CN102373267A - 一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光pcr - Google Patents

Abstract

本发明“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”是一种吸取了分子信标末端锅柄样的杂交茎结构、增加自身结合的改良水解探针及实时荧光PCR。其特征是采用模板探针序列5’端常规标记荧光素，而其3’端则添加5-6个探针5’末端的互补序列，再在最末端标记淬灭剂，并与探针5’末端序列杂交形成分子信标末端类似的茎结构。探针两末端自身杂交结合，不仅增加了淬灭效果，降低了本底；而且自身结合就不易与PCR引物聚合，消除了引物-探针非特异性聚合扩增，进而提高了水解探针实时荧光PCR的检测灵敏度，尤其是增加了弱阳性标本的检出率。

Description

一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR

技术领域：

本发明属于分子生物学及核酸扩增PCR技术领域，具体涉及一种减少乃至不与引物聚合的水解探针实时荧光PCR技术。

背景技术：

核酸扩增PCR技术是随着现代分子生物学的进步而一起发展、成熟的，早在1971年，Korana就提出了核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1983年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis在研究核酸测序方法时产生了核酸扩增的灵感：于试管中模拟天然的DNA体内复制过程。提供一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。

各种PCR技术以其独有的灵敏度、简便而成为生命科学研究的核心基础技术，但这些终末PCR不能精确定量和扩增产物再污染的难题，常规PCR加产物凝胶电泳检测方法不适用于临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量(产物标记荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数Ct值(Cycle threshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。扩增产物增加的信号既可通过产物DNA荧光染料显示，又可采用带淬灭基团的荧光探针来检测。被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活，如1995年美国PE公司研制出了Taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量PCR技术(Livak KJ，et al.，1995，Genome Res：4：357-362)，于1997年申请了水解探针(商品名：TaqMan)PCR发明专利(US Patent6,485,903)，以及Epoch公司在水解荧光探针基础上增加结合效率的MGB探针(US Patent7,205,105)。被淬灭的荧光探针也可以通过二级结构改变而激活，分子信标Molecularbeacon(Tyagi S，et al，1996，Nat Biotechnol 14：303-308)正是这样一种茎环结构的杂交探针，于1999年申请了Molecular beacon发明专利(US Patent 05925517)。其它双杂交(FRET)探针，蝎形(Scorpion)探针，Sunrise-Primer，Lux Pimers等使用范围局限于一定的应用，不明显优于水解探针TaqMan方法，且与本发明路线、原理不同。目前临床检验使用最广的是水解探针TaqMan实时荧光PCR，而基础科研还是广泛使用基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR。

常规PCR检测终末反应-平台期扩增产物，一般只需扩增25至30个循环；而实时荧光PCR检测的是对数初期的循环数Ct值，TaqMan等标记探针PCR至少需要扩增40个循环，基于荧光染料SYBR Green I的实时荧光PCR为了发挥更高灵敏度通常需要扩增45个循环。因此实时荧光PCR技术存在着更严重的引物二聚体非特异性扩增问题，过量的一对引物3’末端互补延伸产生二聚体，再大量被非特异性扩增。引物二聚体一般借助3’末端多个互补碱基配对、互为引物延伸形成二聚体，引物对之间多个连续互补序列可通过常规引物设计方法避免，但有1-2个互补序列不可避免，由于DNA链可弯曲转向，末端少数碱基互补可借助3’末端外的多个不连续互补碱基的合力结合、延伸产生二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板结合引物大量非特异性扩增、并结合染料。在不加模板的基于染料SYBR Green I实时荧光PCR实验中，绝大多数一对引物产生二聚体的循环阈值(Ct值)一般在30个循环左右，严重干扰低浓度靶分子定量和弱阳性误读。

其实常被忽略的是TaqMan等探针实时荧光PCR亦存在引物二聚体问题，只是不见引物二聚体发射荧光，但会耗尽PCR系统成份，降低扩增效率。更严重的是TaqMan等探针与过量引物之间亦会杂交互补、延伸，在不加模板，仅加一对引物与TaqMan探针的SYBR Green I实时PCR的Ct值提前至25个循环左右，说明引物加探针PCR会形成一些“带探针序列的二聚体、三聚体”，随后非特异性扩增的“二、三聚体”竞争结合大量TaqMan探针，导致弱阳性模板不易结合探针而可能漏检。为了减少或消除引物与探针结合、延伸的非特异性扩增干扰，本发明“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”整合了5’端TaqMan探针的标记，和3’端分子信标Molecular Beacon的中间技术路线，其探针借助两端互补序列自身结合，从而减少乃至不与引物聚合的水解探针荧光PCR技术。

发明内容：

为了克服标记探针与引物对间形成二聚体、三聚体造成的TaqMan实时荧光PCR的非特异性干扰靶扩增，以及非特异性竟争结合导致弱阳性标本容易漏检的局限。本发明“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其综合了水解荧光探针TaqMan和分子信标Molecular Beacon的原理技术，探针5’端具有与水解荧光探针TaqMan的相同作用机理，而其3’端类似分子信标Molecular Beacon的茎环设计，提供了一种探针5’端序列完全与靶基因互补且末端标记荧光素，探针3’端多加5-6base的与5’末端互补碱基，可与5’末端形成分子信标样的茎环结构且末端标记淬灭剂，通过探针自身结合从而大大减少探针与引物对间聚合的水解探针，和增强弱阳性检出率的实时荧光PCR途径。

“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其特征是一种TaqMan和MolecularBeacon重新组合的新性能探针及实时荧光PCR技术，其探针采用5’酶解荧光探针，和3’末端添加的5’端互补序列形成杂交茎结构而淬灭探针的实时荧光PCR检测。所述的5’酶解荧光探针是指模板序列探针5’末端标记荧光素且在PCR中可被DNA聚合酶外切酶活性水解，所述的3’末端添加的5’端互补序列形成杂交茎结构而淬灭探针是指探针3’末端多加5-6base的与5’端互补碱基且在最末端标记淬灭剂，室温下末端杂交形成锅柄样的茎结构，因此淬灭剂紧靠荧光素而淬灭探针。

所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其荧光探针设计策略原则是：首先选取一段小于40nt的靶荧光探针序列并遵守一般常规荧光探针设计所有原则，再在其3’末端多加5-6base的与5’端互补碱基呈廻文方式排列，且在最末端标记淬灭剂TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)，则探针5’端可选择标记荧光素FAM、HEX或TET；标记淬灭剂Dabcyl[4-(4’-二甲氨基苯基偶但氮)安息香酸]则可选择多种荧光素，从而可进行一个反应中同时监测多种不同靶分子的多元(重)实时荧光PCR。

所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其探针(Probe)3’末端淬灭剂还可选择一种非荧光淬灭剂和小沟结合分子(Minor Groove Binding，MGB)，或自身二级结构淬灭Lux^TM引物样的Probe和探针茎结构含1-2个RNA样的锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)碱基对的淬灭剂。

所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其荧光PCR引物含2-7个RNA/RNA样的锁核酸(LNA)替换碱基可相应减少自身聚合并增加引物结合力；探针模板序列含2-6个RNA样的锁核酸(LNA)替换碱基可大大减少探针序列长度。

所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其实验条件同于一般常规TaqMan探针实时荧光PCR反应体系。为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg²⁺缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善本发明带有茎末端的水解探针实时荧光PCR质量。

所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其带有茎末端的水解探针设计策略应用于计算机软件程序编写，提高大规模荧光探针及基因检测方法设计时的效率。

所述的“一种减少与引物聚合的水解探针荧光PCR”，其技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，10mM dNTPs，Taq等DNA聚合酶及其缓冲液，(/逆转录酶及其缓冲液)，荧光探针，上游引物F/下游引物R，标准对照物，纯化水dH₂O，矿物油。

本发明“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，目的是为减少实时荧光PCR短Oligo间聚合并非特异性扩增的干扰，通过将TaqMan探针3’末端多加5-6个与其5’末端互补的碱基(base)而增加自身相互结合、减少与引物Oligo聚合，改善TaqMan实时荧光PCR检测质量。

在一般PCR反应体系中，既存在引物与靶模板结合的特异性扩增，亦存在过量引物与引物，或引物与探针等短Oligo杂交、延伸的聚合体非特异性扩增，这种非特异性扩增一般在30个左右热循环开始进入对数增长期，非特异性扩增开始严重起来，对于一般PCR而言，30个热循环扩增产物量足够用了，大多PCR可以结束了，如果没有二聚体扩增产物的污染以及污染被反复扩增，引物二聚体对于大多数30个热循环以内的PCR影响不太大。而实时荧光PCR第30-40个热循环正位于其黄金检测窗口期，因此严重干扰低浓度靶分子精确定量和弱阳性标本准确定性。引物二聚体的形成是因为过量的一对引物3’末端存在互补序列而杂交、并互为引物延伸产生引物二聚体，在随后热循环中以二聚体为模板非特异性指数扩增，大量产生引物二聚体DNA。引物对3’末端存在的多个连续互补碱基可通过常规引物设计原则而避免，但由于核酸DNA仅由4种碱基排列组合，核酸Oligo末端有1-2个互补碱基就无法避免；由于DNA单链易弯曲转向，引物对3’末端1-2个互补碱基虽不够独立形成稳定氢键，但仍可借助引物转向后3’末端外的多个互补碱基包括多个不连续互补碱基的氢键合力而结合，延伸数个碱基后产生稳定的互补序列，进而产生完整的引物二聚体。引物二聚体虽不直接干扰TaqMan探针工作，但其竞争性地消耗PCR试剂成份包括引物、聚合酶、酶底物等，显著降低扩增效率，进一步减低TaqMan实时荧光PCR检测灵敏度。

TaqMan等探针实时荧光PCR反应中，过量的一对引物还会与过量的较长探针杂交聚合，首先产生两种引物与探针序列杂交、部分延伸的不完整二聚体，两种不完整二聚体再在PCR热循环反应中互为引物而杂交、延伸并被大量非特异性指数扩增，产生带部分探针序列的“引物-部分探针-引物”三聚体。一般探针序列两末端的标记率均只有70％-80％左右，剩余20％的3’末端羟基游离的探针Oligo会直接与两种引物3’末端杂交、延伸并大量指数式扩增，产生非特异性扩增的“引物-探针”二聚体。带部分探针序列的二聚体、三聚体将与特异性靶分子竞争结合荧光标记TaqMan探针，部分探针序列的竟争结合并不能使其5’端标记荧光基团被水解，但是减少了TaqMan探针与特异性靶分子结合几率从而也就减少了TaqMan探针5’端特异性水解，降低了系统检测灵敏度，造成弱阳性标本不被检出、有漏检的可能。

水解探针TaqMan是一种实时荧光PCR检测寡核苷酸探针，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对并尽量靠近一端引物，但又不重叠(间隔一个碱基以上)的一段寡核苷酸(＜40nt)，其5’末端标记荧光基团，淬灭剂TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)则连接在3’末端。当探针完整时，通过

共振能量转移(FRET)作用，因荧光基团发射的荧光与淬灭剂的接近而被抑制、产生荧光淬灭效应。当PCR反应时，完整的探针先与目标序列配对杂交，当引物退火延伸，新合成的DNA链接近探针杂交位置时，DNA聚合酶利用其所带的外切酶活性将探针切开，使报告荧光基团释放到反应缓冲液中，当荧光基团与淬灭剂分离时就发出荧光，DNA链合成继续进行，直到扩增循环结束。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

分子信标(Molecular Beacon)是一段双重标记的寡核苷酸(25-40nt)，形成具有一个环(探针)和一个自身末端互补的茎(添加序列)的发夹结构。荧光报告分子标在5’末端，抑制作用范围小的淬灭剂Dabcyl[4-(4’-二甲氨基苯基偶但氮)安息香酸]标在3’末端。室温条件下，分子信标形成发夹结构，荧光报告分子和淬灭剂通过信标自身互补形成的茎结构紧密靠近在一起，因而抑制了荧光信号。当PCR变性后退火时，信标遇到靶DNA链，根据热力学原理，信标探针将与靶DNA结合而不是形成发夹结构。由于茎结构破坏，荧光报告分子与弱作用淬灭剂相对分离开，报告分子得以发射荧光。

综合水解探针和分子信标技术原理，本发明“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”是带有末端茎结构的水解荧光探针及其实时荧光PCR，技术线路见附图1并与TaqMan、Molecular Beacon的比较。带有茎末端探针设计为5’端探针序列与目标基因上游引物和下游引物之间的序列配对，而其3’末端在常规TaqMan序列基础上增加4-7个，优选5-6个与5’末端互补的碱基并与5’末端成廻文方式排列，其探针两末端在室温下分子内互补形成的茎结构紧靠在一起，更多的情况是两探针反向靠近、探针分子间两末端互补形成探针二聚体，少量情况是探针分子间5’-3’首尾互补形成探针多聚体，探针自身末端互补结合就大大减少与引物聚合的可能。探针分子内部任何4-6个廻文排列的碱基也可进一步增强自身结合力。荧光报告基团分子标在探针5’末端，淬灭剂标在3’末端，由于荧光分子-淬灭剂紧密靠近产生强荧光淬灭效应，系统本底低。当PCR反应变性再退火时，探针遇到靶DNA链，根据热力学原理，探针更易与靶DNA结合而不是自身结合，引物退火延伸后，新合成的DNA链接近探针杂交位置时，DNA聚合酶利用其所带的外切酶活性将探针5’端切开，使报告荧光基团释放到反应缓冲液中，当荧光基团与淬灭剂分离时就发出荧光。探针3’末端标记既可采用抑制作用强的TaqMan常用的TAMRA，相应的报告荧光染料只有FAM、HEX和TET三种选择，由于这些染料光谱重叠，限制了其在多元PCR中的应用；又可使用分子信标通用的弱淬灭剂Dabcyl，相应的报告荧光染料就可有较多种的选择，从而可在一个反应中同时监测不同的靶分子。

本发明淬灭基团还可以有一些变通的发展：1)带有末端茎结构的水解探针3’末端亦可连接一种非荧光淬灭剂和小沟结合分子(Minor Groove Binding，MGB)以增加茎结构自身结合力度；2)带有末端茎结构的水解探针3’末端发夹序列还可设计为自身荧光淬灭(Lux^TM引物样的)二级结构序列Lux^TMProbe代替淬灭剂；3)带有末端茎结构的水解探针部分碱基可采用锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA，Petersen M.&Wengel J.，et al.，Trends Biotechnol.2003Feb，21(2)：74-81和Tran Tan ea al，Virology Journal 2010，7：46)增加杂交亲和力，茎结构含1-2个LNA碱基可增加茎结构自身结合力度，环结构含2-6个LNA碱基可相应减少探针序列长度，结合DNA链的每个LNA碱基增加3°-5℃的T_m值；结合RNA链的每个LNA碱基增加4°-8℃的T_m值。较短的LNA探针更有利于单碱基变异(SNP)的敏感检测。

当设计带有末端茎结构的水解探针时首先也必需尊循常规TaqMan探针设计的一般原则：1)探针的T_m值比引物的T_m值要高10℃以上；2)探针5’端不能是G碱基，被酶切降解的G仍具有淬灭报告荧光作用；3)探针中的G不能多于C；4)避免单一核苷酸成串，尤其是G；5)富含AT的序列要增加长度，以达到符合要求的T_m值，但探针必须＜40nt，否则淬灭效率低，反应本底高；6)探针退火时，其5’端应尽可能接近引物，同时又不重叠，离引物的3’端至少一个碱基远；7)检测单碱基变异(SNP)时，突变点尽量置于探针中间或靠近5’端，探针尽可能短；8)探针做mRNA表达分析时，探针序列应包括外含子/-/外含子边界；9)探针的3’端必须封闭以防止PCR扩增时延伸，本发明带有末端茎结构的水解探针增加了5-6个碱基游离的3’末端，加上淬灭剂本身封闭，探针末端双重封闭就不会延伸。

带有茎末端的水解探针实时荧光PCR操作：

本发明“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”是一种带有末端茎结构的水解TaqMan探针实时荧光PCR，其具体操作同于一般常规TaqMan探针实时荧光PCR反应体系。样本RNA/DNA模板常规方法制备，没有特殊要求。反转录(RT)即可分步反应，亦可与PCR一步反应。快速检测选择一步RT-PCR单管反应，单管加入两种不同的酶，即用于RT的反转录酶(如AMV或M-MLV突变体、SuperScript II/SuperScript反转录酶等)，用于实时PCR的热稳定DNA聚合酶(如Taq、Taq Plus等)。热稳定DNA聚合酶活性在反转录过程中被其抗体所抑制，进入PCR过程的高温变性使反转录酶失活，同时也使热稳定DNA聚合酶抑制抗体失活，使扩增反应顺利进行。还有一种策略是使用既具有反转录酶活性，又具有DNA聚合酶活性的Tth耐热聚合酶。

DNA/cDNA实时荧光PCR单个反应：

模板(Template)                              10μl

上游引物F(5μM)                             0.5μl

下游引物R(5μM)                             0.5μl

10mM dNTP                                   0.5μl

10×Taq buffer                              2.5μl

Taq                                         0.5μl

茎结构水解探针(2.5μM)                      0.5μl

dH ₂ O                                        10μl

                                            25μl

实际操作时，首先配制不加模板的100次×15μl＝1.5ml反应混合液，既每个成份加100倍单个反应体积，混匀，平行分装96×15μl于96孔板或0.2ml的PCR反应管，每孔或每管再分别加10μl标本DNA/RNA或模拟标准品。每个检测可平行3份×25μl计平均Ct值。

标准曲线：模拟标准(1μg/ml)×10^-2，×10^-3，×10^-4，×10^-5，×10^-6，×10^-7，×10^-8稀释。

上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988、TL988-II型和MJ Inc.DNA Engine Option^TM2)。首先变性94℃4分钟，然后40个循环，95℃20秒，(可加74℃10秒)，54-60℃45-60秒，(可加72℃10秒)。于54-60℃读取荧光值。

本发明优点：

(1)没有引物二聚体非特异扩增干扰，检测特异性更准确，尤其是弱阳性标本不易漏检。

(2)探针荧光标记紧密靠近淬灭基团，荧光信号本底明显低于TaqMan探针本底。

(3)酶解的荧光分子被彻底游离，检测灵敏度又明显高于分子信标Molecular Beacon探针。

(4)探针5’端可标记多种波长荧光分子，适用多元(多重)靶检测及多荧光通道仪器扩增分析。

(5)联合采用LNA不仅极大改善探针结合性能，更能适合基因多态性及单核苷酸变异检测。

附图说明：

图1.为TaqMan、Molecular Beacon和本发明带茎末端水解探针三种技术比较图，A.左边示意TaqMan、右边示意Molecular Beacon；B.代表带茎末端水解探针自身结合情况及PCR原理。其中，长直线示意模板，短箭头代表引物及合成方向，○代表荧光分子，●代表淬灭剂。

图2.为HBV实时荧光PCR标准曲线及部分阳性结果，图2A.为实时原始数据曲线，图2B.为程序分析Ct值曲线。

图3.为HEV实时荧光PCR试验分析，A.为实时监测原始曲线，B.为程序分析Ct值曲线。

具体实施例：

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实例一：人乙型肝炎病毒实时荧光PCR检测：

乙型病毒性肝炎(简称乙肝)由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起的一种世界性的传染性疾病。在我国人群中乙肝感染率非常高，极大的危害了人们的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增(PCR)荧光定量法等。酶免疫法应用较广，但是实时荧光PCR分析法可以精确测定乙型肝炎病人的病毒基因，对感染者病毒复制水平的判断，病情传染性及抗病毒药物疗效监测具有无法替代的重要作用。

选取乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)X区(1545-1887)序列如下：

加粗部分为保守区，划线部分为实时荧光PCR扩增引物。将全长该序列克隆到pUC₁₉载体作为乙肝模拟阳性对照序列。

AB493827X区(1545-1887)

CTCCCCGTCT GTGCCTTCTC ATCTGCCGGA CCGTGTGCAC

TTCGCTTCAC CTCTGCACGT AGCATGGAGA CCACCGGAA

CGCCCACCAG GTCTTGCCCA AGGTCTTACA CAAGAGGACT

CTTGGACTCT CAGCAATGTC AACGACCGAC CTTGAGGCAT

ACTTCAAAGA CTGTTTGTTT AAAGACTGGG AGGAGTTGGG

GGAGGAGATT AGGTTAAAGG TCTTTGTACT AGGAGGCTGT

AGGCATAAAT TGGTCTGTTC ACCAGCACCA TGCAACTTTT

TCCCCTCTGC CTAATCATCT CATGTTCATG TCCTACTGTT

CAAGCCTCCA AGCTGTGCCT TGG  (343bp)

HBV实时荧光PCR检测引物设计，引物对序列如下：

rHBXF：5’-cac ttc gct tca cct ctg-3’

rHBXR：5’-tat gcc tac agc ctc cta-3’(t采用LNA)

探针序列如下：gg agg aga tta ggt taa agg tct ttg，采用其反意链并加3’末端茎结构碱基，

HBTaqManX：5’-FAM caa aga cct tta acc taa tct cct cc tct ttg TAMRA-3’

(1)临床血标本DNA提取：取全血200μl，加等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，再氯仿抽提一次，上清加3倍的DNA结合缓冲液(6M碘化纳N_aI)移至商业DNA纯化柱(质粒小提纯化柱，详细步骤按Qiagen/Tiagen说明书进行)，洗涤缓冲液(含70％Et0H的2M N_aI液)洗柱两次，加40μl dH₂O洗脱收集纯化的样本。大量体积酚-氯仿抽提液须加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀。

(2)实时荧光PCR定量反应：

标本DNA(Template)                               10μl

rHBXF(5μM)                                     0.5μl

rHBXR(5μM)                                     0.5μl

10mM dNTP                                       0.5μl

10×Taq buffer                                  2.5μl

Taq                                             0.5μl

HB-TaXman(2.5μM)                               0.5μl

dH ₂ O                                            10μl

                                                25μl

实际操作时，首先配制不加模板的反应混合液，混匀，平行分装15μl于96孔板或0.2ml的PCR反应管，每孔或每管再加10μl标本DNA，最后再小心加20-25μl矿物油于反应表面封闭PCR反应管。每个检测可平行3份×25μl计平均Ct值，分析统计结果。

上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc.DNA Engine Option^TM2)，按说使用明书操作。首先变性94℃4分钟，然后40个循环，95℃20秒，(可加72℃10秒)，54-56℃45-60秒，(可加72℃10秒)。于54-56℃读取荧光值。

(3)实验结果(见图2)分析：

图2为中检所乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量标准品(批号0711)定量参考品L₁-L₅标准曲线和部分阳性参考品结果。A.为实时监测曲线，B.为程序分析Ct值曲线实验结果，其浓度与测量Ct值线性关系较好，阳性参考品全部有Ct值，阴性参考品全为基线反应。多次重复性非常好。

实例二：人肠道病毒致病株实时荧光PCR检测：

近年手足口病开始在我国幼儿中大规模流行，且病死率高。其病原肠道病毒(EnteroVirus，EV)的核酸实时荧光PCR检测成为控制其传染流行的关键手段，肠道病毒EV最初分为60种以上不同的血清型、包括肠道病毒68-71型。基于其核酸序列分类，人EV又分为A、B、C、D和PolioVirus五类，其中主要致病株Coxsackie A16(CA16)、EnteroVirus 71型(EV71)被归为人肠道病毒A型。肠道病毒EV基因变异大，仅5’UTR保守，有三段所有株同源保守区，发表的EV通用引物均选择此保守区因而误检非致病株，只能作为总EV鉴别检测；EV71型鉴别引物选变异大的VP₁区又严重漏检。

如EV71(SHZH98株)5’UTR同源保守区：

421 cgaaaaatct actgagctag ttagtagtcc tccggcccct gaatgcggct aatccCaact

481 gcggagcaca cgccctcaag ccagcgggta gtgtgtcgta acgggcaact ctgcagcgga

541 accgactact ttgggtgtcc gtgtttcctt ttatctttat attggctgct tatggtgaca att

肠道病毒基因组反复比对，发现在nt 434-448gagctag ttagtagtcc tc为致病株CA16和EV71高度同源区可作为致病株检测上游引物，选取第二段所有株保守区nt 538-557ga accgactactttgggtg为逆转录和下游引物，第一段所有株保守区nt 458-481cct gaatgcggct aatcccaact g 3’末端加茎结构ttc agg序列作为水解探针，且其nt476位出现C大多为EV71株；T为CA16株。

所以，即EV致病株PCR引物如下：

REV₃F：5’-gag cta gtt agt agt cct c-3’(t采用LNA)

REV₃R：5’-c acc caa agt agt cgg ttc-3’

带末端茎结构的致病株通用探针如下：

EVTaqMan：5’-FAM cct gaa tgc ggc taa tcc Yaa ctg ttc agg TAMRA-3’

致病性CA16和EV71株二元(/二重)实时荧光PCR探针设计如下：

带末端茎结构的EV71株探针，

TaqMan71：5’-FAM cct gaa tgc ggc taa tcc Caa ctg ttc agg Dabcyl-3’

(FAM：6-羧基-荧光素)

和带末端茎结构的CA16株探针，

TaqMan16：5’-JOE cct gaa tgc ggc taa tcc Taa ctg ttc agg Dabcyl-3’

(JOE：6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲基荧光素)

(1)RNA提取：首选疱疹液、咽拭子，(或血液、脑脊液)，发病3天可选肛拭子或粪便浸出液(或细胞培养物)0.1ml，粪便浸出液须自然沉淀10分钟，取上清0.1ml(或0.1g固体标本)加RNA裂解液1ml(0.5ml的4M GTC液+0.5ml水饱和酚)变性裂解，强烈漩涡振荡，再加100μl氯仿振荡，最高速离心10分钟，取上清加3×结合缓冲液(6M碘化纳N_aI)移至商业硅胶纯化柱(详细操作按Qiagen/Tiangen公司说明书进行)，用洗涤缓冲液(含70％EtOH的2M N_aI液)洗柱两次，加50μl DEPC处理的dH₂O洗脱、离心收集纯化的RNA。或裂解上清加等量异丙醇和1/10体积的2M醋酸钠(PH4.0)置-20℃2小时再离心沉淀，75％冷乙醇洗涤一次，加50μl DEPC处理的dH₂O溶解。

(GTC液：65℃溶解的4M异硫氰酸胍+0.1mM DTT和0.5％Sarkosyl.)

(2)RT实时荧光PCR

逆转录-实时荧光PCR两步合并单管反应：

待测模板(Template)                                10μl

上游正向引物F(5μM)                               0.5μl

下游反向(RT)引物R(5μM)                           0.5μl

10mM dNTP(dU代替dT)                               0.5μl

10×Taq buffer                                    2.5μl

Taq+rTth酶                                        1.0μl

水解探针(2.5/5μM)                                0.5μl

RNase抑制剂                                       0.5μl

DEPC处理的dH ₂ O                                    9μl

总体积：                                          25μl

反应液表面小心沿管壁再加20ul矿物油密闭！

实际操作时，首先配制不加模板的100次×15μl＝1.5ml反应混合液，既每个成份加100倍单个反应体积，混匀，平行分装96×15μl于96孔板或0.2ml的PCR反应管，每孔或每管再分别加10μl标本DNA/RNA或模拟标准品。每个检测可平行3份×25μl计平均Ct值。

标准曲线：模拟标准(1μg/ml)×10^-2，×10^-3，×10^-4，×10^-5，×10^-6，×10^-7，×10^-8稀释。

上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988、TL988-II型和MJ Inc.DNA Engine Option^TM2)。首先变性94℃4分钟，然后40个循环，95℃20秒，(可加74℃10秒)，54-56℃45-60秒，(可加72℃10秒)。于54-56℃读取荧光值。

(3)实验结果(见图3)分析：

标准曲线及质控：将EV部分5’-UTR序列插入pUC₁₉酶切载体、克隆生成pUC-EV₃L模拟阳性的质粒定量对照，质粒长2.8kb，分子量MW＝1.8×10⁶，计算1ng＝3.3×10⁸copy分子。质粒pUC-EV₃L小提(Miniprep)制备DNA，测光密度OD₂₆₀/OD₂₈₀，按1个OD₂₆₀值＝50μg/mlDNA计算含量，并用TE液稀释成1μg/ml作为定量对照标准品。

图3为质控模拟阳性的定量对照标准曲线和部分阳性检测结果。图3A实时监测原始数据曲线，图3B为HEV实时荧光PCR程序分析Ct值实验结果，样本HEV浓度与测量Ct值线性关系好，检测准确可靠。

序列表

Claims (8)

1.“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其特征是一种TaqMan和MolecularBeacon重新组合的一种整合新性能探针及实时荧光PCR技术，其探针采用5’酶解荧光探针技术，和3’末端添加的与5’端互补序列形成杂交茎结构而淬灭探针的实时荧光PCR检测技术。所述的5’酶解荧光探针是指模板序列探针5’末端标记荧光素且在PCR中可被DNA聚合酶外切酶活性水解，所述的3’末端添加的与5’端互补序列形成杂交茎结构而淬灭探针是指探针3’末端多加4-7base的与5’端互补碱基且在最末端标记淬灭剂，室温下末端杂交形成锅柄样的茎结构，因此淬灭剂紧靠荧光素而淬灭探针。

2.根椐权力要求1所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其所述的3’末端添加的与5’端互补序列形成杂交茎结构而淬灭探针是指探针3’末端多加4-7base的与5’端互补碱基优选为多加5-6base的与5’端互补碱基且在最末端标记淬灭剂，室温下末端杂交形成锅柄样的茎结构，因此淬灭剂紧靠荧光素而产生强淬灭作用。

3.根椐权力要求1所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其特征在于荧光探针设计策略原则是：首先选取一段小于40nt的靶荧光探针序列并遵守一般常规荧光探针设计所有原则，再在其3’末端多加5-6base的与5’端互补碱基呈廻文方式排列，且在最末端标记淬灭剂TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)，则探针5’端可选择标记荧光素FAM、HEX或TET；标记淬灭剂Dabcyl[4-(4’-二甲氨基苯基偶但氮)安息香酸]则可选择多种荧光素，从而可进行一个反应中同时监测多种不同靶分子的多元(重)实时荧光PCR。

4.根椐权力要求1所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其特征在于探针(Probe)3’末端淬灭剂还可选择一种非荧光淬灭剂和小沟结合分子(Minor GrooveBinding，MGB)，或自身二级结构淬灭Lux^TM引物样的Probe和探针茎结构含1-2个RNA样的锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)碱基对的淬灭剂。

5.根椐权力要求1所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其特征在于荧光PCR引物含2-7个RNA/RNA样的锁核酸(LNA)替换碱基可相应减少自身聚合并增加引物结合力；探针模板序列含2-6个RNA样的锁核酸(LNA)替换碱基可大大减少探针序列长度。

6.根椐权力要求1所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其特征在于实验条件同于一般常规TaqMan探针实时荧光PCR反应体系。为了更进一步增加扩增特异性和减少循环前低温非特异性反应，联合采用各种热启动DNA聚合酶，化学修饰耐热聚合酶或加热缓释Mg²⁺缓冲液等各种PCR优化方法，将更加极大地完善本发明带有茎末端的水解探针实时荧光PCR质量。

7.根椐权力要求1所述的“一种减少与引物聚合的水解探针实时荧光PCR”，其特征在于带有茎末端的水解探针设计策略应用于计算机软件程序编写，提高荧光探针及基因检测方法设计的效率。

8.根椐权力要求1所述的“一种减少与引物聚合的水解探针荧光PCR”，其特征在于其技术用于基因检测试剂盒，盒成份包括：核酸提取试剂，10mM dNTPs，Taq等DNA聚合酶及其缓冲液，(逆转录酶及其缓冲液)，荧光探针，上游引物F/下游引物R，标准对照物，纯化水dH₂O，矿物油。。

Images