JP6741665B2 - 重なり合う加水分解プローブを用いた一ヌクレオチド多型検出法 - Google Patents
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Description
標的核酸およびオリゴヌクレオチド
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
FRET技術(例えば、米国特許第4,996,143号、第5,565,322号、第5,849,489号、および第6,162,603号を参照のこと)は、供与体蛍光部位および対応する受容体蛍光部位が互いの特定の距離以内に位置する場合に、これら2つの蛍光部位間でエネルギー移動が起こり、蛍光部位を視覚化、あるいは検出および/または定量化することができるという概念に基づいている。典型的には、好適な波長を有する光放射により供与体が励起されると、供与体は受容体にエネルギーを移動する。典型的には、受容体は、異なる波長を有する光放射の形態で移動されたエネルギーを再放出する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光供与体部位を含む生体分子により供与体部位と受容体部位の間を移動させることができる(例えば、米国特許第7,741,467を参照のこと)。
標的核酸のSNPの検出
本開示はさらに、標的核酸のSNPを検出するための製造品またはキットを提供する。製造品は、好適な梱包材料と共に、本明細書で記載するSNPを検出するのに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーおよび二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを含んでいてもよい。SNPを検出するための代表的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブは標的核酸分子をハイブリダイズすることができる。また、前記キットは、DNAの固定、ハイブリダイゼーション、および検出に必要な好適に包装された試薬および材料、例えば、固体支持体、緩衝液、酵素、およびDNA標準物質を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブを設計する方法は本明細書で開示され、標的核酸のSNPに対して増幅およびハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブの代表的な例が示される。
MTB−RIFのTaqMan(登録商標)によるSNPの検出
結核(TB)は、一般に、ヒト型結核菌(MTB)またはMTB複合体の他の菌により引き起こされる重篤な肺障害である。MTBの薬剤耐性菌種が増加しており、薬剤耐性結核の特に危険な形態が多剤耐性結核菌(MDR−TB)である。MDR−TBは、最も一般に用いられる抗結核薬の少なくとも2種であるリファンピシンおよびイソニアジドに対する耐性を発達させたMTBとして定義される。リファンピシン耐性の約83〜87%は、RNAポリメラーゼのβ下位ユニットをコードするrpoB遺伝子の81塩基対のリファンピシン耐性決定領域(RRDR)内の一ヌクレオチド多型によって生じる。
DNA標的:野生型(WT)プラスミドおよび変異型(MT)プラスミド
MTプラスミドおよびWTプラスミドのDNA:表Iに示す1×106cp/PCRから10cp/PCRの範囲の入力を試験した。表Iは、ヒト型結核菌のrpoB遺伝子のリファンピシン耐性決定領域(RRDR)の部分を示す。
変異体に特異的な二本鎖のTaqMan(登録商標)プローブを表IIに示す。
1組の正プライマーおよび逆プライマー、および二本鎖のSNPに特異的なTaqMan(登録商標)プローブを用いてリアルタイムPCRによる増幅を行った。野生型または変異体プラスミドDNAを1×106cp/PCR、1×102cp/PCR、1×103cp/PCR、および1×101cp/PCRで検査した。PCR反応体積は50uLであり、主要混合成分および熱特性条件は以下に示す。LC480プラットフォームで増幅を行い、ATFデータ分析ソフトウェアを用いてPCR成長曲線を分析した。結果を図1〜図6に示す。
Claims (15)
- 試料中の標的核酸の一ヌクレオチド多型(SNP)を検出する方法であって、
前記試料を、第一の核酸を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二の核酸配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、前記試料中にいずれかの標的核酸が存在すればセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む増幅産物を生成する増幅工程を行うこと、
前記増幅産物に、前記センス鎖の第一のSNP含有領域に相補な第三の核酸配列を含み、第一の相互作用標識および第二の相互作用標識、第一の5’末端および第一の3’末端を含む第一のSNP特異性加水分解プローブ、ならびに、前記アンチセンス鎖のSNP含有領域に相補な第四の核酸配列を含み、第三の相互作用標識および第四の相互作用標識、第二の5’末端および第二の3’末端を含む第二のSNP特異性加水分解プローブを含む二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを供給することを含むハイブリダイズ工程を行うこと、および
前記増幅産物の有無を検出することを含み、
ここで、前記増幅産物の存在は、前記第一及び/又は第二SNP特異的加水分解プローブから放出される検出可能標識を検出することにより決定され、そして前記標的核酸の標的に前記SNPが存在することを意味し、ここで前記第一及び/又は第二SNP特異的加水分解プローブから、放出された検出可能な標識の非存在は、前記増幅産物の非存在を示し、そして前記標的核酸の標的に前記SNPが存在しないことを意味し、
ここで、前記第一の相互作用標識は、前記第一の5’末端に第一の供与体蛍光部位を含み、前記第二の相互作用標識は前記第一のSNP特異性加水分解プローブの第一の供与体蛍光部位の8ヌクレオチド以内に第一の対応する受容体蛍光部位を含み、前記第三の相互作用標識は前記第二の5’末端に第二の供与体蛍光部位を含み、前記第四の相互作用標識は前記第二のSNP特異性加水分解プローブの第二の供与体蛍光部位の8ヌクレオチド以内に第二の対応する受容体蛍光部位を含む、方法。 - 前記第二のSNP特異性加水分解プローブは、前記第二の3’末端に向かうヘアピン構造を含み、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための1つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない核酸配列の領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の受容体蛍光部位は第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記増幅工程は、5’末端から3’末端へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および/または第二の核酸配列、および/または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および/または第四の核酸配列は少なくとも1個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および第二の核酸配列、および/または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および第四の核酸配列は、ヌクレオチドが40個以下である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 標的核酸が試料中に存在する場合に、標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む増幅産物を生成するのに特異的な第一の核酸を含む第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第二の核酸配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに
二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブを含み、前記二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、
前記標的核酸の前記センス鎖の第一のSNP含有領域に相補な第三の核酸配列を含み、第一の相互作用標識、第二の相互作用標識、第一の5’末端、および第一の3’末端を含む第一のSNP特異性加水分解プローブ、ならびに、
前記標的核酸の前記アンチセンス鎖のSNP含有領域に相補な第四の核酸配列を含み、第三の相互作用標識、第四の相互作用標識、第二の5’末端、および第二の3’末端を含む第二のSNP特異性加水分解プローブを含み、
前記第一の相互作用標識は、前記第一の5’末端に第一の供与体蛍光部位を含み、前記第二の相互作用標識は前記第一のSNP特異性加水分解プローブの第一の供与体蛍光部位の8ヌクレオチド以内に第一の対応する受容体蛍光部位を含み、前記第三の相互作用標識は前記第二の5’末端に第二の供与体蛍光部位を含み、前記第四の相互作用標識は前記第二のSNP特異性加水分解プローブの第二の供与体蛍光部位の8ヌクレオチド以内に第二の対応する受容体蛍光部位を含む、試料中の標的核酸のSNPを検出するためのキット。 - 前記第二のSNP特異性加水分解プローブは、前記第二の3’末端に向かうヘアピン構造を含み、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための1つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない核酸配列の領域を含む、請求項7に記載のキット。
- 前記第一の受容体蛍光部位は第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである、請求項7又は8に記載のキット。
- 5’末端から3’末端へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素をさらに含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載のキット。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーの第一の核酸配列および第二の核酸配列、および/または前記加水分解プローブの第三の核酸配列および第四の核酸配列は、ヌクレオチドが40個以下である、請求項7〜10のいずれか一項に記載のキット。
- SNPが標的核酸に存在する場合にSNPを検出するための二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブであって、当該二本鎖オリゴヌクレオチドプローブが、以下の:
前記標的核酸のセンス鎖の第一のSNP含有領域に相補な第一の核酸配列を含み、第一の相互作用標識、第二の相互作用標識、第一の5’末端、および第一の3’末端を含む第一のSNP特異性加水分解プローブ、ならびに、
前記標的核酸のアンチセンス鎖のSNP含有領域に相補な第二の核酸配列を含み、第三の相互作用標識、第四の相互作用標識、第二の5’末端、および第二の3’末端を含む第二のSNP特異性加水分解プローブ、
を含み、前記第一の相互作用標識は、前記第一の5’末端に第一の供与体蛍光部位を含み、前記第二の相互作用標識は前記第一のSNP特異性加水分解プローブの第一の供与体蛍光部位の8ヌクレオチド以内に第一の対応する受容体蛍光部位を含み、前記第三の相互作用標識は前記第二の5’末端に第二の供与体蛍光部位を含み、前記第四の相互作用標識は前記第二のSNP特異性加水分解プローブの第二の供与体蛍光部位の8ヌクレオチド以内に第二の対応する受容体蛍光部位を含む、前記二本鎖オリゴヌクレオチドプローブ。 - 前記第二のSNP特異性加水分解プローブは、前記第二の3’末端に向かうヘアピン構造を含み、前記ヘアピン構造は、前記ヘアピン構造を作るための1つ以上の追加のヌクレオチドを含む天然に出現しない核酸配列の領域を含む、請求項12に記載の二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記第一の受容体蛍光部位は第一のクエンチャーであり、前記第二の受容体蛍光部位は第二のクエンチャーである、請求項12又は13に記載の二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 前記加水分解プローブの第一の核酸配列および第二の核酸配列は、ヌクレオチドが40個以下である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の二本鎖のオリゴヌクレオチドプローブ。
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