JP2022546443A - ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡを含む、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅および検出のための組成物および方法 - Google Patents

ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡを含む、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡの増幅および検出のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

競合的ブロックオリゴヌクレオチドがＨＢＶ ＤＭＡの増幅を防止する、生物学的または非生物学的サンプル中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの存在または非存在の迅速な検出のための方法が記載されている。前記方法は、増幅工程、ハイブリダイズ工程、および検出工程を実施することを含み得る。さらに、ＨＢＶ ＤＭＡの増幅を防止するための競合的ブロックオリゴヌクレオチド、ＨＢＶ ＨＢＶを標的化するためのプライマーおよびプローブ（特に、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ、例えばｐｇＲＮＡ）、ならびにＨＢＶ ＨＢＶ ＲＮＡ、特にｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ、例えばｐｇＲＮＡを検出するために設計されたキットが提供される。

Description

本開示は、インビトロウイルス診断の分野に関する。この分野では、本発明は、相同ゲノムＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡの増幅および検出を防止するために、少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーおよび少なくとも１つの競合的ブロックオリゴヌクレオチドを使用する、サンプル中に存在し得る標的核酸の増幅および検出、特に、ＨＢＶ、特にＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）等の共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来するＨＢＶ ＲＮＡ）の配列変異および／または個々の変異を含む標的核酸の特異的増幅および検出に関する。本発明はさらに、循環ＨＢＶ ＲＮＡの増幅および検出のための方法、オリゴヌクレオチド（逆転写（ＲＴ）プライマーおよび競合的ブロックオリゴヌクレオチドなど）を含む、反応混合物、およびキットを提供する。
肝炎は肝臓の炎症であり、肝臓に影響を及ぼすウイルス感染のファミリーによって引き起こされ得、最も一般的なタイプはＡ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎である。Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎は、３つの異なるウイルスによって引き起こされる疾患である。
Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる肝臓の感染症である。ＨＢＶは、急性感染および／または慢性感染の両方を引き起こし得る。初期感染の間、多くの人々は無症候性であるが、一部の人々は疾患の急速な発症を示す（嘔吐、黄色がかった皮膚、疲労、暗色尿および腹痛を含む）。慢性Ｂ型肝炎は、出生前後の感染者に優先的に罹患する。慢性疾患を有するこれらの個人の大部分も無症候性であるが、最終的には肝硬変および肝臓癌を発症し得る。これらの合併症は、慢性疾患を有する人の１５～２５％の死亡をもたらす。ＨＢＶは、一般的に、例えば、ＨＢＶに感染した人由来の血液、精液、または他の体液が、感染していない人の体内に入る際に、感染性の血液または体液への曝露によって伝染する。これは、性的接触、注射針、注射器、または他の薬物注射機器の共有によって、または出産時に母親から赤ん坊に起こり得る。出生時付近の感染症または小児期の他の人々の血液との接触による感染症は、疾患が一般的な地域でＢ型肝炎を獲得する最も頻度が高い方法である。疾患がまれな地域では、静脈内薬物使用および性交が最も頻度の高い感染経路である。他の危険因子には、医療行為、輸血、透析、感染者との生活、感染率が高い国での旅行、および施設での生活が挙げられる。ＨＢＶ感染は、曝露の３０～６０日後に診断することができる。次いで、診断は、通常、ＨＢＶウイルスの一部およびＨＢＶウイルスに対する抗体について血液を試験することによって確認される。
ＨＢＶ感染は、１９８２年以来ワクチン接種によって予防可能である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、可能であれば、より長期間の保護を確実にするために必要なその後の用量での、生後１日のワクチン接種を推奨している。慢性Ｂ型肝炎の患者にはテノホビルまたはインターフェロン等の抗ウイルス薬が有用であり得るが、肝硬変の患者には肝移植が有用な場合がある。
疾患を管理するために利用可能な治療法はあるが、治癒率は低い。治癒的療法がない場合、抗ウイルス薬への生涯にわたる遵守が必要である。治療を除去することによって、現在の治療では感染細胞核内のＨＢＶエピソーマルゲノムのリザーバを直接標的化することができないため、ＨＢＶ力価の揺り戻しが可能になることがしばしばである。
ＨＢＶのウイルス生活環は、ＤＮＡ形態とＲＮＡ形態との間で交互である。感染性ＨＢＶ粒子は、不完全な二本鎖ＤＮＡゲノム（緩和環ＤＮＡまたはｒｃＤＮＡ）を含む。感染細胞では、ＨＢＶ ＤＮＡ複製が完了して、宿主細胞の核内に共有結合で閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）が形成される。このＤＮＡゲノムからの転写によって、ウイルスの構造中のタンパク質（コアおよび表面タンパク質）、ｅ抗原、ウイルスポリメラーゼ、およびＸ抗原をコードする様々なメッセンジャーＲＮＡ形態が生成される。プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）として知られる１つのｍＲＮＡ形態は、カプシド化された分泌ウイルス粒子中にｒｃＤＮＡの新しいコピーを生成するウイルスポリメラーゼの逆転写活性の鋳型としても機能する。いくつかの根拠は、ある割合のカプシド化されたｐｇＲＮＡが逆転写されることなく放出され、感染細胞の産生がｒｃＤＮＡおよびｐｇＲＮＡ含有ウイルス粒子の両方を含むようになっていることを示す。さらに、複数のスプライシングされたＲＮＡバリアントが存在し、その一部はまた、ＨＢＶ ＤＮＡの不完全な形態に逆転写され、分泌される。ＨＢＶゲノムの宿主染色体への組み込みは、完全なｐｇＲＮＡ分子を産生することができないため、複製サイクルの一部ではないが、これは一般的に生じるものであり、表面抗原含有サブウイルス粒子の分泌に寄与する、より小さい、切断型または融合ｍＲＮＡを産生する宿主細胞をもたらし得る。
以下の表１は、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡから生成されると考えられるＨＢＶ ＲＮＡ形態のリストである。
Figure 2022546443000002
以下の表２では、組み込まれたコピーから転写することができない（すなわち、排他的にｃｃｃＤＮＡが起源である）ＨＢＶ ＲＮＡの形態のリストである。
Figure 2022546443000003
以下の表３では、組み込まれたコピーから転写し得るＨＢＶ ＲＮＡのいくつかの形態が示されている。
Figure 2022546443000004
ＨＢＶのマーカーとしては、ＤＮＡ、ｅ抗原（プレコアｍＲＮＡ由来）、コア抗原（またはｅおよびコアを含む抗原の組合せ）、およびｓ抗原、ならびにこれらの抗原に対する抗体の対象／患者の産生の検出が挙げられる。ｓ抗原の抑制は、機能的治癒のためのマーカーである。しかしながら、ｓ抗原は、ＨＢＶの組み込まれた非複製コピーによって産生され得るのであるため、ＨＢｓＡｇレベルの定量は、転写活性なｃｃｃＤＮＡのプールを正確に反映する可能性は低い。ＨＢＶ感染を検出するための高感度検査としてＤＮＡ力価がモニタリングされ、ＨＢＶの減少は治療応答の指標である。しかしながら、ＨＢＶのための現在のヌクレオシド類似体療法（逆転写を抑制する）は、ｐｇＲＮＡまたは他のｍＲＮＡの転写に影響せず、新しいｒｃＤＮＡコピーの生成のみに影響を及ぼす。患者の血液（血漿または血清サンプルタイプ）におけるＤＮＡ力価の減少は、ＨＢＶ ＲＮＡの減少に必ずしも対応しておらず、これは、カプシド化されたｐｇＲＮＡ（およびスプライシングされたＲＮＡ）が転写活性なｃｃｃＤＮＡを保持する感染細胞によって分泌され得るために、遅れるかまたは一時的に増加する可能性がある。このため、ＨＢＶ ＲＮＡは、ＨＢＶの疾患状態および治療有効性をモニターするための別個のマーカーとして研究されている。研究により、ＨＢＶ ＲＮＡレベルが、処置の中止後のｅ抗原喪失、ウイルス再発、または「再発」事象等の転帰を予測することができるものであり、バイオマーカーが、ＨＢＶ患者の処置終了のタイミングにおいて潜在的に重要であることが示されている。
ＨＢＶ ＲＮＡ構造とバリアントとの間の識別、およびＲＮＡを相同ＤＮＡ対応物から識別することは、疾患状態を理解するために重要である。最先端の当技術のアッセイは、ポリＡテールを二段階（ＲＴおよびＰＣＲ）ＲＡＣＥ法で標的化する（ｖａｎ Ｂｏｍｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６１：６６－７６（２０１５）；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９５：２９－４４（２００４）；Ｋａｉｒａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ４２：２２８－２３７（１９９９）、Ｓｃｈｕｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、８６（２）：１６７－１７１（２０００）。さらなるアッセイは、プレコアｍＲＮＡとｐｇＲＮＡの転写開始部位間のゲノムの領域を標的とし、これらの形態を区別する（Ｗａｎｇｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６５：７００－７１０（２０１６）。ｍＲＮＡの５’末端の長さの差の同様の標的化を使用して、ｐｇＲＮＡと、ｓ抗原およびＸ抗原を産生するより小さなウイルスｍＲＮＡとを区別することもできる（Ｂｕｔｌｅｒ Ｅ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１８ ６８（６）：２１０６－２１１７）。他のアッセイは、スプライシングされたＲＮＡ（またはＤＮＡ）バリアントを標的とすることができる（Ｂａｙｌｉｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．５９：１０２２－１０２８（２０１３）；Ｐｒｅｉｓｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４８：７４１－７４９（２００８）。ポリＡ標的化ＲＡＣＥアッセイのいくつかを除くすべてのアッセイは、ＤＮＡからＨＢＶ ＲＮＡを識別するためのＤＮＡ除去法（例えば、ＤＮａｓｅ処理、またはＲＮＡを優先するか、もしくはＤＮＡを枯渇させるサンプル調製方法）の使用を必要とし、これは、残留ＤＮＡを残すか、または関与するさらなる工程によってＲＮＡ量もしくは完全性に影響を及ぼし得る、ＤＮＡｓｅ不活性化工程または他の洗浄工程を伴わないｑＰＣＲにおけるアッセイの感度および潜在的な使用を制限する。ポリＡ標的化ＲＡＣＥアッセイおよびほとんどの他のアッセイは、手動のサンプル調製を必要とし、これは、１日で実行することができる試験の処理量を制限する。したがって、当技術分野における既存のアッセイは、単に十分に高感度ではない。したがって、手動のサンプル調製を必要とせず、ＤＮＡｓｅ処理を省略する能力を有する、相同ＤＮＡのバックグラウンドでＨＢＶ ＲＮＡを検出する方法が当技術分野で必要とされている。
分子診断の分野では、核酸の増幅および検出はかなり重要である。そのような方法は、任意の数のウイルスおよび細菌等の微生物を検出するために使用することができる。最も顕著で広く使用されている増幅技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。他の増幅技術としては、リガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ－ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）およびＱβ増幅が挙げられる。
ＰＣＲに基づく分析のための自動化されたシステムは、しばしば、同じ反応容器におけるＰＣＲプロセス中の産物増幅のリアルタイム検出を利用する。そのような方法の重要な点は、レポーター基または標識を有する改変オリゴヌクレオチドの使用である。
ＨＢＶ感染は広範であり、世界人口の約３分の１が生涯のある時点で感染しており、そのうち３億４３００万人が慢性感染症に罹患している。毎年７５万人を超える人々がＢ型肝炎で死亡しており、これらの死亡の約３０万人が肝臓がんに起因すると考えられている。ＨＢＶの広範な感染性にもかかわらず、感染はほとんどが無症候性であるため、感染者の多くは認識していない。さらに、現在の診断方法は、ＨＢＶ抗原、ＨＢＶ抗原に対する抗体、またはＨＢＶ ＤＮＡの検出に焦点を合わせている。研究によって、血液中のＨＢＶ抗原またはＨＢＶ ＤＮＡ力価の減少が、ＨＢＶ ＲＮＡの減少に必ずしも対応しないことが示されている。したがって、当技術分野では、ＨＢＶの疾患状態および治療有効性をモニターするための、ＨＢＶ ＲＮＡを検出する迅速で信頼性が高い高感度の方法が必要とされている。本明細書に記載の本発明は、手動のサンプル調製またはＤＮＡｓｅ処理の必要がない、相同ＤＮＡのバックグラウンドにおけるＨＢＶ ＲＮＡの検出を可能にする。
本開示の特定の実施形態は、ＨＢＶの疾患状態および治療有効性をモニターするための、生物学的または非生物学的サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡの存在または非存在の迅速な検出、例えば、単一の試験管内のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＨＢＶの検出のための方法に関する。実施形態は、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み得る、少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含むＨＢＶの検出方法を含む。さらに、実施形態は、オリゴヌクレオチド（逆転写プライマー（ＰＣＲプライマーであってもよい）、ブロッキングオリゴヌクレオチド、従来のプライマーおよびプローブを含む）、および単一のチューブでＨＢＶを検出するために設計されたキットを含む。
競合的ブロックオリゴヌクレオチドの使用は、相同ＤＮＡの存在下におけるＲＮＡの検出および定量を改善する。ＨＢＶ患者では、ＤＮＡ含有ウイルスおよびＲＮＡは共に血流中を循環しており、未処置の患者では、ＤＮＡレベルは典型的にはＲＮＡレベルよりも高い。両方の形態は、他のサンプルタイプにおいても共に見出されるであろう。従来のＰＣＲ技術は、ＨＢＶ ＲＮＡ（ｐｇＲＮＡおよび他のスプライシングされていないｍＲＮＡ）をＤＮＡと区別することができず、これは、共通の配列が存在するためである（ＨＢＶ ＲＮＡ形態のサブセットのみがスプライシングされる）。ＤＮＡ除去技術（例えば、ＤＮａｓｅ、またはＲＮＡを優先するか、もしくはＤＮＡを枯渇させることができる他のサンプル処理方法）はまた、ＲＮＡ力価に影響を与える可能性があり、完全に有効ではない可能性があり、または有効性が可変する可能性があり、かつ、安定性、汚染、または自動化されたもしくはハイスループットのワークフローでの使用を妨げる他の欠点を有する可能性がある。
ＨＢＶ ＤＮＡとＲＮＡとの間の１つの配列の違いは、ｐｇＲＮＡおよび他のｍＲＮＡのポリＡテールであるが、オリゴｄ（Ｔ）プライマーを使用する方法は、非標的ＲＮＡまたはポリＡ伸長部を有する他の配列を検出することができる。「固定された」ポリＴ含有オリゴヌクレオチドは、非標的結合および伸長に対する特異性のいくらかの尺度を提供し得るが、これは、ＨＢＶ ＤＮＡへのいくらかの結合をもたらすトレードオフ戦略である。本開示における方法は、ＤＮＡの存在下でＲＮＡを標的とするアッセイの性能（感度および特異性）を改善するための方法として、ＲＮＡ配列がポリＡテール結合を有する標的においてＤＮＡ配列とマッチする競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含む。競合的ブロックオリゴヌクレオチドが相同ゲノムＨＢＶ ＤＮＡに結合することによって、プライマー（例えば、ＲＴプライマー）の結合が妨げられ、それによって相同ゲノムＨＢＶ ＤＮＡの望ましくない増幅が減少する。本方法の識別能をさらに改善するために、改変安定化塩基をアッセイオリゴヌクレオチドまたはブロッカーオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。
ＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等の転写物のための標準的なポリＡテール位置を有するが、他のｍＲＮＡおよびスプライシングされたＲＮＡも含む、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）のポリＡテールを標的とするプライマーおよびプローブを提供することができる。ＨＢＶ ＤＮＡの存在下でＲＮＡに対する特異性を増加させる競合的ブロックオリゴヌクレオチドを提供することができる。他のポリＡ部位、例えば、組み込まれたＨＢＶコピーに由来し得るＨＢＶ転写物の二次または切断ポリＡ部位を標的とする、さらなるプライマーおよびプローブを提供することができる。ＨＢＶ ＤＮＡの存在下でこれらの特異的ポリＡ部位を有するＲＮＡに対する特異性を増加させる競合的ブロックオリゴヌクレオチドを提供することができる。
本開示の一実施形態は、サンプル中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）サンプルを提供すること、（ｂ）ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を産生するために、サンプルを１つまたは複数の競合的結合オリゴヌクレオチド、１つまたは複数のプライマーセットおよび核酸ポリメラーゼと接触させることを含む増幅工程を実施することを含み、１つまたは複数のプライマーセットは、少なくとも１つのフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーを含み、（ｃ）ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を１つまたは複数のプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実施すること、および（ｄ）増幅産物の存在または非存在を検出することをであって、増幅産物の存在は、サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸の存在を示し、増幅産物の非存在は、サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸の非存在を示す、検出することを含む、検出工程を実施することを含む方法に関する。他の実施形態において、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する。他の実施形態において、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、ポリＡテールを含む。リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸のポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む。他の実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血漿である。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血液である。他の実施形態において、（ｉ）少なくとも一つのフォワードプライマーは、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉ）リバースプライマーとしても機能する少なくとも一つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６、１１６、１１７、１５１および１５２から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のプローブは、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ（ｉｖ）１つまたは複数の競合ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む。
本開示の他の実施形態は、サンプル中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）サンプルを提供すること、（ｂ）ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を産生するために、サンプルを１つまたは複数の競合的結合オリゴヌクレオチド、１つまたは複数のプライマーセットおよび核酸ポリメラーゼと接触させることを含む増幅工程を実施することを含み、１つまたは複数のプライマーセットは、少なくとも１つのフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーとを含み、（ｃ）ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を１つまたは複数のプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実施すること、および（ｄ）増幅産物の存在または非存在を検出することを含む検出工程を実施することを含み、増幅産物の存在は、サンプル中の１つまたは複数のＨＢＶ ＲＮＡの標的核酸の存在を示し、増幅産物の非存在は、サンプル中の１つまたは複数のＨＢＶ ＲＮＡの標的核酸の非存在を示し、１つまたは複数のプライマーセットは、少なくとも１つのフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーとを含み、かつ、（ｉ）少なくとも一つのフォワードプライマーは、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉ）リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６、１１６、１１７、１５１および１５２から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のプローブは、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ（ｉｖ）１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む、方法に関する。他の実施形態において、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する。他の実施形態において、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、ポリＡテールを含む。リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸のポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む。他の実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血漿である。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血液である。
本開示の他の実施形態は、サンプル中に存在し得るＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸を検出するためのキットであって、（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、（ｃ）少なくとも１つのフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーとを含む１つまたは複数のプライマーセット、（ｄ）１つまたは複数のプローブ、および（ｅ）１つまたは複数の競合的結合オリゴヌクレオチドを含むキットに関する。他の実施形態において、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する。他の実施形態において、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、ポリＡテールを含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸のポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む。他の実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。他の実施形態において、（ｉ）少なくとも１つのフォワードプライマーは、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉ）リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６、１１６、１１７、１５１および１５２から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のプローブは、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ（ｉｖ）１つまたは複数の競合ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む。
本開示の他の実施形態は、サンプル中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡを検出するためのキットであって、（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸、（ｃ）少なくとも１つのフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーとを含む１つまたは複数のプライマーセット、（ｄ）１つまたは複数のプローブ、および（ｅ）１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含む、（ｉ）少なくとも一つのフォワードプライマーは、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉ）リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６、１１６、１１７、１５１および１５２から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のプローブは、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ（ｉｖ）１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む、方法に関する。他の実施形態において、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する。他の実施形態において、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、ポリＡテールを含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸のポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む。他の実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血漿である。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血液である。
本開示の１つの実施形態は、サンプル中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）サンプルを提供すること、（ｂ）ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を産生するために、サンプルを１つまたは複数の競合的結合オリゴヌクレオチド、１つまたは複数のプライマーセットおよび核酸ポリメラーゼと接触させることを含む増幅工程を実施することを含み、１つまたは複数のプライマーセットは、少なくとも１つのフォワードプライマーとリバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーとを含み、（ｃ）ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を１つまたは複数のプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実施すること、および（ｄ）増幅産物の存在または非存在を検出することであって、増幅産物の存在が、サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸の存在を示し、増幅産物の非存在が、サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸の非存在を示す、検出することを含む、検出工程を実施することを含む方法に関する。他の実施形態において、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する。他の実施形態において、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、ポリＡテールを含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸のポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む。他の実施形態において、サンプルは、生物学的サンプル、例えば血漿および／または血液である。他の実施形態において、（ｉ）１つまたは複数のフォワードプライマーは、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉ）リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３４、３５、４３、９４、９６、１１２、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１４１、１４２、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のプローブは、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ（ｉｖ）１つまたは複数の競合ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、９、１０、１１、１４、および１５の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは２つの核酸配列を含み、２つの核酸配列は配列番号１５１および１５２の核酸配列またはそれらの相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号４３の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６、１１２、１１６および１１７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９４、９６、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１５１、１５３、１５５および１５７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１４２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１４１、１５３、１５７、１６１、１６３、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８８および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３５の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４および５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３４の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、９、１０、１１および１４から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１５１の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、１０、１１および１５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。
本開示の他の実施形態は、サンプル中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸を検出する方法であって、（ａ）サンプルを提供すること、（ｂ）ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を産生するために、サンプルを１つまたは複数の競合的結合オリゴヌクレオチド、および１つまたは複数のプライマーセットと接触させることを含む増幅工程を実施することを含み、１つまたは複数のプライマーセットは、少なくとも１つのフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーとを含み、（ｃ）ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を１つまたは複数のプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実施すること、および（ｄ）増幅産物の存在または非存在を検出することを含む検出工程を実施することを含み、増幅産物の存在は、サンプル中の１つまたは複数のＨＢＶ ＲＮＡの標的核酸の存在を示し、増幅産物の非存在は、サンプル中の１つまたは複数のＨＢＶ ＲＮＡの標的核酸の非存在を示し、１つまたは複数のプライマーセットは、１つまたは複数のフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーとを含み、かつ、（ｉ）１つまたは複数のフォワードプライマーは、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉ）リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の１逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３４、３５、４３、９４、９６、１１２、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１４１、１４２、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のプローブは、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ（ｉｖ）１つまたは複数の競合ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、９、１０、１１、１４、および１５から選択される群の核酸配列またはその相補体を含む、方法に関する。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは２つの核酸配列を含み、２つの核酸配列は配列番号１５１および１５２の核酸配列またはそれらの相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号４３の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６、１１２、１１６および１１７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９４、９６、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１５１、１５３、１５５および１５７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１４２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１４１、１５３、１５７、１６１、１６３、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８８および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３５の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４および５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３４の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、９、１０、１１および１４から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１５１の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、１０、１１および１５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する。他の実施形態において、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、ポリＡテールを含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸のポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む。一実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血漿である。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血液である。
本開示の他の実施形態は、サンプル中に存在し得るＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸を検出するためのキットであって、（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）ヌクレオチドモノマー、（ｃ）１つまたは複数のフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーとを含む１つまたは複数のプライマーセット、（ｄ）１つまたは複数のプローブ、および（ｅ）１つまたは複数の競合的結合オリゴヌクレオチドを含むキットに関する。他の実施形態において、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する。他の実施形態において、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、ポリＡテールを含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸のポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む。一実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血漿である。他の実施形態において、生物学的サンプルは、血液である。他の実施形態において、（ｉ）１つまたは複数のフォワードプライマーは、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉ）リバースプライマーとしても機能する少なくとも１つの逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３４、３５、４３、９４、９６、１１２、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１４１、１４２、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のプローブは、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ（ｉｖ）１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、９、１０、１１、１４、および１５から選択される群の核酸またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは２つの核酸配列を含み、２つの核酸配列は配列番号１５１および１５２の核酸配列またはそれらの相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号４３の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６、１１２、１１６および１１７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９４、９６、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１５１、１５３、１５５および１５７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１４２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１４１、１５３、１５７、１６１、１６３、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８８および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３５の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４および５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３４の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、９、１０、１１および１４から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１５１の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、１０、１１および１５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。
本開示の他の実施形態は、サンプル中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡを検出するためのキットであって、（ａ）核酸ポリメラーゼ、（ｂ）ヌクレオチドモノマー、（ｃ）１つまたは複数のフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーとを含む１つまたは複数のプライマーセット、（ｄ）１つまたは複数のプローブ、および（ｅ）１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含み、（ｉ）１つまたは複数のフォワードプライマーは、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉ）リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３４、３５、４３、９４、９６、１１２、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１４１、１４２、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、（ｉｉｉ）１つまたは複数のプローブは、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ（ｉｖ）１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、５、９、１０、１１、１４および１５の核酸配列またはその相補体を含む、方法に関する。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは２つの核酸配列を含み、２つの核酸配列は配列番号１５１および１５２の核酸配列またはそれらの相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号４３の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９６、１１２、１１６および１１７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号９４、９６、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１５１、１５３、１５５および１５７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１４２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１４１、１５３、１５７、１６１、１６３、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８８および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３５の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４および５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号３４の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、９、１０、１１および１４から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、配列番号１５１の核酸配列またはその相補体を含み、かつ１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、１０、１１および１５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む。他の実施形態において、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する。他の実施形態において、ｃｃｃＤＮＡはＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である。他の実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸は、ポリＡテールを含む。他の実施形態において、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーは、ＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸のポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む。他の実施形態において、サンプルは、生物学的サンプル、例えば血漿および／または血液である。
他の実施形態は、配列番号１～４００またはその相補体から選択されるヌクレオチドの配列を含むかまたはそれからなるオリゴヌクレオチドであって、１００以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。他の実施形態において、本開示は、配列番号１～４００またはその相補体の１つと少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％等）を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドであって、１００以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般的に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施形態では、プライマー核酸、ＲＴプライマー核酸、競合的ブロック核酸、プローブ核酸等であり得る。これらの特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは４０以下のヌクレオチド（例えば、３５以下のヌクレオチド、３０以下のヌクレオチド、２５以下のヌクレオチド、２０以下のヌクレオチド、１５以下のヌクレオチド等）を有する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの改変ヌクレオチドを有し、例えば、非改変ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変化させる。オリゴヌクレオチドは、任意に少なくとも１つの標識および／または任意に少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に改変された変異を含む。特定の核酸配列の「保存的に改変された変異」または単に「保存的変異」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列をコードする、または同一の機能を果たし得るおよび／またはわずかに改変された標的にハイブリダイズする（すなわち、標的遺伝的多様性）等のさらなる機能を有し得る、同一または本質的に同一の核酸配列を含む核酸を指す。当技術分野の当業者であれば、コードされた配列中の単一のヌクレオチドまたは低いパーセント比率のヌクレオチド（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％または１％未満）を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、改変がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的改変変異」であることを認識するであろう。
一態様において、増幅は、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用することができる。したがって、ドナー蛍光部分およびアクセプター部分、例えばクエンチャーは、プローブの長さに沿って互いに５～２０ヌクレオチド（例えば、８または１０ヌクレオチド）以内であり得る。他の態様において、プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、第１と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらし得る。この方法によれば、プローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。
本開示は、個体由来の生物学的サンプル中のＨＢＶ核酸、特にＨＢＶ ＲＮＡの存在または非存在を検出する方法を提供する。これらの方法は、血液スクリーニングおよび診断試験に使用するために、血漿中のＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の存在または非存在を検出するために使用することができる。さらに、同じ試験を当技術分野の当業者が使用して、尿および他の種類のサンプルを評価し、ＨＢＶまたはＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を検出および／または定量することができる。そのような種類のサンプルは、全血、血清、生検サンプル、細胞培養物、肝細胞等を含む、任意のそのようなサンプルを含むことができ、ＨＢＶ ＲＮＡ等のＨＢＶ核酸を見出し得る。また、そのような方法は、一般的に、増幅工程および色素結合工程を含む少なくとも１つのサイクリング工程を行うことを含む。典型的には、増幅工程は、核酸分子がサンプル中に存在する場合に１つまたは複数の増幅産物を生成する１つまたは複数対のオリゴヌクレオチドプライマーとサンプルを接触させることを含み、色素結合工程は、増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在または非存在を検出することを含み、結合の存在はサンプル中のＨＢＶまたはＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の存在を示し、結合の非存在はサンプル中のＨＢＶまたはＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の非存在を示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素としては、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、およびシアニン色素、例えばＹＯ－ＹＯ（登録商標）およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎが挙げられる。さらに、そのような方法はまた、増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素との間の融解温度を決定することを含むことができ、融解温度はＨＢＶまたはＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の存在または非存在を確認するものである。
さらなる実施形態において、ＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を含むＨＢＶの１つまたは複数の核酸を検出および／または定量するためのキット。キットは、遺伝子標的の増幅に特異的な１つまたは複数のプライマーまたはプライマーのセット、１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチド、および増幅産物の検出に特異的な１つまたは複数の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。プライマー、プローブまたはブロックオリゴヌクレオチドは、性能を改善するための改変塩基、例えばクランプもしくは安定化改変（例えば、ｐｄＵおよびロック核酸（ＬＮＡ））またはプローブおよびブロックオリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止する改変を含み得る。
一態様において、キットは、ドナーおよび対応するアクセプター部分、例えば他の蛍光部分または暗色クエンチャーで既に標識されているプローブを含むことができ、またはプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含み得る。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼおよび核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含むことができる。キットはまた、プライマー、プローブおよびフルオロフォア部分を使用してサンプル中のＨＢＶまたはＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ）の存在または非存在を検出するための添付文書および説明書を含んでいてもよい。
特段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を本主題の実施または試験で使用し得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定的であることは意図されない。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、図面および発明を実施するための形態、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、リバースプライマーとしても作用することができ、競合的ブロックオリゴヌクレオチドなしで標的ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するポリＴ部分を有するＲＴオリゴヌクレオチドを示すＨＢＶポリＡ標的アッセイ設計を示す。 図２は、リバースプライマーとしても作用することができ、競合的ブロックオリゴヌクレオチドと共に標的ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するポリＴ部分を有するＲＴオリゴヌクレオチドを示すＨＢＶポリＡ標的アッセイ設計を示す。 図３は、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイのリアルタイムＰＣＲ成長曲線を示しており、ＲＴプライマーおよび競合的ブロックオリゴヌクレオチドの存在下において、ポリＡテールを有するＨＢＶポリＡ部位配列を含有するＲＮＡ鋳型のより大量のコピーで出発すると、より多量のアンプリコンが産生されることを示す。 図４は、ＲＮＡ標的なしであるが２５万ＩＵのＨＢＶ ＤＮＡ（抽出および処理前のサンプルでは１００万ＩＵ／ｍＬに相当すると推定される）の存在下におけるＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイのリアルタイムＰＣＲ成長曲線を示し、ブロッカーなしの、ＲＴプライマーの存在下においてアンプリコンが産生されること（オフターゲットＤＮＡ増幅）、およびＲＴプライマーおよび競合ブロックオリゴヌクレオチドの存在下におけるアンプリコンが産生されないことを示す。 図５は、ＤＮＡのみのサンプル、混合ＤＮＡ＋ＲＮＡサンプル、または競合的ブロッカーを含む混合サンプルの条件下における、ＨＢＶ ＤＮＡに対する特異性を示すＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイのＣＴ値を示す。 図６は、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイの相対蛍光強度（ＲＦＩ）の比較を示し、ＤＮＡのみ（競合的ブロッカーありまたはなし）および混合ＤＮＡ＋ＲＮＡサンプル（競合的ブロッカーありまたはなし）の条件下におけるＨＢＶ ＤＮＡに対する特異性を示す。 図７は、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイのリアルタイムＰＣＲ成長曲線を示し、（上段）血清中１００／コピーｍＬのＲＮＡ標的であり、ブロッカーなしのＲＴプライマーの存在下におけるアンプリコンが産生されること、およびＲＴプライマーおよび競合的ブロックオリゴヌクレオチドの存在下で変化を示さないことを示し、（下段）ＲＮＡ標的は存在しないが、血清中の１０万ＩＵ／ｍＬのＨＢＶ ＤＮＡの存在下において、ブロッカーなしのＲＴプライマーの存在下で低シグナルアンプリコンが産生されること（オフターゲットＤＮＡ増幅）およびＲＴプライマーおよび競合的ブロックオリゴヌクレオチドの存在下ではアンプリコン産生がないことを示す。 図８は、抽出および処理前のサンプル中の１００コピー／ｍＬ ＲＮＡ鋳型と同等であると推定されるＲＮＡインプットレベルを有するＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイのリアルタイムＰＣＲ成長曲線を示し、サンプルは１２５ｎｇ／ｒｘｎのヒトＤＮＡバックグラウンドを含む。異なる設計および改変塩基を用いて４つの異なるＲＴ／リバースプライマーを試験し、オリゴ設計および化学改変の調整によって見られ得る性能改善が示されている。 図９は、競合的ブロックオリゴヌクレオチドを用いたＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイのＣＴ値を示し、混合ＤＮＡ＋ＲＮＡサンプルの条件下での高いＨＢＶ ＤＮＡインプットの耐性を示す。ＤＮＡを添加しない場合、このアッセイは、１×１０9コピー／ｍＬ～１０コピー／ｍＬのＨＢＶ ＲＮＡの線形性を示す。ＤＮＡを１×１０9ＩＵ／ｍＬの高レベルで添加した場合、ＲＮＡアッセイは、１００および１０コピー／ｍＬのＲＮＡを除いて影響を受けない。
核酸増幅によるＨＢＶ感染の診断は、ウイルス感染を迅速に、正確に、確実に、特異的に、および感度よく検出および／または定量する方法を提供する。非生物学的または生物学的サンプル中の相同ＨＢＶ ＤＮＡの存在下においてＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を検出するためのリアルタイムＰＣＲアッセイを本明細書に記載する。プライマー（ＲＴプライマーを含む）、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびＨＢＶを検出および／または定量するためのプローブが提供され、そのようなプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびプローブを含む製品またはキットが同様に提供される。他の方法と比較してＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異性および感度の上昇、ならびにサンプル含有および増幅産物のリアルタイム検出および定量を含むリアルタイムＰＣＲの改善された特徴によって、臨床検査室におけるＨＢＶ感染の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。さらに、ＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を検出するためのこのリアルタイムＰＣＲアッセイは、患者の状態（例えば、機能的治癒、滅菌治癒、および／または部分的治癒）に関する重要な情報を提供することができる。一例として、患者は、ヌクレオシド類似体処置によって枯渇したＤＮＡウイルス力価を有し得るが、感染肝細胞におけるｃｃｃＤＮＡの継続的な存在および転写活性を示す高い循環ＨＢＶ ＲＮＡレベルを保持しているために、治療の除去はＨＢＶの揺り戻しを引き起こす場合がある。他の例では、処置中の患者は、ＤＮＡマーカーとＲＮＡマーカーの両方が抑制されている可能性があり、これは、ｃｃｃＤＮＡが肝臓で枯渇しているが、ＨＢＶのコピーが組み込まれた細胞から産生されたＨｂｓＡｇを依然として有しているが、ｐｇＲＮＡおよび複製ウイルスを産生することはできないことを示している。
さらに、この技術は、血液スクリーニング並びに予後診断に使用することができる。このＨＢＶ ＲＮＡ検出アッセイはまた、他の核酸、例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶおよび他の肝炎ウイルス、例えばＨＡＶ、ＨＥＶおよび／またはＨＤＶ等を含むがこれらに限定されない他のウイルスの検出のための他のアッセイと並行して多重化することができる。
本開示は、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を用いてＨＢＶ ＲＮＡを特異的に同定するために、オリゴヌクレオチドプライマー（ＲＴプライマーを含む）、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびＨＢＶ核酸、特にＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）にハイブリダイズする蛍光標識加水分解プローブを含む。
開示される方法は、１つまたは複数のプライマー対を使用してサンプルからの核酸分子遺伝子標的の１つまたは複数の部分を増幅することを含む、少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「ＨＢＶプライマー」または「ＨＢＶ ＲＴプライマー」は、ＨＢＶまたはＨＢＶ ＲＮＡ（例えばＨＢＶ ｐｇＲＮＡ）に見られる核酸配列に特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下でそこから逆転写および／またはＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。標的化に適したＨＢＶに見られる核酸配列の例には、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡが含まれる。議論されるＨＢＶプライマー（ＲＴプライマーを含む）の各々は、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように標的にアニーリングする。１つまたは複数の増幅産物は、１つまたは複数の核酸がサンプル中に存在し、したがって１つまたは複数の増幅産物の存在がサンプル中のＨＢＶおよび／またはＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の存在を示す場合に産生される。増幅産物は、ＨＢＶおよび／またはＨＢＶ ＲＮＡの１つまたは複数の検出可能なプローブ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）に相補的な核酸配列を含むべきである。本明細書で使用される「ＨＢＶプローブ」は、ＨＢＶ標的核酸（例えば、ＨＢＶ ＲＮＡまたはＨＢＶ ｐｇＲＮＡ）に見られる核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、および検出工程を含み、ここで、サンプル中のＨＢＶおよび／またはＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の存在または非存在を検出するために、サンプルを１つまたは複数の検出可能なＨＢＶまたはＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）プローブと接触させる。
本明細書で使用される用語「ブロックオリゴヌクレオチド」（「競合的ブロックオリゴヌクレオチド」または「ブロッカー」）は、相補的ＤＮＡに特異的にアニーリングし、逆転写およびＤＮＡ重合を阻害する非伸長性オリゴヌクレオチドを指す。ブロックオリゴヌクレオチドの存在下では、サンプル中に存在し得る任意のＨＢＶ ＤＮＡがブロックオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによってＨＢＶ ＤＮＡを、ＨＢＶ ＤＮＡとＨＢＶ ＲＮＡの両方に一致する短い配列を含み得るＨＢＶ ＲＮＡのポリＡ結合部を標的とするプライマーに結合することができないようにする。したがって、ブロックオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在し得る相同ＨＢＶ ＤＮＡへのプライマー結合を防止する。本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、相同ＨＢＶ ＤＮＡ、例えばＨＢＶ ＤＮＡゲノムにハイブリダイズする。本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、増幅プライマーのＨＢＶ結合部分の一部または全部と重複するＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズまたは結合する。相同ＨＢＶ ＤＮＡに結合することによって、競合的ブロックオリゴヌクレオチドはＨＢＶ ＤＮＡ上の結合部位をブロックし、それによって本開示のプライマー（ＨＢＶ ＲＮＡにハイブリダイズする）が相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズするのを防ぐ。この効果は、プライマーが、より強力に結合するブロックオリゴヌクレオチドとの結合部位における競合のために相同ＨＢＶ ＤＮＡに効率的にハイブリダイズしないために、相同ＨＢＶ ＤＮＡが増幅されないことである（サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡが非常に過剰な濃度である場合を除く）。したがって、ＨＢＶ ＲＮＡを選択的に検出および増幅する本開示の方法は、ＨＢＶ ＲＮＡが非常に過剰な濃度である場合を除いて、混入している望ましくないＨＢＶ ＤＮＡを不注意に検出および増幅しない。本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは一本鎖であり、１５～１００ヌクレオチド、いくつかの実施形態では２０～８０ヌクレオチド、特定の実施形態では２０～７０ヌクレオチド長の範囲の様々な長さであり得る。例えば、本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、２４～６１ヌクレオチドの範囲であり得、配列番号１～１５のいずれか１つを含むかまたはこれからなり得る。本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、性能を改善するための改変ヌクレオチド、例えばクランプまたは安定化改変（例えば、ｐｄＵおよびロック核酸（ＬＮＡ））を含み得る。例えば、そのような改変安定化ヌクレオチドは、融解温度（Ｔm）および／または結合強度を高めるために含み得る。特定の実施形態において、本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の表１０～表１２に例示されるような改変を含む。さらに、本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、３’末端の伸長を妨げる改変も含み得る。非伸長性末端は、Ｃ３スペーサー、リン酸、ジデオキシヌクレオチドによって、または第２のオリゴヌクレオチドの３’末端をオリゴヌクレオチドの３末端に結合すること等によって促進され得る。いくつかの実施形態において、本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、伸長を妨げるように３’末端に非伸長性Ｃ３スペーサーを付加することによって改変される。特定の実施形態において、本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１５またはその相補体を含むか、またはそれらからなり、特に、配列番号１～５、９～１１、１４および１５またはそれらの相補体を含むかまたはそれらからなり、非伸長性Ｃ３スペーサーを３’末端に付加することによって改変される（例えば、図２を参照されたい）。特定の実施形態において、本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１～１５またはその相補体を含むか、またはそれらからなり、特に、配列番号１～５、９～１１、１４および１５またはそれらの相補体を含むかまたはそれらからなり、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含み、かつ非伸長性Ｃ３スペーサーを３’末端に付加することによって改変される（例えば、図２を参照されたい）。この方法によって、本開示の競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼの存在下では伸長されず、核酸ポリメラーゼは、それらの標的（例えば、ＨＢＶ ＲＮＡ特異的プライマー）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーのみを伸長する。したがって、核酸ポリメラーゼの存在下において本開示のブロックオリゴヌクレオチドは、標的ＨＢＶ ＲＮＡの増幅を可能にしながら、生物学的サンプル中のＨＢＶ ＤＮＡの増幅を効率的に遮断することができる。さらに、競合的ブロックオリゴヌクレオチドの使用によって、ＨＢＶ ＲＮＡとＤＮＡとを区別することができるＨＢＶ ＲＮＡアッセイが効果的に可能になる。したがって、開示される競合的ブロックオリゴヌクレオチドの使用は、分離工程（例えば、カラムまたはスピンカラムを使用する）またはＤＮＡの酵素消化のいずれかによってＤＮＡを除去する工程を必要としないため、従来のＤＮＡ除去技術に対する実質的な改善である。
本明細書で使用される用語「増幅する」は、鋳型核酸分子（例えば、ＨＢＶゲノムおよび／またはＨＢＶ ＲＮＡからの核酸分子（特に、ｐｇＲＮＡ等の、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ））の一方または両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、および増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）ならびにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液および／または補因子（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＫＣｌ）の存在が必要である。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる改変オリゴヌクレオチドも指しており、すなわち、オリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、そこに、３’から５’へのホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって更に「ヌクレオチド」が結合され得て、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される。いくつかの実施形態において、プライマーは逆転写（ＲＴ）プライマー（ＲＴプライマー）でもある。オリゴ（ｄＴ）Ｎプライマー、固定オリゴ（ｄＴ）Ｎプライマー、ランダムヘキサマープライマー、および配列特異的プライマーを含む、当技術分野で公知のいくつかの種類のＲＴプライマーが存在する。いくつかの実施形態において、ＲＴプライマーは、ＲＮＡ（例えば、ＨＢＶ ＲＮＡ、特にｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）にアニーリングし、伸長してＤＮＡ相補体を生成する（すなわち、標的の逆転写）。いくつかの実施形態において、ＲＴプライマーはポリＡ含有ＨＢＶ ＲＮＡを標的とし、したがってＲＴプライマーはポリＴ含有オリゴヌクレオチドである。
用語「ハイブリダイズする」は、増幅産物への１つまたは複数のプローブのアニーリングを指す。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「５’から３’ヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、すなわち、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、必要に応じて酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに用いることもできる。
用語「その相補体」は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の用語「伸長」または「延長」は、追加のヌクレオチド（または他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、ヌクレオチドを取り込む生体触媒によって、例えば、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼによって、任意に伸長される。
２以上の核酸配列の文脈における用語「同一」または「同一性」パーセントは、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは目視検査によって測定して最大の一致に関して比較およびアラインメントした場合に、同一または特定パーセンテージの同一ヌクレオチドを有する２以上の配列または部分配列を指す。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載されている。
オリゴヌクレオチドの文脈における「改変ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置換される変化を指す。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド中で置換され得る例示的な改変ヌクレオチドとしては、例えば、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシ－キサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボ－Ｕ、２’－０－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡ、５－プロピニルｄＵ、および５－プロピニルｄＣ等が挙げられる。改変されたヌクレオチドの他の例としては、ロック核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。ＬＮＡ（アクセス不能ＲＮＡとしても知られる）は、リボース部分が２’酸素と４’炭素とを接続する過剰な架橋で改変された改変ＲＮＡヌクレオチドである。この架橋は、Ａ型二重鎖にしばしば見られる３’－エンド（Ｎｏｒｔｈ）確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）においてリボースをロックする。ＬＮＡの効果は、ロックされたリボース配座が、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（融解温度）を有意に増加させる塩基のスタッキングおよび骨格の事前編成を増強することである。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の改変ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、または当技術分野で知られている。特定の実施形態において、改変ヌクレオチド置換は、対応する改変されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔm）を改変する。さらに説明すると、特定の改変ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態において、非特異的核酸増幅を減少させ（例えば、プライマーダイマー形成等を最小限に抑える）、意図する標的アンプリコンの収率を増加させること等ができる。これらの種類の核酸改変の例は、例えば、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。他の改変ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変化させ得るか、または他の望ましい特徴を提供し得る。例えば、いくつかの改変は、オリゴヌクレオチドを非伸長性にすることができ、これはプローブおよび競合的ブロックオリゴヌクレオチドに有用である。非伸長性末端は、Ｃ３スペーサー、リン酸、ジデオキシヌクレオチドに加えて、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端をオリゴヌクレオチドの３末端に結合すること等によって促進し得る。
ＨＢＶ標的核酸の検出
本開示は、例えば、ポリＡテール（例えば、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）に隣接するＨＢＶ核酸配列の一部を増幅することによってＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を検出する方法を提供する。具体的には、ＨＢＶ核酸分子標的を増幅および検出するためのプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチドおよびプローブが本開示の実施形態によって提供される。
ＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の検出のために、ＨＢＶ標的核酸例えばＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を増幅するためのプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびプローブが提供される。本明細書に例示されるもの以外のＨＢＶ核酸も、サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を検出するために使用することができる。例えば、機能的バリアントは、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的バリアントは、例えば、本明細書に開示されるＨＢＶ核酸における１つまたは複数の欠失、挿入および／または置換を含み得る。
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１～３９２から選択される配列を有する核酸、配列番号１～３９２の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一のバリアント、または配列番号１～１９２の相補体およびバリアントを含む。例えば、ポリＡ結合プライマーのポリＴ伸長部中のＴの数は変化してよく（８、１０、１２、１５、１７、および１８等）、ポリＡテールの接合部におけるＨＢＶ結合または他のアンカーの存在および長さは変化してよく（５、７、および８ｂｐ長等）、プライマー中の改変塩基の存在、種類、数および位置は変化し得る。
一実施形態において、ＨＢＶプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびプローブの上記のセットは、ＨＢＶを含むと疑われる生物学的サンプル（Ｎが任意のヌクレオチドを指すことを意味する、配列表）中のＨＢＶ ＲＮＡ（特に、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の検出を提供するために使用される。プライマー、競合的ブロッキングオリゴヌクレオチド、およびプローブのセットは、配列番号１～３９２の核酸配列を含むかまたはそれからなる、プライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびＨＢＶ核酸配列（例えば、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡなどのＨＢＶ ＲＮＡ）に特異的なプローブを含むかまたはそれからなり得る。他の実施形態では、プライマー、競合的ブロッキングオリゴヌクレオチド、およびＨＢＶ標的に対するプローブ（ＨＢＶ ＲＮＡ、例えばｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ））は、配列番号１～３９２のプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントを含むか、またはそれらからなる。
配列番号１～３９２のプライマー（ＲＴプライマーを含む）、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、および／またはプローブのいずれかの機能的に活性なバリアントは、開示される方法においてプライマー（ＲＴプライマーを含む）、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、および／またはプローブを使用することによって同定され得る。配列番号１～３９２のいずれかのプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチドおよび／またはプローブの機能的に活性なバリアントは、配列番号１～３９２のそれぞれの配列と比較して、記載の方法またはキットにおいて、類似しているか、またはより高い特異性および感度を提供するプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチドおよび／またはプローブに関する。
バリアントは、例えば、配列番号１～３９２のそれぞれの配列の５’末端および／または３’末端における１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失または置換等の１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失または置換によって、配列番号１～３９２の配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー（ＲＴプライマーを含む）、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、および／またはプローブは化学的に改変されていてもよく、すなわちプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、および／またはプローブは改変ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。プライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、および／またはプローブは、改変オリゴヌクレオチドである。「改変ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類似体」）は、いくつかの改変によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基もしくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖もしくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分もしくはリン酸様部分、またはそれらの組合せからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「改変ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば７－デアザプリンで置き換えられてもよく、それによっても同様に「改変ヌクレオチド」が得られる。用語「改変ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類似体」は、本出願において互換的に使用される。「改変ヌクレオシド」（または「ヌクレオシド類似体」）は、「改変ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類似体」）について上に概説したように、何らかの改変によって天然のヌクレオシドとは異なる。
ＨＢＶ標的をコードする核酸分子を増幅する改変オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，Ｃｏｌｏ．）等のコンピュータプログラムを使用して設計し得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に正確性が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０ヌクレオチド長）である。
アッセイにおいて、「競合的ブロックオリゴヌクレオチド」、「競合的ブロックヌクレオチド」、「競合的ブロック核酸」、「ブロックオリゴヌクレオチド」、「ブロックヌクレオチド」、「ブロッカー」、および／または「ブロック核酸」が使用され、競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、プライマー（例えば、ＲＴプライマー）によって標的化される領域と同一であるが、例えばＲＴプライマーにポリＡ配列を含まず、代わりに対応するゲノム配列に伸長することによって、ＲＴプライマーよりも高いＤＮＡ親和性を有する相同ゲノムＨＢＶ ＤＮＡ内の領域に結合することを指す用語である。すなわち、競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、標的領域への結合についてプライマーと競合するが、設計は、競合的ブロックオリゴヌクレオチドがＤＮＡに対してより大きい親和性を有する一方で、ＲＴプライマーがＲＮＡに対してより大きい親和性を有することを可能にするように（例えば、結合した配列の長さ、Ｔmまたは位置の違い等）行うことができる。競合的ブロックオリゴヌクレオチドが相同ゲノムＨＢＶ ＤＮＡに結合することによって、プライマー（例えば、ＲＴプライマー）の結合が妨げられ、それによって相同ゲノムＨＢＶ ＤＮＡの望ましくない増幅が減少および／防止され。
ＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡ由来のＨＢＶ）等のＨＢＶ核酸の存在または非存在を検出するためのフォワードプライマーのセットは、配列番号２０、２３、２４、２１０、２１３、２１４、３８７、および３８９の配列を含む。ＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡ由来のＨＢＶ）等のＨＢＶ核酸の存在または非存在を検出するためのＲＴ／リバースプライマーのセットは、配列番号１６、１８、１９、２５～３０、３３～１９０、２０６、２０８、２０９、２１５～２２０および２２３～３８０の配列を含む。ＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡ由来のＨＢＶ）等のＨＢＶ核酸の存在または非存在を検出するための競合的ブロックオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号１～１５、２１、２２、１９１～２０５、２１１および２１２の配列を含む。ＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡ由来のＨＢＶ）等のＨＢＶ核酸の存在または非存在を検出するためのプローブのセットは、配列番号１７、３１、３２、２０７、２２１、２２２、３８１～３８６、３８８および３９０～３９２の配列を含む。
１セットのプライマーおよび競合的ブロックオリゴヌクレオチドに加えて、方法は、ＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡ由来のＨＢＶ）等のＨＢＶ核酸の存在または非存在を検出するために１つまたは複数のプローブを使用することができる。用語「プローブ」は、合成的または生物学的に産生された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指し、これは、設計または選択により、規定される所定のストリンジェンシーの下で特異的に（すなわち、優先的に）、「標的核酸」に、この場合はＨＢＶ核酸（ＨＢＶ ＲＮＡ、例えばｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）（標的）核酸にハイブリダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
いくつかの実施形態において、記載されるＨＢＶ核酸プローブ（ｐｇＲＮＡ等の、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ等のＨＢＶ ＲＮＡのためのプローブを含む）は、少なくとも１つの蛍光標識で標識することができる。一実施形態において、ＨＢＶ核酸プローブ（ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ等のＨＢＶ ＲＮＡのためのプローブを含む）は、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、および対応するアクセプター部分、例えばクエンチャーを用いて標識することができる。一実施形態において、プローブは蛍光部分を含むか、またはそれからなり、核酸配列は配列番号１７、３１、３２、２０７、２２１、２２２、３８１～３８６、３８８および３９０～３９２を含むか、またはそれからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブまたは一対のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、使用するプローブは、少なくとも１つの標識および／または少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常増幅方法の熱サイクリングパラメーターに適切な融解温度を有し、各プローブの長さは配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に正確性が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般的に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。
コンストラクトは、ＨＢＶに対するプライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびプローブ核酸分子（例えば、配列番号１～３９２）の配列の１つまたは複数をそれぞれ含むベクターを含み得る。コンストラクトは、例えば、対照鋳型核酸分子として使用することができる。使用に適したベクターは、市販されている、および／または当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって製造される。ＨＢＶ核酸分子は、例えば、化学合成、ＨＢＶからの直接クローニング、または核酸増幅によって得ることができる。
本方法での使用に適したコンストラクトは、典型的には、ＨＢＶ核酸分子（例えば、配列番号１～３９２の１つまたは複数の配列を含む核酸分子）に加えて、所望のコンストラクトおよび／または形質転換体を選択するための選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、ならびに複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性および回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
ＨＢＶ核酸分子を含有するコンストラクトを、宿主細胞内で増殖させ得る。本明細書で使用される宿主細胞という用語は、原核生物および真核生物、例えば酵母、植物および動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ＣＯＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、ならびにアラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）およびニコチアナ タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）などの植物細胞が挙げられる。コンストラクトを、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。さらに、ネイキッドＤＮＡを細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号参照）。
コンストラクト（プラスミドベクター）を使用して、インビトロ転写または他のプロセスを介してＲＮＡ分子を生成し、プライマーおよびプローブの結合部位も含み得るＲＮＡ鋳型を生成することができる。ＲＮＡ鋳型分子も合成によって作製することができる。対照材料として作成することができるＲＮＡ鋳型の種類は、外装ＲＮＡ（タンパク質コート内に封入されたＲＮＡ分子）であり、コンストラクト（例えば、細菌宿主中）によるＲＮＡおよびコートタンパク質（例えば、ウイルスカプシドタンパク質）の産生、およびＲＮＡ分子を封入するコートタンパク質の構築を伴う。ＤＮＡ分子は、対照材料として使用するためにタンパク質コートに封入することもできる。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態において有用なプライマーには、記載されるＨＢＶ核酸配列内の核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドが含まれる（例えば、配列番号１５、１８～２０、２３～３０、３３～１９０、２０６、２０８～２１０、２１３～２２０および２２３～３８０）。いくつかの実施形態において、プライマーは逆転写（ＲＴ）プライマー（ＲＴプライマー）である。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、または合成的に産生することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、二本鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長などの反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒～４分間（例えば、１分～２分３０秒、または１．５分）行われる。
二本鎖の鋳型核酸が熱により変性された場合、反応混合物は、その標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却される。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。必要に応じて、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な生成物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長産物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、一般的に、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。
レトロウイルスまたはＲＮＡウイルスのゲノムは、リボ核酸、すなわちＲＮＡから構成される。ＨＢＶは、ウイルス複製のために宿主酵素によって作られるＲＮＡを必要とする、その複製過程において逆転写を依然として使用する非レトロウイルスであるパラレトロウイルスである。そのような場合、鋳型核酸であるＲＮＡは、酵素逆転写酵素の作用を介して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に最初に転写されなければならない。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型およびＲＮＡの３’末端に相補的な短いプライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡの合成を指示し、次いでこれをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として直接使用することができる。ＲＮＡの一般的な調製のために、プライマーはまた、方法に応じて、ランダムまたはアッセイ／標的特異的であり得る。
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡ（例えばＨＢＶ ｐｇＲＮＡ）またはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）等の核酸を用いることができる。鋳型核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれるＨＢＶ核酸等の複合混合物の微量画分であり得る。ＨＢＶ核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているもの等の日常的な技術によって生物学的サンプルから抽出され得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、または、細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、または植物もしくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号２０、２３、２４、２１０、２１３、２１４、３８７および３８９を含むフォワードプライマ、および配列番号１６、１８、１９、２５～３０、３３～１９０、２０６、２０８、２０９、２１５～２２０および２２３～３８０を含むＲＴ／リバースプライマー）を、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般的に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇの変性された鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼおよび１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはそれらの１つまたは複数の類似体を含有する。
新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。標的ＨＢＶ核酸分子（ＨＢＶ ＲＮＡ、例えばＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む）に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、および伸長の工程を必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、サンプルの性質による。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。一般的に、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、または１００回繰り返してもよい。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、および同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それを可視化することができ、または他の方法で検出および／または定量することができるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分（例えば、ＦＡＭ）と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で伝達されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャー（例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）（例えば、ＢＨＱ２））とを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’ヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、および同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーク・クエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）（例えば、ＢＨＱ２）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。
他の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、ＨＢＶ ＲＮＡ標的ＲＮＡ標的核酸配列（ＨＢＶ ＲＮＡ、例えばｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラーおよび特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、または蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、または蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングした他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナー部分および対応するアクセプター部分に関して本明細書で使用される場合、「対応する」とは、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分またはダーク・クエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を行うことができる。
蛍光ドナー部分および対応するアクセプター部分は、一般的に、（ａ）高効率Ｆｏｅｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト、および（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、ドナー蛍光部分は、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍまたはアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、および、その蛍光発光の対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するものを選択することができる。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、および可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有するものを選択することができる。
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、および４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、またはテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。
ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすため、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般的に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、および蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。
ＬＣ Ｒｅｄ６４０等のアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセイン等のドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧ等の、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、またはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）増幅産物（アンプリコン）の検出
本開示は、生物学的または非生物学的サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等の転写されたｃｃｃＤＮＡ由来のＨＢＶ ＲＮＡ）の存在または非存在を検出する方法を提供する。提供される方法は、サンプルの汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。上記方法は、１つまたは複数のＨＢＶプライマー対を使用してサンプルからのＨＢＶ標的核酸分子（例えばＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程、およびＦＲＥＴ検出工程を実施することを含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。ＨＢＶプライマーおよびプローブを使用してＨＢＶ標的核酸分子（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の存在を検出する方法を実施することができ、ＨＢＶ標的核酸分子（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の検出は、サンプル中のＨＢＶ標的核酸分子（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の存在を示す。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在または非存在、したがってＨＢＶウイルス（特に、ＨＢＶ核酸、例えばＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ））の存在または非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１つの蛍光色素（例えばＨＥＸ）および１つのクエンチャー（例えばＢＨＱ）で標識された１つの１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用し、これは蛍光性であってもよく、そうなくてもよい。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分またはダーク・クエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’ヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中のＨＢＶ標的核酸分子（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含むｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ ＲＮＡ）の存在または非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分および第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部位が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。
ＦＲＥＴ技術の別の一般的な形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般的に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ６４０）またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ７０５）に伝達する。次いで、アクセプター蛍光部分はより長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子の数（例えば、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のＨＢＶ ＲＮＡ転写物の数）と相関していてもよい。ＨＢＶ標的核酸（ＨＢＶ ＲＮＡ、例えばＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む）の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズ工程によって、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルがもたらされる。
一般的に、ＦＲＥＴの存在は、サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡ（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の存在を示し、かつ、ＦＲＥＴの非存在は、サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡ分子（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）の非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、または特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功および／または精度に影響を及ぼし得る条件である。
本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、呼吸器検体、尿、糞便検体、血液検体、血漿、血清、皮膚スワブ、鼻スワブ、創傷スワブ、血液培養物、乾燥血液スポット、皮膚および軟部組織感染物が挙げられるが、これらに限定されない。他の生物学的サンプルは、細胞培養物および血漿分離カードまたは乾燥血液スポットを含み得る。生物学的サンプルの収集および保存方法は、当技術分野の当業者に知られている。生物学的サンプルを（例えば、当技術分野で知られている核酸抽出方法および／またはキットによって）処理して核酸（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む、ｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を放出させることができ、または一部の場合では、生物学的サンプルをＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させることができる。
融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含めることができる追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、ＧおよびＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、ＡおよびＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定することができる。ＨＢＶ増幅産物からのＨＢＶプローブの融解温度（複数可）により、サンプル中のＨＢＶの有無を確認し得る。
各サーモサイクラーランの間に、対照サンプルも同様にサイクルすることができる。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅することができる。陽性対照サンプルはまた、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築物を増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマーおよびプローブを使用して、内部で（例えば、サンプル中で）または患者のサンプルと並んで実行される別々のサンプルランで増幅することができる。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび／またはＦＲＥＴ反応の成功または失敗の指標である。各サーモサイクラーランはまた、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含むことができる。陰性対照は汚染を測定することができる。これにより、システムおよび試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、並びにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定することができる。
一実施形態において、本方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラーランと次のサーモサイクラーランとの間の汚染を低減または排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号および同第５，９４５，３１３号に記載されている。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施することができる。一実施形態において、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願、国際公開題９７／４６７０７号、同第９７／４６７１４号、および同第９７／４６７１２号には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲが記載されている。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して操作することができる。サンプルからのシグナルは、機械が光学ユニット上にキャピラリーを順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全てのサンプルについて連続的に更新することができる。生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＩＩ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍは、ＰＣワークステーションを使用して操作することもできる。機器はサーマルブロックサイクラーを有し、ペルチェ素子を使用して加熱および冷却が達成される。サンプルからの蛍光シグナルは、広域スペクトルにわたって光を発する高強度キセノンランプを使用して９６ウェルプレートから得られる。特定の励起および発光のための内蔵フィルタの柔軟な組合せによって、様々な蛍光色素および検出フォーマットの使用が可能になる。ソフトウェアは、蛍光シグナルを表示し、ＣＴ値を計算することができ、生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））等の二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素等の二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
当業者は、他の核酸またはシグナル増幅方法も使用され得ることを理解するであろう。そのような方法の例としては、分岐ＤＮＡシグナル増幅、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、またはスマート増幅プロセスバージョン２（ＳＭＡＰ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の実施形態は、１つまたは複数の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
製品／キット
本開示の実施形態はさらに、ＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を検出するための製品またはキットを提供する。製品は、適切な包装材料と共に、ＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）標的を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含むことができる。ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡを含むＨＢＶ ＲＮＡを検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、ＨＢＶ標的核酸分子（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）にハイブリダイズすることができる。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素およびＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーションおよび検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法は本明細書に開示されており、ＨＢＶ標的核酸分子（ＨＢＶ ＲＮＡ、例えばＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡ）を増幅してハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
製品はまた、プローブを標識するための１つまたは複数の蛍光部分を含むことができるか、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識することができる。例えば、製品は、ＨＢＶプローブ（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のＨＢＶ ＲＮＡを標的とするプローブを含み得る）を標識するためのドナーおよび／またはアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。
製品はまた、サンプル中のＨＢＶ（ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のＨＢＶ ＲＮＡを含む）を検出するプライマーおよびプローブを使用するための説明書を有する添付文書または包装ラベルを含むことができる。製品は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、または汚染を防止するための薬剤）をさらに含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１つに特異的であり得る。
本開示の実施形態はまた、サンプル中のＨＢＶ ｐｇＲＮＡ等のｃｃｃＤＮＡから転写されたＨＢＶ ＲＮＡを含むＨＢＶ ＲＮＡを検出するためのプライマーセットおよび１つまたは複数の検出可能なプローブを提供する。他のポリＡ部位、例えば、組み込まれたＨＢＶコピーに由来し得るＨＢＶ転写物の二次または切断ポリＡ部位を標的とする、さらなるプライマーおよびプローブを提供することができる。
本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
以下の実施例および図面は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加え得ることが理解される。
ＨＢＶの標的領域には、ｐｇＲＮＡ等のＨＢＶ ＲＮＡが含まれる。全ての核酸配列を整列させ、全てのプライマーおよびプローブを考慮し、全ての公知のＨＢＶ分離株および他の特性について予測される包括性についてスコア化した。
実施例１：ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイの設計
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。標的は、図１および図２に示すように、ＨＢＶ ＲＮＡ（例えば、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡを含む標準的なポリＡテールを有するＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡに由来するＨＢＶ ＲＮＡ）である。アッセイは、ポリＡテールを含有するスプライスバリアントおよびｍＲＮＡを含む他のＲＮＡも検出することができる。ＲＴプライマーは、リバースプライマーとしても作用することができ、標的ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を有する（例えば、図１および２に示すようなＨＢＶ ｐｇＲＮＡ）。ＲＴプライマーのＨＢＶ特異的配列は、ＨＢＶに特異性を提供し、ヒトおよび他のポリＡテールＲＮＡまたはゲノム中のホモポリマーの伸長部へのＲＴ／リバースプライマー結合を減少させるように設計されているが、ＨＢＶ特異的配列が長いほど、ＨＢＶ ＤＮＡに結合する可能性が高くなる。実際、短いＨＢＶ特異的配列であっても、ＤＮＡが高濃度である場合、オフターゲット（すなわち、望ましくない）ＨＢＶ ＤＮＡを増幅する能力が実証されている。ＲＴオリゴにタグ配列を任意に付加することができ、その結果、より効率的なＰＣＲ増幅のために異なる非ＨＢＶ配列リバースプライマー設計を使用することができるようになっている。
競合的ブロックオリゴヌクレオチドの概念を組み込んで、ポリＡ検出セットのＲＴプライマー／リバースプライマーの代わりにＨＢＶ ＤＮＡゲノムに優先的に結合することによって、ＨＢＶ ＤＮＡの増幅を減少させた（図２を参照されたい）。この競合的ブロックオリゴヌクレオチドは、非伸長性であるように設計されているため、プライマーとして作用しない。これは、例えば、３’末端にＣ３スペーサーを付加することによって達成され得る（リン酸基または他の結合基または改変も同じ目的のために使用し得る）。この実施例において、競合的ブロックオリゴヌクレオチド添加によって、その意図された標的に対するアッセイの特異性を増加させることが示されている。この概念は、本実施例ではＨＢＶ ＲＮＡのポリＡ標的に適用されるが、他の標的のための他のポリＡ設計、または他の競合的鋳型または干渉状況、例えば、ＤＮＡゲノムも増幅されることを可能にする短いイントロンを有するスプライシングされたＲＮＡ標的、パラログ遺伝子または標的に関連する偽遺伝子を有する状況、または１つが標的化され、他は標的化されない混合遺伝子型もしくは関連生物を有するサンプルに適用可能であり得る。
本開示の全ての例において、ＨＢＶ ＲＮＡを検出および増幅するために使用されたポリメラーゼは、Ｚ０５Ｄとして知られる改変ＴｈｅｒｍｕｓＺ０５ポリメラーゼであった。Ｚ０５Ｄ改変ポリメラーゼは、野生型ＴｈｅｒｍｕｓＺ０５ポリメラーゼ配列の配列を有するが、米国特許第８，９６２，２９３号に記載されているように、Ｄ５８０Ｇ改変を有する。Ｚ０５Ｄポリメラーゼは、逆転写酵素（ＲＴ）およびポリメラーゼ（ＤＮＡ増幅）の両方の能力を有する核酸ポリメラーゼである。用語「核酸ポリメラーゼ」 は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ、ならびに逆転写酵素（ＲＴ）およびポリメラーゼ（ＤＮＡ増幅）能力を示すポリメラーゼ、例えば本開示の例で使用されるＺ０５Ｄポリメラーゼを含む、核酸をポリメラーゼすることができる任意のポリメラーゼ酵素を指す。逆転写酵素（ＲＴ）およびポリメラーゼ（ＤＮＡ増幅）能力を示す任意のポリメラーゼを本開示で使用して、ＨＢＶ ＲＮＡを検出および増幅することができる。
実施例２：競合的ブロックオリゴヌクレオチドを用いたＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイの感度および線形範囲
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、競合的ブロックオリゴヌクレオチドの存在下において、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ３’末端ポリＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。アッセイの感度および線形範囲を確認した（図３）。
リアルタイムＰＣＲアッセイに使用したサンプルは、ポリＡテール配列を含むＨＢＶ ｐｇＲＮＡ ３’末端コンストラクトの配列を含む外装ＲＮＡのコピーであった。鋳型を様々な濃度（１×１０0コピー／ｍＬ、１×１０1コピー／ｍＬ、１×１０2コピー／ｍＬ等、最大１×１０9コピー／ｍＬ）で陰性ヒト血漿に添加し、抽出し、コバルト（登録商標）６８００／８８００でのＰＣＲ反応に溶出した。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。
リアルタイムＰＣＲアッセイに使用したＨＢＶ ｐｇＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共に、ＲＴ／リバースプライマーＨＢＶ＿ＰＡ－Ｖ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１（配列番号１５２）およびＨＢＶ＿ＰＡ－Ｖ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１＿ＭＩＸ（配列番号１５１）であった。ＨＢＶ ＲＮＡ配列の３’末端における共通の置換がいくつかのプライマー設計の性能に影響を及ぼし得るため、この実験およびいくつかの他の実験においては２つのリバースプライマーが使用される。バリアントをカバーする塩基変化を有する対になったプライマーは、サンプル中のこの置換の潜在的影響を低下させる。したがって、１つのリバースプライマーの代わりに２つのリバースプライマーを使用することにより、ＨＢＶ ＲＮＡ配列の３’末端で一般的に観察される置換を有するバリアントへのハイブリダイゼーションが可能になる。すなわち、ただ１つのリバースプライマーの代わりに１つを超える（すなわち、２つの）リバースプライマーを使用することによって、ＨＢＶ ＲＮＡ配列の３’末端における一般的な置換の複雑さが克服される。一般的に、複数の変異（一般的または稀な変異、置換、または他の変異型を含む）をカバーするために複数のプライマーを使用することが有用であり得る。競合的ブロックオリゴヌクレオチド「２５－１」（配列番号１１）を、内部対照のオリゴヌクレオチド（図示せず）と同様にマスターミックスに含めた。結果を、以下の表４に示す。
Figure 2022546443000005
データは、ポリＡテールを有するＨＢＶポリＡ部位配列を含むＨＢＶ ｐｇＲＮＡ転写物に対するポリＡ標的ＰＣＲアッセイ設計の一例の性能を示す。図３に示す結果は、アッセイの線形範囲ならびに感度を反映して、（用量依存的な様式で）多量の出発ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ転写物によるより大きなアンプリコン産生を示す。
したがって、図３に示すこれらの結果は、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、プライマー、競合的ブロックオリゴヌクレオチド、およびプローブ（配列番号１１、１５１、１５２、３８７および３８８）がＨＢＶ ｐｇＲＮＡ３の存在を検出することを実証する、リアルタイムシングルプレックスＰＣＲ成長曲線を示す。
実施例３：競合的ブロックオリゴヌクレオチドを用いたＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイの特異性
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。アッセイの特異性を、ＨＢＶ ＤＮＡのみのサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。
反応は、ＨＢＶ ＤＮＡ鋳型（外装ＤＮＡ）上で２５万ＩＵ／ｒｘｎで行い、抽出および処理工程前のサンプル中の１００万ＩＵ／ｍＬのインプットと同等であると推定された。リアルタイムＰＣＲアッセイに使用したＨＢＶＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ特異的なフォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共に、ＲＴ／リバースプライマーＨＢＶ＿ＰＡ－Ｚ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１＿ＭＩＸ（配列番号９６）であった。競合的ブロックオリゴヌクレオチド「２５－１」（配列番号１１）を用いて、および用いずに、同じマスターミックスをランした。結果を、以下の表５に示す。
Figure 2022546443000006
アッセイ比較をＬＣ４８０ ＰＣＲ機器で行った。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、１５０ｎＭ～３００ｎＭの範囲であった。結果は、ブロッカーなしのＲＴプライマーの存在下におけるアンプリコンが産生されること（オフターゲットＤＮＡ増幅）、およびＲＴプライマーおよび競合的ブロックオリゴヌクレオチドの存在下でアンプリコンが産生されないことを示す。
図４に示すこれらの結果は、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイに対するＨＢＶ ＤＮＡに対する特異性、およびマスターミックス中の競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含む可能性のある改善を実証する。したがって、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ＲＮＡに特異的であり、ＨＢＶ ＤＮＡに特異的である。
実施例４：競合的ブロックオリゴヌクレオチドを用いたＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイの特異性および混合鋳型結果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。アッセイの特異性は、ＣＴ値によって反映されるように、ＨＢＶ ＲＮＡ（標的）およびＨＢＶ ＤＮＡ（非標的）鋳型が混合されたサンプルに対するＰＣＲ性能によって確認した。
シングルプレックスリアルタイムＰＣＲアッセイに使用したサンプルは、１×１０3転写物／ｒｘｎのＨＢＶ ｐｇＲＮＡ転写物のコピーおよび様々なレベルのＨＢＶ ＤＮＡコンストラクト（図５のｘ軸に示す）であった。ＲＮＡアッセイは、転写物上のポリＡ部位を検出し、ＤＮＡの拾い上げに耐性があるように設計され、ＲＮＡ標的に対する特異性を高めるために、いくつかの条件（図５の説明文に示されている）において競合ブロックオリゴヌクレオチドをアッセイに添加する。リアルタイムＰＣＲアッセイに使用したＨＢＶ ＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ特異的なフォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共に、ＲＴ／リバースプライマーＨＢＶ＿ＰＡ－Ｚ＿２５＿３５１（配列番号４３）であった。競合的ブロックオリゴヌクレオチド ＨＢＶｐＡ＿ｂｌｏｃｋ２（配列番号２）を用いて、および用いずに、同じマスターミックスをランした。
混合サンプルおよびＲＮＡアッセイ（図５では、それぞれ正方形およびＸマーカーとして示されている）のＣT値は、最大１×１０6コピーのＤＮＡ のＲＮＡのみの結果（ＤＮＡインプットを増加させたにも関わらず、閾値までのシグナルがＲＮＡのみからであり、ＤＮＡ交差反応からの寄与は有意ではないことを示す）（図５参照）と一致した。使用した対照は、混合サンプルでのＤＮＡアッセイ（図５の円）であり、予想されるように、より高いＤＮＡインプットによる初期のＣＴを示す。
図５に示すこれらの結果は、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイに対するＨＢＶ ＲＮＡに対する特異性、およびマスターミックス中の競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含む可能性のある改善を実証する。したがって、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ＲＮＡおよびＨＢＶ ＤＮＡに特異的である（最大がＨＢＶ ＤＮＡの特定の力価）。
実施例５：競合的ブロックオリゴヌクレオチドを用いたＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイの特異性および混合鋳型蛍光結果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。アッセイの特異性は、ＨＢＶ ＲＮＡ（標的）およびＨＢＶ ＤＮＡ（非標的）鋳型が混合されたサンプルまたはＨＢＶ ＤＮＡのみのサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。
シングルプレックスリアルタイムＰＣＲアッセイに使用したサンプルは、１×１０3転写物／ｒｘｎのＨＢＶ ｐｇＲＮＡ転写物のコピーおよび様々なレベルのＨＢＶ ＤＮＡコンストラクト（図６のｘ軸に示す）であった。ＲＮＡアッセイは、転写物上のポリＡ部位を検出し、ＤＮＡの拾い上げに耐性があるように設計され、ＲＮＡ標的に対する特異性を高めるために、いくつかの条件（図６の説明文に示されている）において競合ブロックオリゴヌクレオチドを添加する。使用したオリゴは、実施例４と同じである。すなわち、リアルタイムＰＣＲアッセイに使用したＨＢＶ ＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ特異的なフォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共に、ＲＴ／リバースプライマーＨＢＶ＿ＰＡ－Ｚ＿２５＿３５１（配列番号４３）であった。競合的ブロックオリゴヌクレオチド ＨＢＶｐＡ＿ｂｌｏｃｋ２（配列番号２）を用いて、および用いずに、同じマスターミックスをランした。混合サンプルおよびＲＮＡアッセイ（図６では、それぞれ正方形およびＸマーカーとして示されている）の相対蛍光強度（ＲＦＩ）は、最大１×１０6コピーのＤＮＡ（閾値までのシグナルがＲＮＡのみからであり、ＤＮＡ交差反応からの有意ではない寄与を有することを示す）と一致した（図６参照）。ＤＮＡのみのサンプル（三角マーカーによって示される）は、１×１０5コピー／ｒｘｎＤＮＡ未満で脱落し、ＲＮＡアッセイがその濃度のＤＮＡ未満では交差反応しないことを示している（図６参照）。ＤＮＡのみの検出は、ＲＮＡアッセイ（図６のダイヤモンドマーカーによって示されている）を用いて競合的ブロックオリゴヌクレオチドを使用した場合、１×１０6コピー／ｒｘｎ以下で脱落し、これは競合的ブロックオリゴヌクレオチドとの特異性の上昇を示す（図６参照）。使用した対照はＤＮＡアッセイ（図６に円として示されている）であり、ＤＮＡインプットレベルにわたって一貫した蛍光を示した（図６参照）。
図６に示すこれらの結果は、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイに対するＨＢＶ ＲＮＡ（および特定の高さの力価のインプットまでのＨＢＶ ＤＮＡ）に対する特異性、およびマスターミックス中の競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含む可能性のある改善を実証する。したがって、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ＲＮＡに特異的であり、ＨＢＶ ＤＮＡに特異的である。
実施例６：競合的ブロックオリゴヌクレオチドを用いたＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイの特異性
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。アッセイの特異性を、ＨＢＶ ＲＮＡのみのサンプルおよびＨＢＶ ＤＮＡのみのサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。
多重（内部対照（ＩＣ）反応を用いる）リアルタイムＰＣＲアッセイを、ヒト血清中１００コピー／ｍＬのＨＢＶ外装ＲＮＡで試験し、抽出して、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００のＰＣＲ反応に溶出した。競合的ブロックオリゴヌクレオチドなし、および競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含む両方でアッセイを試験した。リアルタイムＰＣＲアッセイに使用したＨＢＶ ＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ特異的なフォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共に、ＲＴ／リバースプライマーＨＢＶ＿ＰＡ－Ｖ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１（配列番号１５２）およびＨＢＶ＿ＰＡ－Ｖ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１＿ＭＩＸ（配列番号１５１）であった。競合的ブロックオリゴヌクレオチド「２５－１」（配列番号１１）を、内部対照のオリゴヌクレオチド（図示せず）と同様にマスターミックスに含めた。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、１５０ｎＭ～１μＭの範囲であった。
競合的ブロックオリゴの存在または非存在は、ＲＮＡ標的に対するアッセイの性能に影響を及ぼさなかった。競合的ブロックオリゴヌクレオチドの濃度レベルは、意図しない鋳型に対する特異性を最大化するように、またはその意図する標的に対するアッセイの感度を維持するように調整することができる。
同じ反応混合物を、ヒト血清中１０万ＩＵ／ｍＬのＨＢＶ ＤＮＡ（外装ＤＮＡ）でランし、抽出して、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００のＰＣＲ反応に溶出した。このレベルのＤＮＡは低レベルの蛍光シグナルしか有していなかったが、これらのオフターゲットシグナルをコールしないように相対蛍光強度（ＲＦＩ）カットオフを増加させる代替法を実証するために、競合的ブロックオリゴを含めて反応を行った。ブロッカーの存在下においてシグナルが除去されたため、最大１０万 ＩＵ／ｍＬのＤＮＡの存在下でＲＮＡのアッセイの感度を高めることができた。
図７に示すこれらの結果は、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイに対するＨＢＶ ＲＮＡ（および特定の高さの力価のインプットまでのＨＢＶ ＤＮＡ）に対する特異性、およびマスターミックス中の競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含む可能性のある改善を実証する。したがって、ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ＲＮＡに特異的であり、ＨＢＶ ＤＮＡに特異的である。
実施例７：ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイにおけるプライマーの改変の効果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。ＲＴ／リバースプライマー設計を変化させた場合のアッセイの性能を、ＨＢＶ ＲＮＡサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。
反応は、２５コピー／ｒｘｎでＨＢＶ ＲＮＡ鋳型（外装ＲＮＡ）上で実行し、これは、１２５ｎｇ／ｒｘｎのヒトＤＮＡのバックグラウンドで、抽出および処理工程前のサンプルにおける１００コピー／ｍＬのインプットと同等であると推定された。リアルタイムＰＣＲアッセイに使用したＨＢＶ ＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ特異的なフォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共に、ＲＴ／リバースプライマーＨＢＶ＿ＰＡ－Ｗ＿８ｐｄＵ＿２５＿３５１＿ＭＩＸ（配列番号１１７）、ＨＢＶ＿ＰＡ－Ｖ＿８ｐｄＵ＿２５＿３５１＿ＭＩＸ（配列番号１１６）、ＨＢＶ＿ＰＡ＿８ｐｄＵ＿２５＿３５１ｓ２＿ＭＩＸ（配列番号１１２）、およびＨＢＶ＿ＰＡ－Ｚ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１＿ＭＩＸ（配列番号９６）であった。結果を、以下の表６に示す。
Figure 2022546443000007
アッセイ比較（内部対照（ＩＣ）反応を使用する）をＬＣ ４８０ ＰＣＲ機器で行った。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、１５０ｎＭ～３００ｎＭの範囲であった。結果は、全てのアッセイについてアンプリコン産生および蛍光シグナルを示すが、プライマーのポリＴ伸長部にｐｄＵ改変塩基を有する、ポリＡ接合部におけるより長いＨＢＶ重複配列を用いるアッセイは、より大きなシグナルを有した。プライマーのポリＴ伸長部中のＬＮＡ－Ｔ改変塩基を用いたアッセイも、ポリＡ接合部においてより長いＨＢＶ重複配列がなくても、より大きなシグナルを有した。
図８に示されるこれらの結果は、ＲＴ／リバースプライマーの設計を調整すること、およびプライマーに異なる化学改変を含めることの性能効果を実証する。
実施例８：競合的ブロックオリゴヌクレオチドによるＨＢＶ ＲＮＡ定量に対するＨＢＶ ＤＮＡの効果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。アッセイの性能を、ＨＢＶ ＲＮＡサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。
反応は、陰性ヒト血漿中の１×１０9から１０コピー／ｍＬのＨＢＶ ＲＮＡの希釈系列でＨＢＶ ＲＮＡ鋳型（外装ＲＮＡ）上で行った。リアルタイムＰＣＲアッセイに使用したＨＢＶ ＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ特異的なフォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共に、ＲＴ／リバースプライマーＨＢＶ＿ＰＡ－Ｖ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１（配列番号１５２）およびＨＢＶ＿ＰＡ－Ｖ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１＿ＭＩＸ（配列番号１５１）であった。競合的ブロックオリゴヌクレオチド「２５－１」（配列番号１１）を、内部対照のオリゴヌクレオチド（図示せず）と同様にマスターミックスに含めた。
多重（内部対照（ＩＣ）反応を用いる）リアルタイムＰＣＲアッセイを、ヒト血漿中のＨＢＶ外装ＲＮＡで試験し、抽出して、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００のＰＣＲ反応に溶出した。競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含むアッセイを試験した。混合濃度ノードごとに１０の複製物を試験した。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。マスターミックス中のオリゴヌクレオチドの最終濃度は、３３３ｎＭ～１μＭの範囲であった。
図９に示す結果は、混合ＤＮＡ＋ＲＮＡサンプルの条件下における高いＨＢＶ ＤＮＡインプットの耐性を示す。ＤＮＡを添加しない場合、このアッセイは、１×１０9コピー～１０コピー／ｍＬのＨＢＶ ＲＮＡの線形性を示す。ＨＢＶ ＤＮＡを１×１０9ＩＵ／ｍＬの高レベルで添加した場合、ＲＮＡアッセイは、１００および１０コピー／ｍＬを除いては影響を受けず、ＤＮＡ対ＲＮＡ比は６．０ｌｏｇを超える（１ＩＵ／ｍＬ ＨＢＶ ＤＮＡはＤＮＡ鋳型の５コピー／ｍＬ超に相当する）。
並行実験では、１×１０7ＩＵ／ｍＬのＨＢＶ ＤＮＡは、１００コピー／ｍＬではＨＢＶ ＲＮＡ定量の精度に影響を及ぼさず、１０コピー／ｍＬではわずかな影響しか及ぼさないことが示され、ＨＢＶ ＤＮＡとＨＢＶ ＲＮＡとの間の比が６ｌｏｇ以下である限り、アッセイがＤＮＡインプットに耐性を示すことが確認された。
したがって、実施例８は、ＤＮＡインプットに対するＨＢＶ ＲＮＡアッセイの高い耐性を実証する。これらのデータは、競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含むＨＢＶ ＲＮＡアッセイが、多量の潜在的干渉／競合ＤＮＡの存在下においてさえ、ＨＢＶ ＲＮＡに非常に特異的であることを実証している。
実施例９：ＲＮＡおよびＤＮＡの増幅に対するリバースプライマーの長さおよび改変の効果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。ＲＴ／リバースプライマー設計を変化させた場合のアッセイの性能を、ＨＢＶ ＲＮＡサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。使用したＲＴ／リバースプライマーは、配列番号９４、９６、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１５１、１５３、１５５および１５７であり、使用したフォワードプライマーは配列番号３８７であり、使用したプローブは配列番号３８８であり、使用したブロッキングオリゴヌクレオチドは配列番号１１であった。
反応は、１２．５ｎｇ／ｒｘｎのヒトＤＮＡのバックグラウンドにおいて、２５コピー／ｒｘｎのＨＢＶ ＲＮＡ鋳型（外装ＲＮＡ）で行った。反応はまた、２５万ＩＵ／ｒｘｎのＨＢＶ ＤＮＡ鋳型上で行った。競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含むアッセイを行った。
アッセイ比較をＬＣ ４８０ ＰＣＲ機器で行った。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。内部対照もランした。結果は、ＲＮＡ上の全てのアッセイについてアンプリコン産生および蛍光シグナルを示すが、プライマーのポリＴ伸長部中のｐｄＵ改変塩基またはポリＴ伸長部中のＬＮＡ－Ｔ改変塩基のいずれかを有する、ポリＡ接合部におけるより長いＨＢＶ重複配列を用いたアッセイは、ＲＮＡ鋳型上でわずかに早いＣｔ値を有する傾向があったが、ＤＮＡ鋳型上でも比較的早いＣｔ値を有する傾向があった。
以下の表に示されるこれらの結果は、ＲＴ／リバースプライマーの設計を調整すること、およびプライマーに異なる化学改変を含めることの性能効果を実証する。表中、各プライマー設計について得られたＣｔ値の範囲は以下の通りであった：
Figure 2022546443000008
 実施例１０：ＲＮＡの増幅に対するリバースプライマー改変の効果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。ＲＴ／リバースプライマー設計を変化させた場合のアッセイの性能を、ＨＢＶ ＲＮＡサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。使用したＲＴ／リバースプライマーは、配列番号１４２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および１９０であり、使用したフォワードプライマーは配列番号３８７であり、使用したプローブは配列番号３８８であり、使用したブロッキングオリゴヌクレオチドは配列番号１１であった。
反応は、１２．５ｎｇ／ｒｘｎのヒトＤＮＡのバックグラウンドにおいて、２５コピー／ｒｘｎのＨＢＶ ＲＮＡ鋳型（外装ＲＮＡ）で行った。競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含むアッセイを行った。
アッセイ比較をＬＣ ４８０ ＰＣＲ機器で行った。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。内部対照も含めた。結果は、ＲＮＡに対する全てのアッセイについてのアンプリコン産生および蛍光シグナルを示す。しかしながら、オリゴに含まれる化学改変塩基の数および配置に応じてＣｔ値に中程度の変動があってもよく、いくつかの配置は、他の配置よりも標的の増幅においてより効率的であると考えられる。
以下の表に示されるこれらの結果は、ＲＴ／リバースプライマーの設計を調整すること、およびプライマーに異なる化学改変を含めることの性能効果を実証する。表中、各プライマー設計について得られたＣｔ値の範囲は以下の通りであった：
Figure 2022546443000009
 実施例１１：バリアント鋳型上のＲＮＡの増幅に対するリバースプライマー改変の効果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。ＲＴ／リバースプライマー設計を変化させた場合のアッセイの性能を、ＨＢＶ ＲＮＡサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。使用したＲＴ／リバースプライマーは、配列番号１４１、１５３、１５７、１６１、１６３、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８８および１９０であり、使用したフォワードプライマーは配列番号３８７であり、使用したプローブは配列番号３８８であり、使用したブロッキングオリゴヌクレオチドは配列番号１１であった。
反応は、１２．５ｎｇ／ｒｘｎのヒトＤＮＡのバックグラウンドにおいて、２５コピー／ｒｘｎのＨＢＶ ＲＮＡ鋳型（外装ＲＮＡ）で行った。競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含むアッセイを行った。これらの実験では、実施例１０とは配列が異なるバリアントＨＢＶ鋳型を使用した。
アッセイ比較をＬＣ ４８０ ＰＣＲ機器で行った。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。内部対照も含めた。結果は、ＲＮＡに対する全てのアッセイについてのアンプリコン産生および蛍光シグナルを示す。しかしながら、オリゴに含まれる化学改変塩基の数および配置に応じてＣｔ値に中程度の変動があってもよく、いくつかの配置は、他の配置よりも標的の増幅においてより効率的であると考えられる。
以下の表に示されるこれらの結果は、ＲＴ／リバースプライマーの設計を調整すること、およびプライマーに異なる化学改変を含めることの性能効果を実証する。表中、各プライマー設計について得られたＣｔ値の範囲は以下の通りであった：
Figure 2022546443000010
 実施例１２：ＤＮＡの増幅に対する競合的ブロックオリゴ改変の効果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。このアッセイは、ＨＢＶ ＤＮＡのオフターゲット増幅に対するアッセイの特異性を改善するために競合的ブロックオリゴヌクレオチドを利用する。ブロッカー設計プライマー設計を変化させた場合のアッセイの性能を、ＨＢＶ ＤＮＡサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。
反応はまた、１ｘ１０6コピー／ｒｘｎのＨＢＶ ＤＮＡ鋳型上で行った。競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含むアッセイを行った。この実験では、使用したＲＴ／リバースプライマーは、フォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共にＨＢＶ＿ＰＡ＿２５＿４６８（配列番号３５）であった。ここで、使用したブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号１、２、３、４、および５であった。
アッセイ比較をＬＣ４８０ ＰＣＲ機器で行った。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。結果は、ＤＮＡの高インプットレベルにおけるアンプリコン産生および蛍光シグナルを示し、ブロックオリゴヌクレオチドを含めるとＣｔ値が遅延する。ブロックオリゴに含まれる化学改変塩基の数および配置に応じてＣｔ値に中程度の変動があり、いくつかの配置は、他よりも競合（ＤＮＡ標的に対するプライマー結合の低下）においてより効率的であると考えられる。
以下の表に示されるこれらの結果は、競合的ブロックオリゴヌクレオチドの設計を調整すること、およびブロックオリゴに異なる化学改変を含めることの性能効果を実証する。表中、各マスターミックスについて得られたＣｔ値の範囲は以下の通りであった：
Figure 2022546443000011
 実施例１３：ＤＮＡの増幅に対する競合的ブロックオリゴ改変の効果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。このアッセイは、ＨＢＶ ＤＮＡのオフターゲット増幅に対するアッセイの特異性を改善するために競合的ブロックオリゴヌクレオチドを利用する。ブロッカー設計プライマー設計を変化させた場合のアッセイの性能を、ＨＢＶ ＤＮＡサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。
反応はまた、１ｘ１０7コピー／ｒｘｎのＨＢＶ ＤＮＡ鋳型上で行った。競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含むアッセイを行った。この実験では、使用したリバースプライマーは実施例１２のものとは異なっていた。この実験では、使用したＲＴ／リバースプライマーは、フォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共にＨＢＶ＿ＰＡ＿２５＿３５１＿（配列番号３４）であった。ここで、使用したブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、９、１０、１１および１４であった。
アッセイ比較をＬＣ４８０ ＰＣＲ機器で行った。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。結果は、ＤＮＡの高インプットレベルにおけるアンプリコン産生および蛍光シグナルを示し、ブロックオリゴヌクレオチドを含めるとＣｔ値が遅延する。ブロックオリゴに含まれる化学改変塩基の数および配置に応じてＣｔ値に中程度の変動があり、いくつかの配置（一般的により長いオリゴおよび／またはより改変塩基を有するオリゴ）は、他よりも競合（ＤＮＡ標的に対するプライマー結合の低下）においてより効率的であると考えられる。
以下の表に示されるこれらの結果は、競合的ブロックオリゴヌクレオチドの設計を調整すること、およびブロックオリゴに異なる化学改変を含めることの性能効果を実証する。表中、各マスターミックスについて得られたＣｔ値の範囲は以下の通りであった：
Figure 2022546443000012
 実施例１４：ＤＮＡの増幅に対する競合的ブロックオリゴ改変の効果
ＨＢＶ ＲＮＡポリＡ標的アッセイは、ＨＢＶ ｐｇＲＮＡ標的を用いて、図１および図２に示すようにＲＴプライマー（リバースプライマーとして使用される）を使用して設計した。このアッセイは、ＨＢＶ ＤＮＡのオフターゲット増幅に対するアッセイの特異性を改善するために競合的ブロックオリゴヌクレオチドを利用する。ブロッカー設計プライマー設計を変化させた場合のアッセイの性能を、ＨＢＶ ＤＮＡサンプルであるサンプルに対するＰＣＲ蛍光シグナルによって確認した。
反応は、１２．５ｎｇ／ｒｘｎヒトＤＮＡをバックグラウンドとして、２×１０6ＩＵ／ｒｘｎのＨＢＶ ＤＮＡ鋳型において行った。競合的ブロックオリゴヌクレオチドを含むアッセイを行った。この実験では、使用したＲＴ／リバースプライマーは、フォワードプライマー（配列番号３８７）およびプローブ（配列番号３８８）と共にＨＢＶ＿ＰＡ－Ｖ＿５ＬＮＡ＿２５＿３５１＿ＭＩＸ（配列番号１５１）であった。ここで、使用したブロックオリゴヌクレオチドは、配列番号２、１０、１１、および１５であった。
アッセイ比較をＬＣ４８０ ＰＣＲ機器で行った。使用される試薬には、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００と共に使用するためのプロファイルおよび条件を有するｃｏｂａｓ（登録証用）６８００／８８００汎用ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、およびＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出技術を使用することが含まれる。結果は、ＤＮＡの高インプットレベルにおけるアンプリコン産生および蛍光シグナルを示し、ブロックオリゴヌクレオチドを含めるとＣｔ値が遅延する。ブロックオリゴに含まれる化学改変塩基の数および配置に応じて、Ｃｔ値には中程度の変動がある。
以下の表に示されるこれらの結果は、長さが異なる競合的ブロックオリゴヌクレオチドのいくつかの設計、および異なる化学改変を含めることを実証する。表中、各マスターミックスについて得られたＣｔ値の範囲は以下の通りであった：
Figure 2022546443000013
前述の発明を明確化および理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、形態および詳細の様々な変更を行うことができることが当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術および装置を、様々な組合せで使用することができる。

Claims (52)

  1. サンプル中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸を検出する方法であって、
    （ａ） サンプルを提供することと、
    （ｂ） ＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、増幅産物を産生するために、サンプルを１つまたは複数の競合的結合オリゴヌクレオチドおよび１つまたは複数のプライマーセットおよび核酸ポリメラーゼと接触させることを含む増幅工程を実施することであって、前記１つまたは複数のプライマーセットは、１つまたは複数のフォワードプライマーと、リバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーとを含む、増幅工程を実施すること、
    （ｃ） ＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸がサンプル中に存在する場合、前記増幅産物を１つまたは複数のプローブと接触させることを含む、ハイブリダイゼーション工程を実施すること、および
    （ｄ） 前記増幅産物の存在または非存在を検出することであって、前記増幅産物の存在は、前記サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸の存在を示し、前記増幅産物の非存在は、前記サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸の非存在を示す、検出することを含む、検出工程を実施すること
    を含む方法。
  2. 前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、前記サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、前記サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの前記１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する、請求項１に記載の方法。
  3. ＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸が、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｃｃｃＤＮＡがＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である、請求項３に記載の方法。
  5. ＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸がポリＡテールを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、ＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸の前記ポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記生物学的サンプルが血漿である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記生物学的サンプルが血液である、請求項７に記載の方法。
  10. （ｉ） 前記１つまたは複数のフォワードプライマーが、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、
    （ｉｉ） リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号３４、３５、４３、９４、９６、１１２、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１４１、１４２、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、
    （ｉｉｉ） 前記１つまたは複数のプローブが、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ
    （ｉｖ） 前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、９、１０、１１、１４および１５から選択される群の核酸配列またはその相補体を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが２つの核酸配列を含み、前記２つの核酸配列が配列番号１５１および１５２の核酸配列またはそれらの相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号９６の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  13. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが配列番号４３の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  14. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号９６、１１２、１１６、および１１７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  15. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号９４、９６、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１５１、１５３、１５５、および１５７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  16. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号１４２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  17. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号１４１、１５３、１５７、１６１、１６３、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８８、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項１０に記載の方法。
  18. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号３５の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、および５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む、請求項１０に記載の方法。
  19. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号３４の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２、９、１０、１１、および１４から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む、請求項１０に記載の方法。
  20. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号１５１の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２、１０、１１、および１５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む、請求項１０に記載の方法。
  21. 前記ハイブリダイゼーション工程が、前記増幅産物を１つまたは複数の検出可能なプローブと接触させることを含み、前記１つまたは複数の検出可能なプローブが、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分によって標識されており、前記検出工程が、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在または非存在を検出することを含み、蛍光の存在または非存在が、前記サンプル中のＨＢＶ ＲＮＡの存在または非存在を示す、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター部分が、前記プローブ上で互いにわずか８～２０ヌクレオチド以内にある、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記アクセプター部分がクエンチャーである、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記増幅工程が、５’から３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性核酸ポリメラーゼを用いる、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記核酸ポリメラーゼが熱安定性であり、逆転写酵素（ＲＴ）およびＤＮＡ増幅活性を示す、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ２つの熱安定性核酸ポリメラーゼが提供され、１つの核酸ポリメラーゼが逆転写酵素（ＲＴ）活性を示し、１つの核酸ポリメラーゼがＤＮＡ増幅活性を示す、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. サンプル中に存在し得るＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡの１つまたは複数の標的核酸を検出するためのキットであって、
    （ａ） 核酸ポリメラーゼ、
    （ｂ） ヌクレオシド三リン酸、
    （ｃ） １つまたは複数のフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしても機能する１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーを含む１つまたは複数のプライマーセット、
    （ｄ） １つまたは複数のプローブ、および
    （ｅ） １つまたは複数の競合的結合オリゴヌクレオチドを含む増幅試薬を含む、キット。
  28. 前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、前記サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズし、それにより、前記サンプル中に存在し得る任意の相同ＨＢＶ ＤＮＡへの前記１つまたは複数のプライマーセットの結合を防止する、請求項２７に記載のキット。
  29. ＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸が、共有結合的に閉じた環状二本鎖ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に由来する、請求項２７または２８に記載のキット。
  30. 前記ｃｃｃＤＮＡがＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）である、請求項２９に記載のキット。
  31. ＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸がポリＡテールを含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載のキット。
  32. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、ＨＢＶ ＲＮＡの前記１つまたは複数の標的核酸の前記ポリＡテールに結合するためのポリＴ部分を含む、請求項３１に記載のキット。
  33. 前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項２７から３２のいずれか一項に記載のキット。
  34. 前記生物学的サンプルが血漿である、請求項３３に記載のキット。
  35. 前記生物学的サンプルが、血液である、請求項３３に記載のキット。
  36. （ｉ） 前記１つまたは複数のフォワードプライマーが、配列番号３８７の核酸配列またはその相補体を含み、
    （ｉｉ） リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号３４、３５、４３、９４、９６、１１２、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１４１、１４２、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５７、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、
    （ｉｉｉ） 前記１つまたは複数のプローブが、配列番号３８８の核酸配列またはその相補体を含み、かつ
    （ｉｖ） 前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、９、１０、１１、１４、および１５から選択される群の核酸配列またはその相補体を含む、請求項２７から３５のいずれか一項に記載のキット。
  37. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが２つの核酸配列を含み、前記２つの核酸配列が配列番号１５１および１５２の核酸配列またはそれらの相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項３６に記載のキット。
  38. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号９６の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項３６に記載のキット。
  39. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号４３の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項３６に記載のキット。
  40. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号９６、１１２、１１６、および１１７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項３６に記載のキット。
  41. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号９４、９６、１１６、１１７、１１９、１２１、１２３、１２４、１５１、１５３、１５５、および１５７から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項３６に記載のキット。
  42. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号１４２、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項３６に記載のキット。
  43. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号１４１、１５３、１５７、１６１、１６３、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８８、および１９０から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１１の核酸配列またはその相補体を含む１つの配列を含む、請求項３６に記載のキット。
  44. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号３５の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４および５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む、請求項３６に記載のキット。
  45. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号３４の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２、９、１０、１１および１４から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む、請求項３６に記載のキット。
  46. リバースプライマーとしても機能する前記１つまたは複数の逆転写（ＲＴ）プライマーが、配列番号１５１の核酸配列またはその相補体を含み、かつ前記１つまたは複数の競合的ブロックオリゴヌクレオチドが、配列番号２、１０、１１および１５から選択される群の１つまたは複数の核酸配列またはその相補体を含む、請求項３６に記載のキット。
  47. 前記１つまたは複数のプローブが、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含み、検出可能に標識されている、請求項２７から４６のいずれか一項に記載のキット。
  48. 前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター部分が、プローブ上で互いにわずか８～２０ヌクレオチド以内にある、請求項４７に記載のキット。
  49. 前記アクセプター部分がクエンチャーである、請求項４７または４８のいずれか一項に記載のキット。
  50. 核酸ポリメラーゼが、５’から３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ポリメラーゼ酵素である、請求項２７から４９のいずれか一項に記載のキット。
  51. 前記核酸ポリメラーゼが熱安定性であり、逆転写酵素（ＲＴ）およびＤＮＡ増幅活性を示す、請求項２７から５０のいずれか一項に記載のキット。
  52. ２つの熱安定性核酸ポリメラーゼが提供され、１つの核酸ポリメラーゼが逆転写酵素（ＲＴ）活性を示し、１つの核酸ポリメラーゼがＤＮＡ増幅活性を示す、請求項２７から５０のいずれか一項に記載のキット。
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