajo determinadas condiciones experimentales. Por ejemplo, a veces es posible diseñar varios iniciadores que son desplazados por uno o varios nucleótidos a lo largo de la secuencia a la que se hibridan, sin cambiar significativamente la afinidad de unión. Además, es posible a veces acortar un iniciador que contiene nucleótidos que no se acoplan a una plantilla. Como resultado, a menudo hay varios iniciadores ligeramente diferentes que pueden unirse a una región particular y funcionar igualmente bien en una reacción de amplificación.

En el método de la invención, el primer iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo a la ID. SEC. n ° 44, o a una secuencia que es 80 % idéntica a la misma y comparte todos los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo terminal 3' de la ID. SEC. n° 44. Preferiblemente, el primer iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo a ID. SEC. n° 44, o una secuencia que es 85%, 90%, 95%, 98% idéntica a la misma y que comparte los primeros 18, o los primeros 22 nucleótidos contados desde el extremo terminal 3' de la ID. SEC. n ° 44. Idealmente, el iniciador contiene la ID. SEC. n° 44.

En un aspecto de la presente invención, las sondas de ácidos nucleicos (para el VPPC así como para ácidos nucleicos de referencia) tienen una longitud de 7 a 40 nucleótidos, preferiblemente de 12 a 30 nucleótidos, mas preferiblemente de 15 a 20 nucleótidos, aun mas preferiblemente la sonda de ácidos nucleico tiene una longitud de 16 nucleótidos.

En un aspecto adicional, la sonda de ácido nucleico se hibrida con un ácido nucleico que tiene una identidad secuencial de al menos el 70 % con respecto a la secuencia de los nucleótidos 8423 a 9913 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, preferiblemente una identidad secuencial de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad secuencial de al menos el 90 %, aun más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 95 % (incluyendo, pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos 96 %, una identidad secuencial de al menos 97 %, una identidad secuencial de al menos 98 %, una identidad secuencial de al menos 99 %, una identidad secuencial de al menos 99.5 % y una identidad secuencial de 100 % ).

En un aspecto preferido la sonda de ácido nucleico se hibrida con un ácido nucleico que tiene al menos una secuencia seleccionada del grupo que comprende las ID. SEC. números 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41 ( ver Figura 2) . En un aspecto adicional, la sonda de ácido nucleico se hibrida con un ácido nucleico que contiene cualquiera de las secuencias de acuerdo con las ID. SEC. números 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41.

En un aspecto adicional el fragmento de ácido nucleico se hibrida con un ácido nucleico que tiene una identidad secuencial de al menos 70 % con respecto a la secuencia de los nucleótidos 9400 a 9505 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, preferiblemente una identidad secuencial de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 90 %, aun más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 95 % (incluyendo, pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos 96 %, una identidad secuencial de al menos 97 %, una identidad secuencial de al menos 98 %, una identidad secuencial de al menos 99 %, una identidad secuencial de al menos 99.5 % y una identidad secuencial de 100 %).

En un aspecto adicional, el fragmento de ácido nucleico se hibrida con un ácido nucleico que tienen una identidad secuencial de al menos 70 % con respecto a la secuencia de los nucleótidos 9447 a 9467 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1, preferiblemente una identidad secuencial de al menos 80 %, más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 90 %, aun mas preferiblemente una identidad secuencial de al menos 95 % (incluyendo, pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos 96 %, una identidad secuencial de al menos 97 %, una identidad secuencial de al menos 98 %, una identidad secuencial de al menos 99 %, una identidad secuencial de al menos 99.5 % y una identidad secuencial de 100 %).

En un aspecto de la presente invención, la sonda de ácido nucleico tiene entre 16 y 40 nucleótidos y comprende la secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 2.

Como ha sido mencionado anteriormente, podría ser deseable que el virus de la peste porcina clásica (VCPP) se detectara específicamente. Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención, la sonda de ácido nucleico no se hibrida con el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) y no se hibrida con el virus de la enfermedad fronteriza (VEF) bajo condiciones estrictas.

La hibridación de una sonda de ácido nucleico con ADN o ARN desde una muestra indica la presencia del ADN o ARN pertinente en la muestra. Las condiciones de hibridación son conocidas para aquellas personas expertas en la materia y puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991. En un aspecto de la presente invención, la sonda de ácido nucleico se hibrida con la región NS5A de al menos un virus de la peste porcina clásica (VCPP) pero no con ácidos nucleicos de VDVB y VEF ni con ácidos nucleicos complementarios de los mismos bajo condiciones estrictas. Tales condiciones estrictas se definen como aquellas equivalentes a una hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 6X a 45 °C, seguida de un lavado en S^s C 0.2 X, SDS al 0.1 % a 65°C.

En un aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico no se hibrida con el virus de la diarrea viral bovina (VDVB) ni con el virus de la enfermedad fronteriza (VEF). La persona experta en la materia reconocerá que es deseable que el fragmento de ácido nucleico no se hibride con VDVB ni con VEF bajo condiciones estrictas. Sin embargo, la persona experta en la materia es consciente de que bajo determinadas circunstancias la hibridación inespecífica de ácidos nucleicos puede ocurrir bajo condiciones no estrictas y /o debidas a la alta concentración de ácidos nucleicos objetivo “inespecíficos”. Por lo tanto, de acuerdo a la invención, la sonda de ácido nucleico podría hibridarse inespecíficamente con el ácido nucleico de VDVB o VEF bajo condiciones desfavorables. Tales condiciones desfavorables pueden ser, por ejemplo, elevada concentración de ácidos nucleicos de VDVB y/o VEF que podrían ocurrir en condiciones por ejemplo de bajo de cultivo celular. Sin embargo, la sonda de ácido nucleico de acuerdo a la invención no se hibrida con ácidos nucleicos de VDVB o VEF bajo las condiciones del método de acuerdo a la invención, es decir, con concentraciones de ácidos nucleicos de VDVB y/o VEF como las que se encuentran en muestras de sujetos o con concentraciones de ácidos nucleicos de VDVB y/o VEF como las que se encuentran después de la amplificación de la región NS5A de un VPPC o fragmentos de la misma, con iniciadores específicos para la amplificación de VPPC de acuerdo con la presente invención.

Además se incluyen ácidos nucleicos que simulen moléculas conocidas en la materia tales como derivados sintéticos y semisintéticos del ADN o ARN y polímeros mezclados, en ambos sentidos y en sentido opuesto de las cadenas. Estos pueden contener bases nucleotídicas artificiales o derivatizadas adicionales, como se apreciará fácilmente por personas expertas en la materia. Tales ácidos nucleicos simulando moléculas o ácidos nucleicos derivados de acuerdo a la invención incluyen ácido nucleico peptídico (“PNA”, del inglés peptidic nucleic acid), ácido nucleico de fosoforotioato , ácido nucleico fosforoamidato, ácido 2'-O-metoxietil ribunucleico, ácido nucleico de morfolino, ácido nucleico de hexitol (“HNA”, del inglés hexitol nucleic acid), productos de conjugación de oligodesoxinucleótidos con ligandos 3' del surco menor (“MGB-ODN”, del inglés 3' minor groove oligodeoxynucleotide), y ácido nucleico bloqueado (“LNA”, del inglés locked nucleic acid) (véase por ejemplo Braasch and Corey, Chemistry & Biology 8, 1-7 (2001); y Kutyavin, Afonina, Mills et al., Nucleic Acid Research 28(2), 655-661 (2000)). El LnA es un derivado del Ar N en el cual el anillo de la ribosa está forzado por una unión metileno establecida entre el oxigeno 2' y el carbono 4'.

En un aspecto de la presente invención, la sonda de ácido nucleico comprende al menos una modificación para aumentar la estabilidad del híbrido sonda-objetivo. Tales modificaciones son conocidas por personas expertas en la materia. En un aspecto de la presente invención, los oligonucleótidos de la sonda de ácido nucleico comprenden al menos una modificación seleccionada desde el grupo que comprende los ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácido nucleico peptídico (PNA) y el ligando 3' del surco menor (MGB).

Para los fines de la presente invención, un ácido nucleico peptídico (PNA) es un tipo de ADN poliamídico de compuesto análogo con una cadena principal amídica en lugar de una cadena principal de azúcar-fosfato del ADN. Como consecuencia, ciertos componentes del ADN, tales como el fósforo, óxidos de fosforo o derivados de desoxirribosa no están presentes en PNAs. Como fue descrito por Nielsen et al., Science 254:1497 (1991); and Egholm et al., Nature 365:666 (1993), los PNAs se unen específicamente y se acoplan estrechamente a las cadenas complementarias de ADN y no son degradados por nucleasas. Además, son estables bajo condiciones ácidas y resistentes a las proteasas (Demidov et al. (1994), Biochem. Pharmacol., 48, 1310-1313). Su cadena principal electrostáticamente neutra aumenta la fuerza de unión al ADN complementario en comparación con la estabilidad del correspondiente dúplex ADN-ADN (Wittung et al. (1994), Nature 368, 561-563; Ray and Norden (2000), Faseb J, 14, 1041-1060).

Para los fines de la presente invención, los nucleósidos del ácido nucleico bloqueado (LNA) son una clase de compuestos análogos de ácido nucleico en los cuales el anillo de la ribosa está bloqueado por un puente metilénico que conecta el átomo de 2'-O y el átomo de 4'-C. Los nucleósidos LNA contienen las nucleobases comunes (T, C, G, A, U y mC) y son capaces de formar pares de bases de acuerdo a las reglas estándar de apareamiento de bases de Watson-Crick. Por lo tanto, cuando se incorporan en un oligonucleótido de ADN, el LNA se hibrida más rápidamente con un nucleótido complementario de la cadena y aumenta la estabilidad del dúplex resultante. Como resultado, la temperatura de fusión (Tm) del dúplex puede aumentar hasta 8 °C para una sustitución monomérica del LNA (véase, por ejemplo, Peterson, M. and Wengel, J. (2003) LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics. Trends Biotechnol. 21, 74-81).

Para los fines de la presente invención, una sonda de ligando 3' es una sonda de ácido nucleico que se une covalentemente a un producto de conjugación de unión al surco menor por el extremo 3' de dicha sonda de ácido nucleico. Los productos de conjugación de unión al surco menor son bien conocidos para personas expertas en la materia (véase Kutyavin, Afonina, Mills et al., Nucleic Acid Research 28(2), 655-661 (2000)). Pueden ser seleccionados de entre, por ejemplo DPI3 y CDPI3. Además, será fácilmente reconocido por una persona experta en la materia que los productos de conjugación de unión al surco menor se puedan unir directamente al extremo 3' de la sonda de ácido nucleico o indirectamente al extremo 3' a través de un conector. Tales conectores son bien conocidos por los expertos en la materia (véase Kutyavin, Afonina, Mills et al., Nucleic Acid Research 28(2), 655-661 (2000)). Ejemplos de tales conectores son los conectores de aminopropilo o alquilamina. En un aspecto, el producto de conjugación de unión al surco menor se une al surco menor formado por los de 5 a 6 pares de bases 3' terminales del dúplex de sonda de ácido nucleico/ sonda de ácido nucleico objetivo.

De hecho, las sondas de los ácidos nucleicos PNA, LNA o MGB-se unen mas fuerte al ADN que el ADN mismo. Por esta razón, los dúplex PNA/DNA, LNA/DNA y MGB-sonda de ácido nucleico/ADN se unen bajo un mayor rango de condiciones estrictas que los dúplex ADN/ADN, haciendo más sencillo llevar a cabo una hibridación múltiple. Se pueden usar fragmentos más pequeños que con el ADN debido a la fuerte unión. Además, es mas probable que se puedan determinar apareamientos de una sola base con la hibridación de PNA/DNA, LNA/DNA y MGB-sondas de ácido nucleico/ADN porque un solo desapareamiento en 15-monomeros de PNA/d Na , LNA/DNA y MGB-sondas de ácido nucleico/ADN reduce el punto de fusión (Tm) entre 8°-20° C, frente a los 4°-16°C en el caso del dúplex de 15 monómeros de ADN/ADN. Por lo tanto, se incrementa la estabilidad del híbrido sonda-objetivo. Esto además mejora la discriminación entre desapareamientos y apareamientos perfectos. El PNA, LNA y el MGB-sondas de ácido nucleico permiten también la hibridación de muestras de ADN en condiciones de bajo contenido en sal o de ausencia de sal. Como consecuencia, el ADN-objetivo tiene menos estructuras secundarias bajo condiciones de hibridación y es más accesible a las moléculas de sonda.

En un aspecto, la sonda de ácido nucleico comprende al menos 4 modificaciones para aumentar la estabilidad del híbrido sonda-objetivo, más preferiblemente al menos 5, aún más preferiblemente 7.

En un aspecto, la sonda de ácido nucleico tiene la secuencia ID. SEC. n° 2. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico tiene la secuencia de ID. SEC. n° 2 y tiene 7 LNAs. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico comprende al menos 4 modificaciones para aumentar la estabilidad del híbrido sonda-objetivo, en donde dichas modificaciones son en cuatro posiciones seleccionadas desde el grupo que comprende las posiciones 2, 4, 7, 9, 11, 13 y 15 de la ID. SEC. n° 2. En aún otro aspecto, la sonda de ácido nucleico comprende al menos 5 modificaciones para aumentar la estabilidad del híbrido sonda-objetivo, donde dichas modificaciones son en cinco posiciones seleccionadas desde el grupo que comprende las posiciones 2, 4, 7, 9, 11, 13 y 15 de la ID. SEC. n° 2. En un aspecto más preferido, el ácido nucleico tiene la secuencia de acuerdo a ID. SEC. n° 2 y tiene LNAs en las posiciones 2, 4, 7, 9, 11, 13 y 15.

En algunos casos, la concentración del virus de la peste porcina clásica (VPPC) presente en un sujeto puede encontrarse por debajo de los niveles detectables. En tal caso, es deseable amplificar el genoma de al menos un virus de la peste porcina clásica (VPPC) o fragmentos del mismo. Por tanto, en un aspecto de la presente invención, antes de la detección de la región NS5A de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC), se amplifica dicho genoma de al menos de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC). La persona experta en la materia reconocerá inequívocamente que la región a detectar debe ser parte de la parte amplificada de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC), es decir, la región en la cual la sonda de ácido nucleico se híbrida específicamente ha de ser parte de la región amplificada.

La amplificación del ácido nucleico se puede realizar mediante cualquiera de los métodos de amplificación conocidos en la materia, incluyendo, pero sin limitarse a, a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (“LCR”, del inglés ligase chain reaction) (tal como en Landegren et al., "A Ligase Mediated Gene Detection Technique," Science 241:1077-1080, 1988, o, en Wiedmann y otros autores., "Ligase Chain Reaction (LCR)-Overview and Applications," PCR Methods and Applications (Cold Spring Rarbor Labaratory Press, Cold Spring Rarbor Laboratory, NY, 1994) pp. S51-S64.)), el sistema de amplificación basado en transcripción (“TAS”, del inglés transcription-based amplification system), la secuenciación de ácidos nucleicos basada en amplificación (“NASBA”, del inglés nucleic acid sequence based amplification), la amplificación de circulo rodante (“RCA”, del inglés rolling cicle amplification), la amplificación mediada por transcripción (“TMA” del inglés transcription-mediated amplification), la autorreplicación de secuencias (“3SR”), amplificación isotérmica ( tal como en Walker et al., "Strand displacement amplification--an isothermal, in vitro DNA amplification technique," Nucleic Acids Res.

20(7):1691-6 (1992)) y la amplificación QI3. Se prefiere amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

En la presente invención, antes de la detección de la región NS5A del genoma de al menos un virus de la peste porcina clásica (CPPV), dicha región o fragmentos de la misma es amplificada.

En un aspecto, el producto de amplificación al menos comprende una secuencia que tiene una identidad secuencial de al menos 70 % con respecto a la región de los nucleótidos 9447 a 9462 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, preferiblemente la región tiene una identidad secuencial superior a 80 %, mas preferiblemente superior a 90 %, aun mas preferiblemente superior a 95 % (incluyendo, pero sin limitarse a, superior a 96%, superior a 97%, superior a 98%, superior a 99%, superior a 99.5% y de 100 % de la secuencia identidad. En un aspecto preferido, la región amplificada comprende al menos la secuencia de acuerdo a la ID. SEC. n° 2. En un aspecto preferido, el producto de amplificación tiene una identidad secuencial de al menos 70 % con respecto a los nucleótidos 8423 a 9913 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, preferiblemente dicha región tiene una identidad secuencial de al menos 80% con respecto a los nucleótidos 9400 a 9505 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 90%, incluso mas preferiblemente una identidad secuencial de 95% (incluyendo pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos 96%, una identidad secuencial de al menos 97%, una identidad secuencial de al menos 98%, una identidad secuencial de al menos 99%, una identidad secuencial de al menos 99.5 % y una identidad secuencial de 100%).

En otro aspecto, el producto de amplificación tiene una identidad secuencial de al menos 70 % con respecto a los nucleótidos 9388 a 9507 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, preferiblemente una identidad secuencial de al menos 80 % con respecto a los nucleótidos 9400 a 9505 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 90%, aun más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 95% (incluyendo, pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos 96%, una identidad secuencial de al menos 97%, una identidad secuencial de al menos 98%, una identidad secuencial de al menos 99%, una identidad secuencial de al menos 99,5% y una identidad secuencial de 100%).

En otro aspecto, el producto de amplificación tiene una identidad secuencial de al menos 70 % con respecto a los nucleótidos 9400 a 9505 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, preferiblemente dicha región tiene una identidad secuencial de al menos 80% con respecto a los nucleótidos 9400 a 9505 de acuerdo a la ID. SEC. n° 1, más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 90%, aun más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 95% (incluyendo, pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos 96%, una identidad secuencial de al menos 97%, una identidad secuencial de al menos 98%, una identidad secuencial de al menos 99%, una identidad secuencial de al menos 99,5% y una identidad secuencial de 100%).

En otro aspecto, al menos una de las regiones seleccionadas del grupo de secuencias que comprende las ID. SEC. números 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41 es amplificada previo a la detección. En otro aspecto, al menos una región amplificada comprende al menos una secuencia seleccionada desde el grupo de secuencias de los nucleótidos 13 a 118 de cualquiera de las secuencias de acuerdo con las ID. SEC. números 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,o 40, o los nucleótidos 1 a 107 de la ID. SEC. n° 41.

En un aspecto, el producto de amplificación tiene una longitud de 20 a 1500 nucleótidos, preferiblemente de 40 a 1000 nucleótidos, mas preferiblemente de 50 a 500 nucleótidos, incluso mas preferiblemente de 80 a 150 nucleótidos, lo más preferiblemente el producto de amplificación tiene una longitud de 90 a 120 nucleótidos.

La persona experta en la materia sabe como diseñar y fabricar iniciadores adecuados para la amplificación anteriormente descrita, es decir, para los iniciadores oligonucleotídicos. Los iniciadores oligonucleotídicos se pueden preparar usando cualquier método adecuado, tal como por ejemplo, los métodos fosfotriéster y fosfodiéster o aspectos automatizados de los mismos. En uno de tales aspectos automatizados, dietilfosforamiditas se usan como materiales de partida y pueden ser sintetizadas como describió Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22:1859-1862 (1981). En la patente de EE.UU. n° 4,458,006 se describe un método para sintetizar oligonucleótidos sobre un soporte solido modificado. Es además posible usar un iniciador el cual ha sido aislado de una fuente biológica (tal como una digestión con endonucleasa de restricción).

En otro aspecto más, al menos un iniciador de amplificación de VPPC es adecuado para amplificar una región de un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC), en donde el producto de amplificación tiene una identidad secuencial de al menos 70 % con respecto a cualquiera de las secuencias seleccionadas desde el grupo que comprende los nucleótidos 8423 a 9913 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1, y los nucleótidos 9388 a 9507 de acuerdo con la secuencia ID. SEC. n° 1, y los nucleótidos 9400 a 9505 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1, y los nucleótidos 9447 a 9462 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1. Preferiblemente, dicho ácido nucleico tiene una identidad secuencial de al menos 80 % con respecto a cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que comprende los nucleótidos 8423 a 9913 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1, y los nucleótidos 9388 a 9507 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1, y los nucleótidos 9400 a 9505 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1, y los nucleótidos 9447 a 9468 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1, más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 90 %, aún más preferiblemente una identidad secuencial de al menos 95% (incluyendo, pero sin limitarse a, una identidad secuencial de al menos 96%, una identidad secuencial de al menos 97 %, una identidad secuencial de al menos 98%, una secuencia identidad de al menos 99%, una identidad secuencial de al menos 99.5 %, y una identidad secuencial de 100%).

Los iniciadores de amplificación preferidos tienen una longitud de 15-100, más preferiblemente de aproximadamente 20-50, lo más preferiblemente de 20-40, bases. También hay que tener en cuenta la posibilidad de diseñar un iniciador degenerado con el objeto de permitir la hibridación del iniciador con una diversidad de secuencias que difieren en una o más posiciones. La persona experta en la materia reconoce fácilmente que en el método de acuerdo a la presente invención, se puede usar cualquier iniciador que sea adecuado para la amplificación de los fragmentos del genoma de la peste porcina clásica (VCPP) como se ha descrito anteriormente.

En un aspecto preferido descrito aquí,

Los iniciadores de la amplificación (iniciadores de la amplificación del VPPC) comprenden un extremo 3' que comprende al menos los 6 últimos nucleótidos de acuerdo con la secuencia de ID. SEC n° 3, 44 o ID. SEC. n° 4, respectivamente, preferiblemente al menos los últimos 8 nucleótidos, mas preferiblemente al menos los últimos 10 nucleótidos. En otro aspecto preferido, los extremos 3' de al menos dos iniciadores de amplificación consisten en la secuencia de acuerdo con la secuencia ID. SEC. n° 3, 44 o la ID. SEC n° 4, respectivamente. En otro aspecto preferido, al menos dos iniciadores de amplificación de VPPC tienen la secuencia de acuerdo con la ID. SEC n° 3, 44 o la ID. SEC. n° 4. Sin embargo, en un aspecto no restrictivo de la presente invención, la amplificación se lleva a cabo usando iniciadores de amplificación que tienen las secuencias de ID. SEC. n° 44 y la ID. SEC. n° 4.

Idealmente, la amplificación se realiza usando un segundo iniciador de amplificación que comprende una secuencia de acuerdo a la ID. SEC n° 4, o una secuencia que es 80 %, 85 %, 90 %, 95%, 98% idéntica a la misma y comparte una, dos, tres o todos de los 10 primeros, los 12 primeros o los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 4. Esto se realiza idealmente cuando el primer iniciador es la ID. SEC. n° 44.

En un aspecto, una mezcla se usa utilizando dos iniciadores en sentido directo, es decir, ID. SEC. n 03 e ID. SEC. n° 44 y un iniciador en sentido inverso, es decir, ID. SEC. n° 4.

En algunos casos podría ser necesario no solo determinar la presencia de un virus de la peste porcina clásica (VPPC) sino además verificar el aislamiento de los ácidos nucleicos de la muestra o determinar la cantidad relativa de virus de la peste porcina clásica en un sujeto o una muestra de un sujeto, respectivamente. Para un diagnóstico de rutina es de suma importancia la integración de controles que verifiquen la etapa del aislamiento del ARN así como la RT-PCR. En 2005, se describió un ensayo de RT-PCR múltiplex en tiempo real con un control interno heterólogo ((Hoffmann, B., Depner, K., Schirrmeier, H., Beer, M., 2006. A universal heterologous internal control system for duplex real-time RT -PCR assays used in a detection system for pestiviruses. J. Virol. Methods 136 (1-2), 200-209). Sin embargo, para analizar el estado de una muestra, se prefiere la amplificación de ácidos nucleicos desde los controles internos, por ejemplo, los genes domésticos. Por lo tanto, en un aspecto preferido de la presente invención se incluyen ácidos nucleicos de referencia. Tal ácido nucleico de referencia puede adicionarse externamente, o ácidos nucleicos contenidos en la muestra del sujeto pueden servir como un ácido nucleico de referencia. En el último caso, se prefieren los ácidos nucleicos de los llamados genes domésticos, ya que ellos son probablemente los mas abundantes en todas las muestras y su expresión es substancialmente constante; y por tanto son muy adecuados como ácidos nucleicos de referencia. Como el genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC) se constituye de ARN, los ácidos nucleicos de referencia son constituidos preferiblemente de ARN, por ejemplo, el ARNm de dichos genes domésticos. Sin embargo, los ácidos nucleicos de referencia pueden además estar constituidos de ADN o cualquier otro ácido nucleico descrito anteriormente. En otro aspecto, el ácido nucleico de referencia es un ARNm de uno o mas genes seleccionados del grupo constituido por S-actina, gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), ARNr 18S y S 2 microglobulina. En otro aspecto preferido de la presente invención, dicho ácido nucleico de referencia es el ARNm de S-actina (ID. SEC. n° 42).

Para la detección del ácido nucleico de referencia podrían ser necesarias sondas de ácido nucleicos de referencia y/o iniciadores de amplificación de referencia. La persona experta en la materia sabe como diseñar iniciadores y/o sondas adecuados. Diferentes regiones del ácido nucleico de referencia pueden servir para la detección y los expertos en la materia pueden diseñar los respectivos iniciadores de la amplificación de referencia y/o sondas de ácido nucleico de referencia. En un aspecto preferido, el ARNm de S-actina se determina mediante el uso de los iniciadores de amplificación de referencia, dichos iniciadores de amplificación de referencia comprenden extremos 3' que consisten en al menos los 6 últimos nucleótidos de las secuencias de acuerdo con la ID. SEC. n° 5 y la ID. SEC. n° 6, respectivamente. En un aspecto preferido, los iniciadores de la amplificación de referencia tienen extremos 3' que consisten en las secuencias de acuerdo con la ID. SEC. n° 5 y la ID. SEC n° 6, respectivamente. En un aspecto los iniciadores de amplificación de referencia comprenden la secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 7 y tienen una longitud entre 5 y 40 nucleótidos. En un aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico de referencia tiene la secuencia de acuerdo con la ID. SEC n° 7.

En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico y/o uno o más iniciadores de amplificación del VPPC y/o sondas de ácido nucleico de referencia y/o iniciadores de amplificación de referencia pueden estar marcados con colorantes fluorescentes. En el contexto de la presente invención, los colorantes fluorescentes pueden ser FAM (5-o- 6-carboxyfluoresceina), VIC, NED, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (“FITC”, del inglés fluorescein isothiocyanate), IRD-700/800, colorantes de cianina, también como CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, xanteno, 6-carboxi-2', 4', 7', 4, 7-hexaclorofluoresceina (HEX), TET, 6-carboxi-4',5'- dicloro-2', 7'-dimetodifluoresceina (JOE), N,N,N',N'- tetrametil-6 carboxirrodamina (TAMRA), 6- carboxi-X-rodamina (ROX), 5-Carboxirodamina-6G (R6G5), 6-carboxirodamina-6G (RG6), Rodamina, Verde Rodamina, Rojo Rodamina, Rodamina 110, colorantes BODIPY, tales como BODIPY TMR, Verde Oregon, cumarinas tales como umbeliferona, benzamidas tales como Hoechst 33258, fenantridinas tales como Rojo Texas, amarillo Yakima, Alexa Fluor, PET, bromuro de etidio, colorantes de acridinio, colorantes de carbazol, colorantes de fenoxazina, colorantes de porfirina, colorantes de polimetina y similares.

Los expertos en la materia conocen diferentes métodos para la amplificación y/o la detección de ácidos nucleicos. Se puede aplicar cualquier método mediante el cual pueden ser detectados específicamente ácidos nucleicos, es decir, detectar secuencias especificas en dicho ácido nucleico. En un aspecto preferido de la presente invención, la detección y/o amplificación de la región NS5A y/ del ácido nucleico de referencia se realiza por uno o más de los métodos seleccionados del grupo que consiste en secuenciación (incluyendo el método Sanger, secuenciación aleatoria y la piro-secuenciación), hibridación “in situ”, Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR cuantitativa (qPCR), PCR en tiempo real, PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), RT-PCR en tiempo real, análisis de microarray.

La PCR en tiempo real es un método para amplificar y cuantificar simultáneamente ácidos nucleicos usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR con transcripción inversa (RT-PCR) en tiempo real es un método de PCR en tiempo real que además comprende una transcripción inversa del ARN en ADN, por ejemplo del ARNm a ADNc. En los métodos qPCR, el ácido nucleico amplificado se cuantifica tal y como se acumula. Típicamente, para la detección y/o cuantificación en los métodos basados en PCR se usan colorantes fluorescentes que se intercalan en la doble cadena de ADN (por ejemplo, bromuro de etidio o SYBR® Green I) o sondas de ácido nucleico marcadas (sondas informadoras) que emiten fluorescencia cuando se hibridan con un ácido nucleico complementario (por ejemplo, el ADN que se acumula). Particularmente, como sondas informadoras se pueden usar iniciadores fluorogénicos, sondas de hibridación (por ejemplo, sondas LightCycler (Roche)), sondas de hidrolisis (por ejemplo sondas TaqMan (Roche)), o sondas en horquilla, tales como balizas moleculares, iniciadores Scorpion (DxS), iniciadores Sunrise (Oncor), iniciadores LUX (Invitrogen), iniciadores Amplifluors (Intergen) o similares. De acuerdo con la presente invención, los iniciadores o sondas fluorogénicos pueden ser, por ejemplo, iniciadores o sondas a los que se han fijado los colorantes fluorescentes, por ejemplo covalentemente fijados. Tales colorantes fluorescentes pueden ser, por ejemplo. FAM (5-or 6-carboxifluoresceina), VIC, NED, fluoresceina, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, Verde Oregon, Verde Rodamina, Rojo Rodamina, Rojo Texas, Amarillo Yakima, Alexa Fluor, Azul PET Biosearch Blue ™, Marine Blue®, Bothell Blue®, CAL® Fluor Gold, Fluor Red CAL ® 610, Quasar™ 670, LightCycler Red640®, Quasar™ 705, LightCycler Red705® y similares. Sondas informadoras particulares pueden comprender además supresores de fluorescencia.

En aspectos particulares de la invención, la polimerasa usada para los métodos basados en PCR es una polimerasa de un organismo termófilo o una polimerasa termoestable o es seleccionada del grupo que consiste en ADN polimerasa Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa Thermus acquaticus (Taq), ADN polimerasa Thermatoga marítima (Tima), ADN polimerasa Thermococcus litoralis (Tli) Pyrococcus furiosus (Pfu) ADN polimerasa, ADN polimerasa Pyrococcus woesei (Pwo), ADN polimerasa Pyrococcus kodakaraensis KOD, ADN polimerasa Thermus filiformis (Tfi), ADN polimerasa Sulfolobus solfataricus Dpo4, ADN polimerasa Thermus pacificus (Tpac), ADN polimerasa Thermus eggertssonii (Teg), ADN polimerasa Thermus brockianus (Tbr) y ADN polimerasa Thermus flavus (Tfl).

Los hospedadores del virus de la clásica peste porcina son los cerdos. Sin embargo, podría ser necesario determinar la presencia del virus en otras especies, como por ejemplo en seres humanos que están en contacto con cerdos. Por tanto, en un aspecto, el sujeto de acuerdo a la presente invención es un mamífero, por ejemplo, un ser humano, una vaca, un gato, un perro, un caballo o un cerdo. En un aspecto preferido el sujeto es un cerdo.

La presente invención se refiere también a un kit para determinar la presencia del virus de la peste porcina clásica en un sujeto, que comprende:

Un primer iniciador de amplificación que se hibrida bajo condiciones estrictas con una región de la ID. SEC. n° 45, en donde el primer iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 44, o una secuencia que es 80% idéntica a la misma y comparte todos los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 44, y un segundo iniciador de amplificación que comprende una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 4, o una secuencia que es 80% idéntica a la misma y comparte uno, dos, tres o los 10 primeros, los 12 primeros o los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 4.

Opcionalmente, el kit puede además comprender al menos un iniciador de la amplificación del genoma de un virus de la peste porcina clásica (iniciador de amplificación del VPPC). En un aspecto preferido, el kit comprende al menos un iniciador de amplificación del VPPC para la amplificación del genoma de un VPPC o partes del mismo. Adicional y opcionalmente, el kit puede comprender sondas de ácido nucleico de referencia e iniciadores de amplificación de referencia de acuerdo a la presente invención.

El kit además comprende:

- Un tercer iniciador de amplificación que consiste en una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 3, o 80% idéntica de la misma y que comparte uno, dos, tres o los 10 primeros, los 12 primeros y los 18 primeros nucleótidos desde el extremo 3' con el nucleótido correspondiente de la ID. SEC. n° 3 y/o - Una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia ID. SEC. n02.

En un aspecto, el kit comprende:

- Un tercer iniciador de amplificación que consiste en una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 3, o el 80% idéntica de la misma y comparte uno, dos, tres o los 10 primeros, los 12 primeros y los 18 primeros nucleótidos desde el extremo 3' con el nucleótido correspondiente de la ID. SEC. n° 3 y/o - Una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia ID. SEC. n° 2.

En otro aspecto, el primer iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 44, o una secuencia que es 85%, 90%, 95%, 98% idéntica a la misma y comparte los 18 primeros, o los 22 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 44. En otro aspecto mas preferido, el primer iniciador de amplificación comprende los 22 primeros nucleótidos contados desde el extremo 3' de la ^{ID. SEC. n° 44. Idealmente, el iniciador contiene la} iD. ^{SEC. n° 44.}

La sonda de ácido nucleico, el iniciador de amplificación del VPPC, las sondas de ácido nucleico de referencia y los iniciadores de amplificación de referencia del kit contienen los mismos aspectos y características que se han subrayado anteriormente.

En un aspecto, el kit es un kit para llevar a cabo una RT-PCR en tiempo real. Por lo tanto, en este aspecto, el kit de acuerdo con la presente invención comprende reactivos para llevar a cabo una RT-PCR en tiempo real. Tales reactivos incluyen tampones, desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTPS) y enzimas (tales como polimerasas) para realizar la RT-PCR en tiempo real.

El término “polimerasa” se refiere a una enzima que sintetiza cadenas de ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) desde ribonucleósidos-trifosfatos o desoxinucleósidos-trifosfatos.

Una variedad de polipéptidos con actividad polimerasa se usan de acuerdo a la presente invención. Entre esos polipéptidos se incluyen enzimas tales como polimerasas de ácido nucleico (incluyendo las ADN polimerasas y las ARN polimerasas). Tales polimerasas incluyen, pero no se limita a, ADN polimerasa de

Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne), ADN polimerasa de Thermotoga maritima (Tima), ADN polimerasa de Thermococcus

litoralis (Tli or VENT™.), ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu), ADN polimerasa de DEEPVENT™

DNA polimerasa, ADN polimerasa de Pyrococcus woosii (Pwo), ADN polimerasa de Pyrococcus sp KDD2

(KOD), ADN polimerasa de Bacillus sterothermophilus (Bst), ADN polimerasa de Bacillus caldophilus (Bca),

ADN polimerasa de Sulfolobus ácidocaldarius (Sac), ADN polimerasa de Thermus eggertssonii (Teg), ADN polimerasa de Thermoplasma ácidophilum (Tac), ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl/Tub), ADN polimerasa de Thermus ruber (Tru), ADN polimerasa de Thermus brockianus (DYNAZYME), ADN polimerasa

de Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth), ADN polimerasa de micobacteria (Mtb, Mlep ), y mutantes,

variantes y derivados de las mismas. ARN polimerasas tales como T3, T5 y SP6 y mutantes, variantes y

derivados de los mismos pueden ser también usados de acuerdo con la presente invención.

Las ácido nucleico polimerasas utilizadas en la presente invención pueden ser mesofílicas o termofílicas, y

son preferiblemente termofílicas. Las ADN polimerasas mesofílicas preferidas incluyen ADN polimerasa de

T7, ADN polimerasa de T5, el fragmento de Klenow de ADN polimerasa, ADN polimerasa III y similares. Las

ADN polimerasas termoestables preferidas que se pueden usar en los métodos y kits de acuerdo a la

presente invención incluyen las ADN polimerasas Teg, Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, el fragmento Stoffel,

VENT™ y DEEPVENT™, y mutantes, variantes y derivados de las mismas (Patente de EE.UU. n° 5,436,149;

Patente de EE.UU. n° 4,889,818; Patente de EE.UU. n° .4,965,188; Patente de EE.UU. n° 5,07 Patente de EE.UU. n° 5,614,365; Patente de EE.UU. n° 5,374,553; Patente de EE.UU. n° 5,27 Patente de EE.UU. n° 5,047,342; Patente de EE.UU. n° 5,512,462; WO 92/06188; WO 92/0620 96/10640; Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993);

Flaman, J.-M, et al., Nucl. Acids Res. 22(15):3259- 3260 (1994)). Ejemplos de las AdN polimerasas que

carecen substancialmente de acitividad 3' exonucleasa incluyen, pero no se limitan a, las ADN polimerasas

Taq, Tneexo-, Tmaexo-, Pfuexo-, Pwoexo- y Tth, y mutantes, variantes y derivados de las mismas.

Los polipéptidos con actividad transcriptasa inversa para el uso en la invención incluyen cualquier polipéptido

que tiene actividad transcriptasa inversa. Tales enzimas incluyen, aunque no se limitan a, transcriptasa

inversa retrovirica, transcriptasa inversa de retrotrasposon, transcriptasa inversa de hepatitis B, transcriptasas

inversa para el virus del mosaico de la coliflor, transcriptasa inversa bacteriana, ADN polimerasa Tth, ADN polimerasa Taq (Saiki, R. K., et al., Science 239:487-491 (1988); U.S. Pat. Nos. 4,889,818 and 4,965,188),

ADN polimerasa Tne (Documento WO 96/10640), ADN polimerasa Tma (Patente de EE.UU. n° 5,374,553) y mutantes, variantes o derivados de las mismas (véase por ejemplo, la solicitud de patente EE.UU en tramitación números 08/706,702 and 08/706,706, de A. John Hughes y Deb K. Chattedee, ampras presentadas el 9 de Septiembre de 1996). Las enzimas preferidas para uso en la presente invención incluyen

aquellas que tienen una actividad RNasa H reducidas o sustancialmente reducida. Por una enzima “con

actividad RNasa H sustancialmente reducida “ se entiende que la encima tiene menos de aproximadamente

el 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 15%, el 10% o el 5%, y más preferiblemente

menos de aproximadamente el 2%” de la actividad RNasa H del correspondiente tipo silvestre o de la enzima

RNasa H+ tales como el tipo silvestre del virus de la leucemia murina de Moloney (“M-MLV” del inglés

Moloney murine leukemia virus), transcriptasas inversas del virus de la mieloblastosis aviar (“AMV” del inglés

avian myeloblastosis virus) o del virus del sarcoma de Rous (“RSV” del ingles Rous sarcoma virus). La

actividad RNasa H de cualquier enzima puede determinarse mediante una variedad de ensayos, tales como

los descritos, por ejemplo, en la patente EE.UU. n° 5,244,797, en Kotewicz, M. L., et al., Nucl. Acids Res.

16:265 (1988) y en Gerard, G. F., et al., FOCUS 14(5):91 (1992). Tales polipéptidos particularmente

preferidos para usarse en la invención incluyen, pero sin limitarse a, la transcriptasa inversa H de M-MLV, la transcriptasa inversa H- de RSV, la transcriptasa inversa H-de AMV, la transcriptasa inversa H‘ del virus

asociado a Rous (“RVA” del inglés Rous-associated virus) , la transcriptasa inversa H- del virus asociado a la mieloblastosis (“MAV” del inglés myeloblastosis-associated virus) y transcriptasa inversa H- del HIV. Sin

embargo, una persona experta en la materia entenderá que cualquier enzima capaz de producir una molécula

de ADN desde una molécula de ácido ribonucleico (es decir, teniendo actividad transcriptasa inversa) y que

tenga una actividad RNasa H substancialmente reducida puede ser equivalentemente usada en las composiciones, métodos y kits de la invención.

Las ADN y ARN polimerasas para uso en la invención se pueden obtener comercialmente, por ejemplo, de

QIAGEN (Hilden, Alemania), Life Technologies, Inc. (Rockville, Md.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) o

ROCHE Biochemicals. Los polipéptidos que tengan actividad inversa transcriptasa para uso en la invención

se pueden obtener comercialmente, por ejemplo, desde QIAGEN (Hilden, Alemania), Life Technologies, Inc.

(Rockville, Md.), Pharmacia (Piscataway, N. J.), Sigma (Saint Louis, Mo.) o ROCHE (Penzberg, Alemania).

Alternativamente, los polipéptidos con actividad transcriptasa inversa pueden ser aislados de sus fuentes

víricas o bacterianas naturales de acuerdo a los procedimientos estándar para aislar y purificar proteínas naturales, los cuales son bien conocidos por una persona experta en la materia (véase, por ejemplo, Houts,

G. E., et al., J. Virol. 29:517 (1979)). Además, los polipéptidos con actividad transcriptasa pueden prepararse

mediante técnicas de ADN recombinante, las cuales resultan familiares para una persona experta en la

materia (véase por ejemplo Kotewicz, M. L., et al., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988); Soltis, D. A., and Skalka,

A. M., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:3372-3376 (1988)).

En la presente invención, el término “dNTP” se refiere a desoxirribonucleósidos trifosfatos. Algunos ejemplos no restrictivos de tales dNTPs son dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dUTP, los cuales pueden además presentarse en la forma de derivados marcados, por ejemplo, mediante un marcador fluorescente, un marcador radioactivo o un marcador biotina. También se incluyen en dicho termino dNTPs modificados con bases nucleótidos, en donde las bases nucleotídicas son por ejemplo, hypoxantina, xantina, 7-metilguanina, inosina, xantinosina, 7-metilguanosina, 5,6-dihidrouracilo, 5-metilcitosina, pseudouridina, dihidrouridina, 5-metilcitidina. También se incluyen en la presente invención los ddNTPS de las moléculas descritas anteriormente.

En un aspecto, el kit de acuerdo con la presente invención incluye un ácido nucleico como control positivo para probar la eficiencia de los iniciadores de amplificación del virus VPPC y de las sondas de ácido nucleico. En un aspecto, dicho ácido nucleico usado como control positivo comprende una primera secuencia ligante de iniciador, una segunda secuencia ligante de iniciador y una secuencia ligante de sonda, en donde la primera y la segunda secuencia ligante de iniciador son seleccionadas y orientadas de manera que la secuencia localizada entre medias se pueda amplificar mediante al menos dos iniciadores de la amplificación del virus VPPC; en donde la secuencia ligante de sonda está constituida por una parte de la región DS5A de un virus de la peste porcina clásica (VPPC) con la que se hibrida dicha sonda de ácido nucleico; y en donde la secuencia ligante de sonda se encuentra entre la primera y la segunda secuencias ligantes de iniciador. En un aspecto preferido de la presente invención, el ácido nucleico usado como control positivo es ARN o ADN.

En un aspecto preferido, el ácido nucleico usado como control positivo contenido en el kit de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia de iniciación de la transcripción. En el contexto de la presente invención una “secuencia de iniciación de la transcripción” es una secuencia que promueve la transcripción (inversa) desde ADN a ARN o desde ARN a ADN mediante una enzima, respectivamente. En un aspecto de la presente invención, el ácido nucleico usado como control positivo contenido en el kit de acuerdo con la presente invención consiste en ADN y se transcribe a ARN. El ARN transcrito se usa entonces como un control positivo en la reacción RT-PCR en tiempo real. Por tanto, en un aspecto preferido el ácido nucleico usado como control positivo contenido en el kit de acuerdo con la presente invención está constituido por ADN y comprende una secuencia de iniciación de la transcripción que promueve la transcripción desde ADN a ARN. Las secuencias de iniciación de la transcripción son bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Los promotores génicos son ejemplos de tales secuencias de iniciación de la transcripción. Los promotores génicos contienen secuencias de ADN especificas y/o elementos de respuesta los cuales proporcionan un sitio ligante para las ARN polimerasas y/o factores de transcripción que recluta la ARN polimerasa. En un aspecto preferido, la secuencia de iniciación de la transcripción es seleccionada del grupo formado por el promotor T7, el promotor T3 y el promotor SP6. La secuencia de iniciación de la transcripción está situada y dispuesta dentro del ácido nucleico usado como control positivo o de manera que después de la transcripción o de la transcripción inversa con una enzima, se pueda obtener un ácido nucleico usado como control positivo transcrito o inversamente transcrito, el cual comprende dicha primera secuencia ligante de iniciador, dicha segunda secuencia ligante de iniciador y dicha secuencia ligante de sonda, en donde la primera y la segunda secuencias ligantes de iniciador se seleccionan y se orientan de manera que la secuencia que se encuentra entre medias pueda ser amplificada por al menos dos iniciadores de la amplificación de un virus VPPC; en donde la secuencia ligante de sonda comprende una parte de la región NS5A del virus de la peste porcina clásica (VPPC) con la que se hibrida dicha sonda de ácido nucleico; y en donde la secuencia ligante de sonda se sitúa entre medias de la primera y la segunda secuencia que comprende la secuencia ligante de sonda.

En un aspecto preferido de la presente invención, el ácido nucleico usado como control positivo comprende la secuencia de ID. SEC. n° 43. En un aspecto adicional el ácido nucleico usado como control positivo tiene la secuencia de ID. SEC. n° 43.

La presente invención también se refiere a un iniciador de amplificación que hibrida bajo condiciones estrictas con una región de la ID. SEC. n° 45, en donde el iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 44, o a una secuencia que es 80% idéntica a la misma y que comparte los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 44.

Como se ha destacado anteriormente, los inventores fueron capaces de identificar nuevas y desconocidas cepas del virus de la peste porcina clásica (VPPC) usando el método de acuerdo con la presente invención. En las ID. SEC. números 37 a 41 se proporcionan las regiones preferidas de dichos nuevos y desconocidos virus de la peste porcina clásica (VPPC).

Tabla 1: Secuencias empleadas

*Los nucleótidos de las posiciones 2, 4, 7, 9, 11, 13 y 15 de la ID. SEC. n° 2 están modificados en un aspecto preferido de la presente invención, por ejemplo, mediante el LNA.

Las secuencias de regiones NS5A recién identificadas de cepas del VPPC. Las secuencias mostradas muestran la región de dichas nuevas cepas del VPPC las cuales muestran identidad con respecto a los nucleótidos 9388 a 9507 de acuerdo con la ID. SEC. n° 1; véase la Figura 2.

Descripción detallada de la invención

Ejemplos

Muestras

Las cepas VEF, VDVB y VPPC se obtuvieron desde los respectivos laboratorios de referencia nacionales alemanes. Las cepas del VPPC se cultivaron usando células renales porcinas (PK15), y se propagaron los VDVB y VEF en células renales bovinas (MDBK) o células del timo ovino (SFT), respectivamente, de acuerdo con los protocolos estándar (Colección de líneas celulares en Medicina Veterinaria, Friedrich-Loeffler-Institut [FLI], Insel Riems, Alemania). Se examinaron muestras positivas y negativas recientes de jabalís de zonas positivas para VPPC de Alemania Occidental enviadas por los servicios veterinarios estatales. El panel de ARN de referencia EPIZONE, desarrollado en el FLI, incorpora una colección representativa de muestras de ARN de VPPC de los genotipos más relevantes así como de los miembros pestivirus asociados (VEF, VDVB, y pestivirus atípicos). El grupo comprende actualmente 31 muestras de ARN pestivírico diferentes, extraídas de sobrenadantes de cultivos celulares, en una concentración de aproximadamente 1,000 copias de genoma por microlitro. Este panel fue utilizado para analizar la especificidad del sistema NS5A para VPPC.

Desarrollo de un nuevo estándar de NS5A

Para determinar la sensibilidad, se generó un nuevo estándar de ARN. Un oligonucleótido de 140 pares de bases de longitud (oLPC-PPC-NS5A) que contenía un promotor T7 y las secuencias ligantes de iniciador y sonda del protocolo RT-PCR específico para NS5A en tiempo real, conectado mediante cortas secuencias espaciadoras, sirvió como plantilla para la transcripción in-vitro de ARN de cadena sencilla y sentido positivo (Tabla 1). El producto de ARN transcrito in-vitro se trató con DNasa y se purifico usando el Mini Kit RNeasy® (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se determinó la concentración de ARN, y se estableció una serie de diluciones 1:10.

oLPC-PPC-NS5A:

agc tg T AA TAC GAC TCA CTA TAG GG cgtgatga

GCCTGCWYGAAGCYATACAA acag CCG CAC GAG CTC TCG CAG

CAT CC tgcc TGATAYTRGGGTCYGA tatgcgc AGR GTR AAR ACY

GYD AAG AAT GTR AAG tgatgc

Secuenciación parcial de los genomas VPPC

Para la secuenciación, se amplificó el ARN vírico mediante una RT-PCR con el kit Super Script® III One-Step RT-PCR con Platinum® Taq (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). Se aislaron los fragmentos de ADN mediante geles de agarosa con el kit de extracción QIAquick® (Qiagen). La secuenciación llevo a cabo con el kit BigDye® Terminator v1.1 para la secuenciación en ciclos (Applied Byosistems, Foster City, CA, USA). Las secuencias de nucleótidos se leyeron usando el analizador genético ABI 3130 (Applied Biosystems) y se usó la versión 11.0 del software Computer Group para el análisis genético (Accelrys Inc., San Diego, CA, USA).

Diseño de RT-PCR en tiempo real

Se examinaron diferentes regiones del genoma del VPPC ((ERNs, NS2, NS3, NS5A y 3'UTR) para la selección del iniciador y sondas (Figura 1). Con el objetivo de obtener más información sobre las secuencias para optimizar la sensibilidad y la especificidad del sistema de RT-PCR en tiempo real para NS5A, se secuenció la región correspondiente de varios virus PPC con diferentes genotipos. Se usaron estos datos junto con las secuencias de la base de datos del NCBI para diseñar nuevos iniciadores y sondas. Se examinaron varias combinaciones de iniciador con diferentes puntos de partida, bases degeneradas o secuencias colgantes “flap”, así como diferentes sondas (sondas de ácido nucleico en el sentido directo, anti­ sentido y bloqueado (LNA)). La siguiente combinación de iniciadores resultó óptima y es por tanto un aspecto preferido de la presente invención PPC-9403. 1-F-flap (el iniciador directo que contiene una secuencia colgante adicional y tres bases degeneradas) y 9501R (un iniciador inverso con siete bases degeneradas). El tamaño de los fragmentos amplificados con estos iniciadores es de 98 pares de bases. Para la detección, se usó una sonda de LNA marcada con FAM con tres bases degeneradas y siete nucleótidos LNA (ID. SEC. n° 2, véase la Tabla 2 y la Figura 2).

Para el protocolo de RT-PCR en tiempo real en una etapa se utilizó el kit AgPath-ID™ One-Step RT-PCR (Applied Biosystems).

El volumen total de reacción fue de 25 pL para la RT-PCR dúplex en tiempo real y consiste en: 12.5 pL de tampón 2x para RT-PCR, 2.5 pL de agua exenta de RNasa, 1 pL de la mezcla 25x de enzimas para RT-PCR, 2 pL de mezcla 3 de 13-actina HEX ( para la detección del ácido nucleico de referencia (ARNm de 13-actina)) y 2 pL de mezcla NS5A-FAM.

La mezcla especifica de NS5A para VPPC-FAM contiene 12.5 pmol/pL de iniciador directo, 10 pmol/pL de iniciador inverso y 4 pmol/pL de sonda marcada con FAM. La mezcla para el control interno (mezcla 3 de 13-actina) contiene 2.5 pmol/pL de cada uno de los iniciadores directo e inverso y 1.25 pmol/pL de sonda marcada con HEX. Cinco pL de plantilla de ARN se adicionaron a los 20 pL de mezcla magistral.

Para la RT-PCR en tiempo real se utilizó el siguiente perfil térmico: 10 minutos a 450 C (transcripción inversa) y 10 min a 95 o C (inactivación de la RT/activación polimerasa) seguidos por 42 ciclos de amplificación del ADN, cada uno consistiendo en 15 segundos de desnaturalización a 95 o C, 30 segundos de hibridación por bases complementarias (con colección de datos de fluorescencia en el punto final) a 57 o C y 35 segundos de elongación a 72o C. Para comparar la sensibilidad y la especificidad se utilizaron un sistema de RT-PCR en tiempo real específico para VPPC y uno "panpesti" (Hoffinann et al., 2005; Hoffmann et al., 2006). La RT-PCR en tiempo real se llevó a cabo usando un termociclador Mx3005P (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Tabla 2: Iniciadores y sondas usadas en el sistema de RT-PCR en tiempo real para NS5A especifica del VPPC, con control interno de mezcla 3 de 13-actina. Los ácidos nucleicos bloqueados (LNA)) en las secuencias de sonda están marcados con letra negrita cursiva. Se enumeran también los oligonucleótidos in i r l n r i n n n r ARN N A.

Las letras negritas se refieren a nucleótidos de LNA

Resultados del sistema dúplex NS5A PR-PCR en tiempo real con el control interno

Con el objetivo de examinar la especificidad del nuevo ensayo en cuanto a VPPC, se usó el panel de ARN de referencia EPIZONE, que contenía 13 muestras de ARN del VPPC, y 17 muestras de ARN de VEF o VDVB de todos los genotipos representativos. A diferencia del sistema PPC 1, todos los virus de PPC resultaron claramente positivos al usar el sistema de NS5A (Tabla 3). Ninguno de los ARNs de pestivirus no-VPPC proporciono productos de amplificación detectables con el sistema de NS5A, lo que muestra la especificidad del método de acuerdo con la presente invención. Además, el sistema de NS5A mostró una sensibilidad mejorada con respecto al sistema de la técnica previa.

También se examinaron muestras de campo alemanas actuales de brotes recientes del VPPC en jabalíes con el nuevo ensayo de NS5A confirmándose en todos los casos el estado previamente determinado de las muestras (Hoffmann et al., 2005a) (datos no mostrados). Además, puesto que los brotes mas recientes de PPC en Alemania y Europa se asociaron mayormente al genotipo 2.3 de VPPC, se extrajo el ARN de 20 recientes VPPC europeos aislados de ese genotipo y se examinaron con el método de acuerdo con la presente invención (sistema de NS5A). Todas las muestras fueron claramente calificadas positivas. Posteriormente, estos ARNs se diluyeron por un factor de 1000 y se testaron en el sistema de NS5A y en el sistema de PPC 1 de la técnica previa, mostrándose una reducción del valor Cq de aproximadamente diez (Tabla 4).

Con el objetivo de examinar la sensibilidad del sistema de NS5A, se analizó un estándar de ARN y dos series de diluciones 1:10 que contenían ARN de VPPC de a) el genotipo 2.3 y b) el genotipo 1.1. En ambas series de diluciones, seis pasos se puntuaron positivos con el ensayo de NS5A, y los valores de Cq estuvieron dentro de 16 y 33 (genotipo 1.1), 20 y 38 (genotipo 2.3), respectivamente. El sistema de PPC 1 de la previa técnica examinada en comparación permitió detectar seis pasos de una serie de diluciones de la cepa C “Riems” y cinco pasos de la serie de diluciones de PPC 2.3 (datos no mostrados). En ambas series de diluciones, el ensayo de NS5A fue más sensible que el sistema PPC 1 publicado por Hoffmann et al. 2005. Además, se testó una serie de diluciones de un nuevo estándar de ARN, generado por transcripciones “in vitro” de un oligonucleótido sintético. Esta vez, se detectaron nueve pasos de dilución desde 108 a 100 copias en el sistema NS5A en tiempo real RT-PCR (Figuras 3a y 3b).

Para diagnósticos de rutina, se examinó finalmente el sistema de NS5A en un protocolo de RT-PCR dúplex en tiempo real con un sistema de control interno usando 13-actina (mezcla 3). En comparación con el ensayo simple NS5A, no se observó ninguna influencia notable respecto a la sensibilidad o especificidad en los ensayos dúplex.

Tabla 3: Resultados de una RT-PCR en tiempo real en los sistemas NS5A y PPC 1 para las muestras de VPPC del panel de ARN de referencia de la EPIZONE. Se muestran los valores de Cq de ARNs de muestras sin diluir y diluidas 1: 100.

Tabla 4: Se examinaron 20 muestras europeas diferentes de ARN de VPPC del genotipo 2.3 con el nuevo sistema de RT-PCR en tiempo real para NS5A especifica de VPPC, y se compararon los resultados con los del sistema de PPC 1. Las muestras de ARN se obtuvieron mediante extracción del ARN del sobrenadante del cultivo celular con el Mini Kit QIAmp® para ARN Vírico y se diluyeron por un facto de 1000 en tampón RSB50. Los valores de Cq son valores promediados de muestras examinadas por duplicado.

Tabla 5: Resultados de una RT-PCR en tiempo real en el sistema de NS5A de acuerdo con la presente invención y los sistemas Pan-Pesti para cepas de pestivirus no-VPPC del panel de ARN de referencia EPIZONA. Se muestran los valores de Cq.

Haegeman et al. y Wong et al.

Para Haegeman et al. se examinó un panel de ARN de 13 cepas de VPPC de todos los genotipos representativos (amablemente proporcionado por el German Federal Research Institute for Animal Health). Solo 6 de las 13 cepas de VPPc pudieron ser claramente detectadas positivas con un producto de amplificación positivo a 322 pares de bases. Las cepas Eystrup, Pader y Bergen no mostraron los productos de amplificación correctos y 4 cepas no se pudieron amplificar en lo más mínimo (Brescia, Schweiz II, D4886/82/Ro, Congenital Tremor) (véanse las figuras).

Para Wong et al. se examinó un panel de ARN de 4 cepas de VPPC (amablemente proporcionado por el German Federal Research Institute for Animal Health) (véanse las figuras).

Diseño RT-PCR en tiempo real para el iniciador de ID. SEC. n° 44

Los estudios de alineación de secuencia revelaron que la región de codificación NS5A del virus PPC estaba considerada como una de las mas prometedoras para la selección de la sonda y del iniciador. Con el objetivo de obtener más información de la secuencia para optimizar la sensibilidad y la especificidad de la RT-PCR en tiempo real para el sistema NS5A, se secuenció la región correspondiente de varios virus de PPC con diferentes genotipos. Se usaron estos datos junto con las secuencias de la base de datos NCBI para diseñar nuevos iniciadores y sondas. Se testaron varias combinaciones de iniciadores con diferentes puntos de partida, bases degeneradas o adicionales secuencias colgantes “flap”, así como diferentes sondas (sondas de ácidos nucleico en sentido directo, anti-sentido y bloqueado [LNA]). La siguiente combinación de iniciadores se consideró óptima: PPC-9403.1-F-flap (el iniciador directo que contiene una secuencia colgante adicional y tres bases degeneradas) y 9501R (el iniciador inverso con siete bases degeneradas). El tamaño del fragmento amplificado es de 98 pares de bases. Para la detección, se usó una sonda de LNA marcada con FAM con tres bases degeneradas y siete nucleótidos LNA. Como se ha mostrado, cuando se usa la secuencia de ID. SEC. n° 44 como un iniciador directo da mejores resultados en algunas muestras. Además, puede mostrarse que una mezcla usando los iniciadores directos de ID. SEC. números 3 y 44 combinados con el iniciador inverso de ID. SEC. n° 4 da mejores resultados en ciertas muestras.

DTT solution (1 mol/l).

La mezcla NS5A marcada con FAM específica de PPCV contiene 25 pmol/pL de iniciador directo, 6,25 pmol/|jL de iniciador directo modificado, 20 pmol/|jL de iniciador inverso y 6 pmol/|jL de sonda marcada con FAM. La mezcla para el control interno (EC mezcla) contiene 2.5 pmol/pL de cada uno de los iniciadores inverso y directo y 1.25 pmol/pl de sonda marcada con HEX. Cinco pL de plantilla de ARN se adicionaron a 20 pi de la mezcla magistral. Para la RT-PCR en tiempo real se uso el siguiente perfil térmico: 10 minutos a 450C (transcripción inversa) y 10 minutos a 950C (inactivación de la RT /activación de la polimerasa) seguido por 40 ciclos de amplificación del ADN, cada uno consistiendo de 15 segundos de desnaturalización a 950C, 30 segundos de hibridación por bases complementarias (con colección de datos de fluorescencia en el punto final) a 57 ^oc y 35 segundos de elongación a 72 ^oc. La RT-PCR en tiempo real se llevo a cabo usando un termociclador Mx3005P (Agilent).

Resultados del ensayo dúplex NS5A RT-PCR en tiempo real con control interno

Finalmente, se examinó el sistema de NS5A para diagnósticos de rutina en un protocolo de RT-PCR dúplex en tiempo real con un sistema de control interno que usa 13-actina. En comparación con el ensayo simple de NS5A no se observo ninguna influencia notable respecto de la sensibilidad o especificidad en el ensayo dúplex. Con el objetivo de testar la especificidad en cuanto a VPPC del nuevo ensayo, se testaron muestras del panel de ARN de referencia de EPIZONE (proporcionadas por el Friedrich-Loeffler-Institute, Isle of Riems) que contenían muestras de ARN de VPPC, y muestras de ARN de VEC o VDVB de diferentes genotipos. Todos los VPPC resultaron claramente positivos al usar el sistema NS5A (véase la Figura 7), mientras que todos los ARNs de pestivirus no-VPPC resultaron negativos. Se detectaron dos muestras de VPPC positivas de la cepa 1047 (PPC104 Tonsil, PPC1047 EDTA sangre, proporcionada por el instituto Friedrich-Loeffler) con la nueva mezcla modificada de NS5A (ID. SEC. números 44, 3 y 4).

Descripción de las figuras

Figura 1: Vista general del genoma VPPC con las proteínas expresadas y una escala que indica las respectivas posiciones nucleotídicas en el genoma. Las cifras y flechas negras muestran las posiciones genómicas aproximadas examinadas durante el desarrollo del nuevo sistema de RT-PCR en tiempo real especifico del VPPC.

Figura 2: Multi-alineamiento Clustalw2/BioEdit de diferentes genomas de VPPC procedentes de la base de datos del NCBI y productos de aislamiento de VPPC nuevamente secuenciados. La numeración de los nucleótidos se refiere a la secuencia genómica completa de la cepa AF326963 “Eystrup” (ID. SEC. n01). Figura 3: a) Gráfico de amplificación de una serie de diluciones 1:10 del estándar de ARN de NS5A recién desarrollado y examinado con el sistema de RT-PCR en tiempo real para NS5A específica de VPPC. Los números en las curvas indican la cantidad inicial (número de copias) de genomas de VPPC añadidos a la mezcla de reacción. b) Grafico de curva estándar del ARN estándar, a partir de la RT-PCR en tiempo real específica para NS5A.

Figura 4: Haegemen et al. (Characterisation of the discrepancy between PCR and virus isolation in relation to classical swine fever virus detection". Journal of Virological. Methods, vol. 136, no. 1-2, September 2006 (2006-09), pages 44-50) describen un ensayo de PCR para la detección del VPPC. La región NS5A es el objetivo para una PCR diagnostica con la pareja de iniciadores PPC-8581 y PPC-8902. Los autores expresaron que esta PCR era capaz de detectar VPPC, aunque sugerían probar un panel de diferentes sistemas de PCR para unos mejores resultados.

El gel muestra el examen de ARN desde 13 cepas de VPPC distintas en una PCR estándar con la pareja de iniciadores PPC-8581 / PPC-8902 (kit QIAGEN One Step RT-PCR, Programa RT-PCR: 30 min a 450C, 15 minutos a 950C, 50 ciclos: 30 segundos a 940C, 30 segundos a 570C, 1 minuto a 720C.; 10 min a 720C).

En la tabla 6 se muestra una comparación del examen de 13 cepas de VPPC mediante RT-PCR en tiempo real (i) de acuerdo con la invención y, por contraste, (ii) con los iniciadores PPC-8581/PPC-8902 (Haegeman et al.). Para Haegeman et al. solo se pudieron detectar 6 de las 13 cepas de VPPC. Por contraste, en la presente invención se detectaron exitosamente todas las cepas de VPPC examinadas. Por tanto, el método publicado de Haegeman et al. no es apropiado para la detección específica del virus de la peste porcina clásica.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un método para determinar la presencia del virus de la peste porcina clásica (VPPC) en un sujeto, que comprende las siguientes etapas:

   - Amplificación de la región NS5A de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC) en una muestra procedente de dicho sujeto y

   - Detección de la región NS5A, en donde la detección de la región NS5A de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC) se atribuye a la presencia de un virus de la peste porcina clásica (VPPC) en dicho sujeto

   en donde la amplificación se realiza usando un primer iniciador de amplificación que hibrida bajo condiciones estrictas con una región de acuerdo con la secuencia ID. SEC. n° 45 y

   en donde el primer iniciador de amplificador comprende una secuencia de acuerdo con la secuencia ID. SEC. n° 44, o una secuencia que es 80 % idéntica a la misma y comparte todos los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la secuencia ID. SEC. n° 44.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde el primer iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 44, o una secuencia que es 85%, 90%, 95%, 98% idéntica a la misma y opcionalmente un adicional primer iniciador de amplificación.
3. 3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la amplificación se realiza usando un segundo iniciador de amplificación que comprende una secuencia de acuerdo con la secuencia ID. SEC. n° 4, o una secuencia que es 80%, 85%, 90%, 95%, 98% idéntica a la misma y comparte uno, dos, tres o todos de los diez primeros, de los 12 primeros o de los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 4.
4. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la amplificación y/o la detección de la región NS5A se realizan mediante RT-PCR en tiempo real.
5. 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la amplificación se realiza usando un tercer iniciador de amplificación que hibrida con una región de una o más secuencias de ID. SEC. números 37 a 41.
6. 6. El método según la reivindicación 5, en donde el tercer iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 3, o una secuencia que es 80%, 85%, 90%, 95%, 98% idéntica a la misma y que comparte uno, dos, tres o todos de los 10 primeros, de los 12 primeros o de los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 3.
7. 7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el primer iniciador de amplificación consiste en una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 44, y/o en donde el segundo amplificador de iniciación consiste en una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 4 y/o en donde el tercer amplificador de iniciación consiste en una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 3.
8. 8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la detección de la región NS5A comprende el uso de una sonda de ácido nucleico que hibrida con la región NS5A de al menos un genoma de virus de la peste porcina clásica (VPPC) y/o con un ácido nucleico complementario en al menos una región NS5A de al menos un genoma del virus de la peste porcina clásica (VPPC).
9. 9. El método según la reivindicación 8, en donde la sonda de ácido nucleico hibrida con todas las secuencias del grupo formado por las ID. SEC. números 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 45 o fragmentos de las mismas.
10. 10. El método según la reivindicación 8 o 9, en donde la sonda de ácido nucleico comprende al menos una modificación para aumentar la estabilidad del híbrido formado por la sonda-objetivo, o al menos 4 modificaciones para aumentar la estabilidad del híbrido formado por la sonda-objetivo, por ejemplo, los ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
11. 11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la sonda de ácido nucleico comprende la secuencia de ID. SEC. n° 2.
12. 12. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el producto de amplificación comprende la secuencia de acuerdo con la secuencia ID. SEC. n° 2.
13. 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la 13-actina se usa como un control interno.
14. 14. Un iniciador de amplificación que híbrida con una región de ID. SEC. n° 45 bajo condiciones estrictas.

    En donde el iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo con la secuencia ID. SEC. n° 44 o con una secuencia que es el 80% idéntica a la misma y que comparte todos de los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 44.
15. 15. Un kit que comprende:

    - un primer iniciador de amplificación que hibrida con una región de ID. SEC. n° 45 bajo condiciones estrictas, en donde el primer iniciador de amplificación comprende una secuencia de acuerdo con la ID. SEC. n° 44, o una secuencia que es 80 % idéntica a la misma y que comparte al menos todos de los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 44, y

    - un segundo iniciador de amplificación que comprende una secuencia de acuerdo con la secuencia ID. SEC. n° 4, o una secuencia que es 80% idéntica a la misma y que comparte, uno, dos, tres o todos de los 10 primeros, los 12 o los 18 primeros nucleótidos, contados desde el extremo 3' de la ID. SEC. n° 4.