CN107109480B

CN107109480B - 使用重叠水解探针检测单核苷酸多态性

Info

Publication number: CN107109480B
Application number: CN201580059164.4A
Authority: CN
Inventors: R.梅塔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: WO2016083354A1; US20160145673A1; US20160340711A1; ES2828276T3; US9689026B2; CA2967912C; US9441268B2; EP3224375A1; EP3224375B1; JP6741665B2; CN107109480A; CA2967912A1; JP2018500888A

Abstract

描述了用于快速检测样品中靶核酸的SNP存在或不存在的方法。所述方法可包括进行扩增步骤、使用具有两个重叠SNP特异性水解探针序列(其中探针序列之一可以包括朝向3'端的发夹结构)的双链探针的杂交步骤以及检测步骤。此外，提供了设计用于检测靶核酸的SNP的双链SNP特异性水解探针连同试剂盒。

Description

使用重叠水解探针检测单核苷酸多态性

发明领域

本发明涉及基于聚合酶链式反应(PCR)的诊断领域，而更具体地，涉及使用重叠水解探针的PCR检测方法。

发明背景

PCR是拷贝或‘扩增’DNA或RNA小区段的高效率并且成本节约的方式。使用PCR，仅在几小时内就可制造出数以百万计的DNA部分的拷贝，得到分析所需的足够的DNA。此方法使得临床医生可以使用最小量的样品(如血液或组织)来诊断和监测疾病。实时PCR使得扩增和检测可以同时进行。一种检测方法是通过使用寡核苷酸水解探针(也称为TaqMan^®探针)完成，所述探针具有例如于该寡核苷酸探针的5'端共价连接的荧光团和例如内部或3'端连接的猝灭剂。水解探针是双重标记的寡核苷酸探针，其依赖于Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性，在与互补靶序列杂交的过程中切割水解探针，并得到基于荧光的检测。

实时PCR方法可用于在具有单核苷酸多态性(SNP)的靶核酸中扩增和检测序列变异。然而，许多现有的SNP检测/基因分型测定基于SNP为双等位基因的假设(参见，例如，Morita 等人， Mol. Cel. Probes, 2007, 21, 171-176)。用目前现有的实时PCR方法检测SNP缺乏足够的灵敏度和特异性。水解探针(诸如标准TaqMan^®探针)通常被设计成长约18至22个碱基以具有比寡核苷酸引物高8-10℃的解链温度(Tm)。标准TaqMan^®探针一般证明对于SNP检测的特异性不高并且不太灵敏，而且不能够彻底区分WT(野生型)和MT(突变型)靶标。现有的基于TaqMan^®的SNP基因分型测定涉及使用TaqMan^® MGB(小沟结合剂，MinorGroove Binder)探针，该探针长度更短并且对于等位基因区分具有增加的探针-模板结合稳定性。额外的碱基修饰诸如稳定碱基(丙炔基dU、丙炔基dC)也可被包括在标准TaqMan_®探针设计中用于改进的SNP检测和区分。因此，在本领域中需要一种以灵敏的方式特异性检测SNP的快速而可靠的方法。

发明概述

本公开的主题包括双链SNP特异性水解探针，其中两条寡核苷酸探针链是SNP特异性的且在SNP位置重叠。在一些实施方案中，寡核苷酸探针链之一被设计成包括朝向3'端的发夹结构。靠近寡核苷酸探针的3'端的发夹结构延缓探针的3'部分与模板的杂交，并因此有助于基于报告分子与靠近5'端的猝灭剂之间的单个错配来区分WT和MT靶标。相比于WT模板，SNP特异性寡核苷酸探针的5'部分可以更有效率地与MT模板杂交。当SNP特异性寡核苷酸探针发现WT靶标时，与WT靶标的单个错配可以防止杂交和探针切割，并因此不会检测到荧光。

在一个方面，提供了用于检测样品中靶核酸中的SNP的方法，所述方法包括：进行扩增步骤，所述扩增步骤包括使样品与具有第一核酸的第一寡核苷酸引物和具有第二核酸序列的第二寡核苷酸引物接触，从而当样品中存在任何靶核酸时，产生包括有义链和反义链的扩增产物；进行杂交步骤，所述杂交步骤包括向所述扩增产物提供包括第一SNP特异性水解探针和第二SNP特异性水解探针的双链探针，所述第一SNP特异性水解探针具有与所述有义链的第一含SNP区域互补的第三核酸序列，所述第一SNP特异性水解探针包括第一相互作用标记和第二相互作用标记、第一5'端和第一3'端；且所述第二SNP特异性水解探针具有与所述反义链的含SNP区域互补的第四核酸序列，所述第二SNP特异性水解探针包括第三相互作用标记和第四相互作用标记、第二5'端和第二3'端；以及检测扩增产物的存在或不存在，其中扩增产物的存在表明在靶核酸靶标中存在SNP，且其中扩增产物的不存在表明在靶核酸靶标中不存在SNP。在一些实施方案中，所述第二SNP特异性水解探针可以包括朝向第二3'端的发夹结构，所述发夹结构包括非天然存在(例如，改变的或额外的)核酸序列的区域，其包括一个或多个额外的核苷酸以产生发夹结构。第一相互作用标记可包含第一5'末端的第一供体荧光部分，且第二相互作用标记包含在第一SNP特异性水解探针上第一供体荧光部分的不超过8个核苷酸之内的第一对应受体荧光部分，且其中第三相互作用标记包含第二5'末端的第二供体荧光部分，且第四相互作用标记包含在第二SNP特异性水解探针上第二供体荧光部分的不超过8个核苷酸之内的第二对应受体荧光部分。在一些实施方案中，所述第一受体荧光部分是第一猝灭剂，且所述第二受体荧光部分是第二猝灭剂。在某些实施方案中，所述第一和第二猝灭剂是相同的猝灭剂。在某些实施方案中，所述第一和第二猝灭剂是不同的猝灭剂。在一些实施方案中，所述扩增使用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，所述寡核苷酸引物的第一和/或第二核酸序列和/或所述水解探针的第三和/或第四核酸序列包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸引物的第一和第二核酸序列和/或所述水解探针的第三和第四核酸序列具有40或更少个核苷酸。

在另一个方面，提供了用于检测样品中靶核酸中的SNP的试剂盒，所述试剂盒包括具有第一核酸的第一寡核苷酸引物和具有第二核酸序列的第二寡核苷酸引物以及双链寡核苷酸探针，所述具有第一核酸的第一寡核苷酸引物和具有第二核酸序列的第二寡核苷酸引物对于产生包括靶核酸的有义链和反义链的扩增产物是特异性的；且所述双链寡核苷酸探针包括第一SNP特异性水解探针和第二SNP特异性水解探针，所述第一SNP特异性水解探针具有与所述有义链的第一含SNP区域互补的第三核酸序列，所述第一SNP特异性水解探针包括第一相互作用标记和第二相互作用标记、第一5'端和第一3'端；且所述第二SNP特异性水解探针具有与所述反义链的含SNP区域互补的第四核酸序列，所述第二SNP特异性水解探针包括第三相互作用标记和第四相互作用标记、第二5'端和第二3'端。在一些实施方案中，所述第二SNP特异性水解探针可以包括朝向第二3'端的发夹结构，所述发夹结构包括非天然存在(例如，改变的或额外的)核酸序列的区域，其包括一个或多个额外的核苷酸以产生发夹结构。在一些实施方案中，第一相互作用标记包含第一5'末端的第一供体荧光部分，且第二相互作用标记包含在第一SNP特异性水解探针上第一供体荧光部分的不超过8个核苷酸之内的第一对应受体荧光部分，且其中第三相互作用标记包含第二5'末端的第二供体荧光部分，且第四相互作用标记包含在第二SNP特异性水解探针上第二供体荧光部分的不超过8个核苷酸之内的第二对应受体荧光部分。在一些实施方案中，所述第一受体荧光部分是第一猝灭剂，且其中所述第二受体荧光部分是第二猝灭剂。在某些实施方案中，所述第一和第二猝灭剂是不同的猝灭剂。在一些实施方案中，所述扩增使用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。在一些实施方案中，所述寡核苷酸引物的第一和/或第二核酸序列和/或所述水解探针的第三和/或第四核酸序列包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸引物的第一和第二核酸序列和/或所述水解探针的第三和第四核酸序列具有40或更少个核苷酸。

在一个方面，提供了双链寡核苷酸探针，所述双链寡核苷酸探针包括第一SNP特异性水解探针和第二SNP特异性水解探针，所述第一SNP特异性水解探针具有与所述有义链的第一含SNP区域互补的第一核酸序列，所述第一SNP特异性水解探针包括第一相互作用标记和第二相互作用标记、第一5'端和第一3'端；且所述第二SNP特异性水解探针具有与所述反义链的含SNP区域互补的第二核酸序列，所述第二SNP特异性水解探针包括第三相互作用标记和第四相互作用标记、第二5'端和第二3'端。所述第一和第三相互作用标记可以是朝向每条寡核苷酸探针链的5'端、其附近或处于每条寡核苷酸探针链的5'端的供体荧光部分，且所述第二和第四相互作用标记可以是例如在双链水解探针的每条链上供体荧光部分的不超过8个核苷酸之内的相应受体荧光部分，例如猝灭剂。在某些实施方案中，所述第一和第二猝灭剂是相同的猝灭剂。在某些实施方案中，所述第一和第二猝灭剂是不同的猝灭剂。在一些实施方案中，所述第二SNP特异性水解探针可以包括朝向第二3'端的发夹结构，所述发夹结构包括非天然存在(例如，改变的或额外的)核酸序列的区域，其包括一个或多个额外的核苷酸以产生发夹结构。在一些实施方案中，所述第一受体荧光部分是第一猝灭剂，且其中所述第二受体荧光部分是第二猝灭剂。在一些实施方案中，所述水解探针的第一和/或第二核酸序列包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述水解探针的第一和第二核酸序列具有40或更少个核苷酸。

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述那些类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但仍然在下文中描述了合适的方法和材料。另外，所述材料、方法和实施例仅为说明性的而非旨在限制。

在以下的附图和说明书中描述了本发明的一个或多个实施方案的详细内容。从附图和详细描述以及从权利要求书中，本发明的其他特征、目标和优点将会是显而易见的。

附图简述

图1显示了使用双链水解探针的野生型和突变型526N SNP检测的实时PCR扩增曲线，所述双链水解探针具有SNP特异性的有义和反义探针链，且所述有义链具有朝向3'端的发夹结构。

图2显示了526N SNP特异性双链水解探针，其具有SNP特异性的有义和反义探针链，且有义链具有朝向3'端的发夹结构。

图3显示了使用双链水解探针的野生型和突变型531L SNP检测的实时PCR扩增曲线，所述双链水解探针具有SNP特异性的有义和反义探针链。

图4显示了531L SNP特异性双链水解探针，其具有SNP特异性的有义和反义探针链。

图5显示了使用双链水解探针的野生型和突变型526Y SNP检测的实时PCR扩增曲线，所述双链水解探针具有SNP特异性的有义和反义探针链。

图6显示了526Y SNP特异性双链水解探针，其具有SNP特异性的有义和反义探针链。

发明详述

本文描述了用于检测样品中靶核酸的单核苷酸多态性(SNP)的方法、试剂盒和水解探针。用于检测靶核酸的SNP的实时PCR相比于其他方法在灵敏度上的提升，以及实时PCR的改进特征(包括样品容量(sample containment)和对扩增产物的实时检测)，使得将这项技术实施用于在临床实验室中对靶核酸的SNP的常规诊断和检测变得可行。

所述方法可包括进行至少一个循环步骤，该循环步骤包括在样品中使用包括核酸的寡核苷酸引物和包括另一核酸序列的另一寡核苷酸引物扩增靶核酸分子的一个或多个部分，例如，含有待检测的目标SNP的基因靶标，以产生包括有义链和反义链的扩增产物。如本文中所用，“引物”(“primer”、“primers”)和“引物对”是指寡核苷酸引物，其特异性退火至核酸序列靶标并由此在合适条件下起始合成。每个引物退火至各自的靶核酸分子内部或相邻的区域，使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于各自靶标和SNP(如果存在)的核酸序列。产生扩增产物的前提是样品中存在靶核酸，靶核酸分子中是否存在目标SNP。

所述方法还可以包括杂交步骤，其包括向扩增产物提供双链寡核苷酸探针，所述双链寡核苷酸探针包括一种SNP特异性水解探针和另一种SNP特异性水解探针，所述一种SNP特异性水解探针包括与所述扩增产物的有义链的含SNP区域互补的核酸序列，且所述另一种SNP特异性水解探针包括与所述扩增产物的反义链的含SNP区域互补的另一种核酸序列。所述双链SNP特异性水解探针可以在寡核苷酸探针的有义和反义链的整个长度上是完全双链的，或者所述双链寡核苷酸探针可以在寡核苷酸探针的有义和反义链的长度的区域上是部分双链的。例如，双链寡核苷酸探针的有义和反义链形成双链区域的区域可以是例如朝向双链寡核苷酸探针的有义和反义链的5'端或3'末端或中间区域的区域。所述双链寡核苷酸探针应当在目标SNP所在的区域重叠。双链寡核苷酸探针的每个SNP特异性水解探针可以包括第一和第二相互作用标签、5'端和3'端。在一些实施方案中，双链寡核苷酸探针的一个水解探针，例如反义寡核苷酸探针，可以包括朝向3'端的发夹结构。在本文中，SNP特异性水解探针可以具有与扩增产物的一条链的含SNP区域互补的核酸序列，朝向3'端的发夹结构，并且还可以包含第一和第二相互作用标记。此外，第一相互作用标记可以位于寡核苷酸探针的5'端附近或位于寡核苷酸探针的5'端，而第二相互作用标记可以位于寡核苷酸探针的内部或3'端。在一些实施方案中，第一相互作用标记可以是例如与寡核苷酸探针的5'端共价连接的荧光团部分，而第二相互作用标记可以是例如在内部或在3'端共价连接的受体荧光部分。在其他实施方案中，第一相互作用标记可以是例如与寡核苷酸探针的5'端共价连接的受体荧光部分，而第二相互作用标记可以是例如在内部或在3'端连接的荧光团部分。在一些实施方案中，所述受体荧光部分是猝灭剂。发夹结构可被设计成包括非天然存在的核酸区域，所述非天然存在的核酸区域可包括一个或多个改变的核苷酸(其不是天然存在的序列的一部分)，或可包括一个或多个额外的非天然存在的核苷酸(其为添加到天然存在的序列中的核苷酸)，以产生所述发夹结构。以该方式，通常不会在3'端形成发夹结构的核酸序列可经过设计而形成发夹，这通过例如改变核酸序列(例如，在朝向3'端的序列中改变一个或多个核苷酸)或通过在3'端向核酸序列添加一个或多个核苷酸。

为了检测样品中的核酸靶标是否存在目标SNP，通过从第一和第二SNP特异性水解探针两者释放的可检测的标记来检测扩增产物。如果通过双链SNP特异性水解探针检测到扩增产物，则表明存在SNP。如果可选地，通过双链SNP特异性水解探针没有检测到扩增产物，则表明不存在SNP。因此，扩增产物(有义和/或反义)的存在表明靶核酸靶标中存在SNP，而扩增产物的不存在则表明靶核酸靶标中不存在SNP。

如本文中所用，术语“扩增”是指合成与模板核酸分子(例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)或丙型肝炎病毒(HCV)的靶核酸分子)的一条或两条链互补的核酸分子的方法。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性、将寡核苷酸引物在低于寡核苷酸引物解链温度的温度退火至模板核酸以及从寡核苷酸引物酶促延长以生成扩增产物。扩增通常需要存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如，Platinum^® Taq)以及合适的缓冲液和/或使聚合酶活性最优化的辅因子(例如，MgCl₂ 和/或 KCl)。

本文中使用术语“引物”如本领域技术人员已知的并且是指寡聚化合物，主要指寡核苷酸但也指能够通过模板依赖型DNA聚合酶“引发”DNA合成的修饰的寡核苷酸，即，例如，寡核苷酸的3'端提供游离的3'-OH基团，而另外的“核苷酸”可以通过模板依赖型DNA聚合酶被连接到其上形成3'至5'磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸并由此释放焦磷酸。一般而言，引物是基于已知的模板序列而设计的。一种引物引发有义链，而另一种则引发靶DNA或cDNA的互补(反义)链。PCR可以在均一的靶DNA或RNA(即，具有相同序列的靶标)上或在混合的靶DNA或RNA(即，具有侧接保守序列的不同间插序列的靶标)上进行。对于混合的DNA/RNA(例如，含有序列异质性)，如果靶标的序列与错配的寡核苷酸引物(即，容错寡核苷酸引物(tolerant oligonucleotide primer))具有足够的互补性，即使是错配的寡核苷酸引物也可以在PCR反应中起作用。

术语“杂交”是指一个或多个寡核苷酸探针退火至扩增产物。杂交条件通常包括低于寡核苷酸探针的解链温度但避免寡核苷酸探针的非特异性杂交的温度。

术语“5'至3'核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，其通常与核酸链的合成有关，由此核苷酸从核酸链的5'端被移除。

术语“热稳定聚合酶”是指热稳定的聚合酶，即，该酶催化与模板互补的引物延伸产物的形成，并且当其经受引起双链模板核酸变性所必要的时间的高温时，不会不可逆地变性。一般而言，合成起始于每个寡核苷酸引物的3'端并以5'至3'的方向沿着模板链进行。已经从黄栖热菌(Thermus flavus)、红栖热菌(T. ruber)、嗜热栖热菌(T. thermophilus)、水生栖热菌(T. aquaticus)、乳栖热菌(T. lacteus)、红色栖热菌(T. rubens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)中分离了热稳定聚合酶。尽管如此，非热稳定的聚合酶也可被用于PCR测定，但前提是补充该酶。

术语“其互补体(complement)”是指与给定的核酸不仅长度相同并且还完全互补的核酸。

当关于核酸使用时，术语“延伸”或“伸长”是指额外的核苷酸(或其他类似分子)被掺入到核酸中的情况。例如，核酸任选地通过掺入核苷酸的生物催化剂延伸，诸如聚合酶，其通常在核酸的3'末端端添加核苷酸。

在两个或更多个核酸序列的上下文中，术语“相同的”或百分比“同一性”是指当就最大对应程度进行比较和比对(例如，如使用技术人员可获得的序列比较算法之一或通过目测进行测量的)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的示例性算法为BLAST程序，其描述于，例如，Altschul 等人(1990) “Basic local alignment search tool”, J. Mol. Biol.215:403-410, Gish等人 (1993) “Identification of protein coding regions bydatabase similarity search”, Nature Genet. 3:266-272, Madden等人 (1996)“Applications of network BLAST server”, Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul等人(1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein databasesearch programs”, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402和Zhang等人(1997)“PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automatedsequence analysis and annotation”, Genome Res. 7:649-656。

在寡核苷酸的上下文中，“修饰的核苷酸”是指这样的改变，其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸所替换，其为寡核苷酸提供了所需的特性。本文中所述的寡核苷酸中可被取代的示例性的修饰的核苷酸包括，例如，C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄苷、吡唑并嘧啶类似物、假dU (pseudo-dU)、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基核糖(Ribo)-U、2'-0-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。本公开的寡核苷酸中可被取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提到，或者是本领域中另外已知的。在某些实施方案中，相对于对应的未修饰的寡核苷酸的解链温度，修饰的核苷酸取代改变寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明，在一些实施方案中，某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如，最小化引物二聚体的形成等)、增加预定靶扩增子的产率等。这些类型的核苷酸修饰的实例描述于，例如，美国专利号 6,001,611。

如本文中所用，在如本文中所述的朝向寡核苷酸探针的3'端的发夹结构的上下文中，术语“非天然存在的核苷酸”是指这样的核苷酸，其并非在天然序列中(例如，在野生型序列中)天然存在的核苷酸。此类非天然存在的核苷酸可以是已经改变(例如A至G)的核苷酸，或可以是被添加的非天然存在的核苷酸(例如一个G可被插入到序列中)。可设计将非天然存在的核苷酸包含到天然序列中，从而生成发夹结构，换言之，可以工程改造天然序列以在将不会天然存在发夹结构的位置促使形成发夹结构。可以通过在天然序列中改变或添加至少一个非天然存在的核苷酸而将天然序列设计成包括朝向3'端的发夹结构，例如可在天然序列中包含1、2、3、4、5、6或7个非天然存在的核苷酸以生成发夹结构。在一些实施方案中，在天然序列中可以包括例如，1-7、1-5、1-3、3-7、3-5或5-7个非天然存在的核苷酸以产生发夹结构。在某些实施方案中，非天然存在的核苷酸也可包含修饰的核苷酸。

靶核酸和寡核苷酸

本说明书提供了通过扩增例如，靶核酸序列的一部分以检测靶核酸的SNP的方法，所述靶核酸序列可以是已知或疑似包含一个或多个SNP的任何靶核酸序列，例如来自，例如，HIV、HCV或对利福平(rifampicin)有抗性的MTB的靶核酸序列。

为了检测靶核酸序列中的SNP，可以制备寡核苷酸引物和寡核苷酸探针以扩增该靶核酸序列。本领域技术人员还可以使用常规方法评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性的功能性变体可包括，例如，本文中公开的寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针中的一个或多个缺失、插入和/或取代。例如，可以提供基本上相同的寡核苷酸引物或寡核苷酸探针的变体，其中所述变体与一个原始的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针或其互补体具有至少，例如，80%、90%或95%序列同一性。

可以鉴定寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针中任一者的功能活性变体，相比于相应的原始序列，其在当前描述的方法、试剂盒或水解探针中提供了相似的或更高的特异性和灵敏度。

如上文详述，寡核苷酸引物(和/或寡核苷酸探针)可以被化学修饰，即，寡核苷酸引物和/或寡核苷酸探针可包含修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。寡核苷酸探针(或寡核苷酸引物)则为修饰的寡核苷酸。“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)通过一些修饰而不同于天然“核苷酸”，但仍然由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖(pentofuranosyl sugar)或戊呋喃糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或其组合组成。例如，“标记”可以被连接到“核苷酸”的碱基部分，从而得到“修饰的核苷酸”。同样地，还可以用，例如，7-脱氮杂嘌呤（7-desazapurine）替换“核苷酸”中的天然碱基，从而得到“修饰的核苷酸”。术语“修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“修饰的核苷”(或“核苷类似物”)以如上文对于“修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)所概述的方式，通过一些修饰而不同于天然核苷。

可以使用，例如，计算机程序诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.,Cascade, Colo.)来设计扩增靶核酸序列的寡核苷酸(包括修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物)。在设计待用作扩增引物的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、寡核苷酸引物对的成员的相似的解链温度、以及每个寡核苷酸引物的长度(即，寡核苷酸引物必须足够长以具有序列特异性来退火并起始合成，但又不会过长使得在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常，寡核苷酸引物的长度为8至50、特别是10至40或12至40个核苷酸(例如，长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50个核苷酸)。

除了一组寡核苷酸引物外，本方法还可使用双链寡核苷酸探针以检测靶核酸序列中SNP的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA)，其通过设计或选择而含有特定的核苷酸序列以使其能够在明确的预定严格性下与“靶核酸”特异性地(即，优先地)杂交。“探针”可被称为“检测探针”，意味着其检测靶核酸。

在一些实施方案中，所述寡核苷酸探针可以用至少一种荧光标记来标记。在一个实施方案中，寡核苷酸探针可以用供体荧光部分(例如，荧光染料)和对应的受体荧光部分(例如，猝灭剂)来标记。在本文中，第一相互作用标记可以位于寡核苷酸探针的5'端附近或位于寡核苷酸探针的5'端，而第二相互作用标记可以位于寡核苷酸探针的内部或3'端。在一些实施方案中，第一相互作用标记可以是例如与寡核苷酸探针的5'端共价连接的荧光团部分，而第二相互作用标记可以是例如在内部或在3'端共价连接的受体荧光部分。在其他实施方案中，第一相互作用标记可以是例如与寡核苷酸探针的5'端共价连接的受体荧光部分，而第二相互作用标记可以是例如在内部或在3'端连接的荧光团部分。在一些实施方案中，所述受体荧光部分是猝灭剂。

设计待用作TaqMan水解探针的寡核苷酸可以与设计寡核苷酸引物类似的方式进行。本公开的实施方案可使用双链寡核苷酸探针来检测扩增产物。取决于实施方案，寡核苷酸探针可包括至少一个标记和/或至少一个猝灭剂部分。正如寡核苷酸引物一样，寡核苷酸探针通常具有相似的解链温度，并且每个寡核苷酸探针的长度必须足以进行序列特异性杂交，但又不能过长使得在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为40个或更少的核苷酸，并且特别是12至40、15至40以及15至30(例如，16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。

聚合酶链式反应(PCR)

美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。美国专利号5,210,015、5,487,972、5,804,375、5,804,375、6,214,979和7,141,377公开了实时PCR和TaqMan^®技术。PCR通常采用两种寡核苷酸引物，其结合所选的核酸模板(例如，DNA或RNA)。可用于所述实施方案的寡核苷酸引物包括能够在靶核酸序列内部用作核酸合成起始点的寡核苷酸。寡核苷酸引物可通过常规方法从限制性酶切产物中纯化，或其可以合成产生。就最大扩增效率而言，寡核苷酸引物优选地为单链的，但寡核苷酸引物也可以是双链的。双链寡核苷酸引物首先经过变性，即，处理以使链分开。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的，则就有必要在其可被用作PCR中的模板之前将两条链分开。链的分离可以通过任何合适的变性方法(包括物理、化学或酶促方法)而实现。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直到其大部分变性(例如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性)。使模板核酸变性所必要的加热条件将取决于，例如，缓冲液的盐浓度以及变性的核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约105℃的范围内，而持续时间取决于反应的特征(诸如温度和核酸长度)。变性通常进行约30秒至4分钟(例如，1分钟至2分30秒，或1.5分钟)。

如果双链模板核酸是通过热变性，则使反应混合物冷却至一定的温度，该温度能在靶核酸分子上促进每个寡核苷酸引物退火至其靶序列。退火温度通常为约35℃至约65℃(例如，约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可以为约10秒至约1分钟(例如，约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后调节反应混合物至这样的温度，在该温度下会促进或优化聚合酶活性，即，该温度足以从经退火的寡核苷酸引物进行延伸以生成与模板核酸互补的产物。该温度应当足以从每个退火至核酸模板的寡核苷酸引物合成延伸产物，但不应当过高而使来自其互补模板的延伸产物变性(例如，用于延伸的温度通常在约40℃至约80℃的范围内 (例如，约50℃至约70℃；约60℃)。延伸时间可以为约10秒至约5分钟(例如，约30秒至约4分钟；约1分钟至约3分钟；约1分30秒至约2分钟)。

PCR测定可采用靶核酸诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不必经过纯化；其可以是复杂混合物的一小部分，诸如人细胞中含有的靶核酸。靶核酸分子可以通过常规技术诸如在Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications (Persing 等人(编辑), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.)中所述的那些从生物样品中提取。核酸可得自多种来源，诸如质粒或天然来源(包括细菌、酵母、病毒、细胞器)或高等生物(诸如植物或动物)。

在诱导引物延伸的反应条件下，将寡核苷酸引物与PCR试剂组合。例如，链延伸反应一般包含50 mM KCl、10 mM Tris-HCl(pH 8.3)、15 mM MgCl₂、0.001%(w/v)明胶、0.5-1.0 µg 经变性的模板DNA、50 pM 每种寡核苷酸引物、2.5 U Taq聚合酶和10% DMSO)。反应通常含有150至320 µM 的各dATP、dCTP、dTTP、dGTP或其一种或多种类似物。

新合成的链形成双链分子，其可被用于反应的后续步骤中。链分离、退火和延伸的步骤可根据需要而频繁重复以产生所需数量的对应于靶核酸分子的扩增产物。反应的限制因素是存在于反应中的寡核苷酸引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。优选地将循环步骤(即，变性、退火和延伸)重复至少一次。就检测用途而言，循环步骤的次数将取决于，例如，样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物，则将需要更多的循环步骤以扩增靶序列，使之足够用于检测。通常，循环步骤会重复至少约20次，但也可能重复多达40、60或甚至100次。

荧光共振能量转移(FRET)

FRET技术(参见，例如，美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)是基于这样的概念：当供体荧光部分和对应的受体荧光部分被置于一定相互距离之内时，两个荧光部分之间会发生能量转移，其可以被目测或另外检测和/或定量。当供体经适当波长的光辐射激发时，供体通常向受体转移能量。受体通常将转移来的能量以不同波长的光辐射的形式重新发射出去。在某些系统中，通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子，可以在供体和受体部分之间转移非荧光能量(参见例如美国专利号7,741,467)。

在一个实例中，寡核苷酸探针可含有供体荧光部分和对应猝灭剂，所述猝灭剂可以是荧光的或不是荧光的，且将转移来的能量以光以外的形式耗散掉。当寡核苷酸探针完整时，能量转移通常发生在两个荧光部分之间，使得来自供体荧光部分的荧光发射被猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间，结合至扩增产物的寡核苷酸探针通过例如，Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性被切割，使得供体荧光部分的荧光发射不再被猝灭。用于此目的的示例性寡核苷酸探针描述于，例如，美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂为DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂（darkquencher）包括BlackHole Quenchers™(BHQ)(Biosearch Technologies, Inc., Novato,Cal.)、Iowa Black™(Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa)、BlackBerry™Quencher 650(BBQ-650)(Berry & Assoc., Dexter, Mich.)。

可以使用，例如，光子计数落射荧光显微镜系统(包含用于在特定范围监测荧光发射的合适的分色镜与滤光器)、光子计数光电倍增系统或荧光计来进行荧光分析。可使用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、光纤光源或针对在所需范围内的激发经适当过滤的其他高强度光源来进行激发以起始能量转移或允许直接检测荧光团。

如本文中所用，就供体和对应的受体荧光部分而言，“对应的”是指受体荧光部分具有与供体荧光部分的发射光谱重叠的吸收光谱。受体荧光部分发射光谱的最大波长应当比供体荧光部分激发光谱的最大波长大至少100 nm。因此，它们之间可以产生有效率的非辐射能量转移。

通常针对以下选择荧光供体和对应的受体部分：(a)高效率Forster能量转移；(b)大的最终Stokes位移(>100 nm)；(c)向可见光谱红色部分(>600 nm)尽可能远的发射位移；以及(d)发射位移至比通过供体激发波长激发所产生的Raman水荧光发射更高的波长。例如，可选择这样的供体荧光部分，所述供体荧光部分具有在激光谱线附近(例如，氦-镉 442nm 或氩 488 nm)的其最大激发、高消光系数、高量子产率以及其荧光发射与对应的受体荧光部分的激发光谱的良好重叠。可选择这样的对应的受体荧光部分，所述受体荧光部分具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及可见光谱的红色部分(>600 nm)中的发射。

可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性的供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯(acridineisothiocyanate)、荧光黄VS、4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸、7-二乙胺基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯以及4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸的衍生物。代表性的受体荧光部分(取决于所用供体荧光部分)包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明异硫氰酸四甲基酯、罗丹明X异硫氰酸酯、赤藓红异硫氰酸酯、荧光素、二乙烯三胺五乙酸酯或其他镧系元素离子(例如，铕或铽)的螯合物。供体和受体荧光部分可得自，例如，Molecular Probes(Junction City, Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St. Louis, Mo.)。

可通过接头臂将供体和受体荧光部分连接至合适的探针寡核苷酸。每个接头臂的长度很重要，因为接头臂将影响供体和受体荧光部分之间的距离。用于本公开的目的的接头臂的长度为从核苷酸碱基到荧光部分的距离(以埃(Å)计)。一般而言，接头臂为约10 Å至约25 Å。接头臂可以是WO 84/03285中所述的那种。WO 84/03285还公开了用于将接头臂连接至特定核苷酸碱基，以及还用于将荧光部分连接至接头臂的方法。

可将受体荧光部分(诸如LC Red 640)与含有氨基接头(例如，可得自ABI (FosterCity, Calif.)或Glen Research (Sterling, VA)的C6-氨基亚磷酰胺)的寡核苷酸结合以产生，例如，LC Red 640-标记的寡核苷酸。经常用到的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC衍生的，例如，来自 Glen Research或ChemGene(Ashland, Mass.)的荧光素-CPG)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的，如来自BioGenex(San Ramon, Calif.)的CX-荧光素-CPG)或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3'-氨基-CPG。

靶核酸中的SNP的检测

本公开提供了用于检测生物制品中靶核酸的SNP存在或不存在的方法。所提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。所述方法包括进行至少一个循环步骤和荧光检测步骤，所述循环步骤包括使用寡核苷酸引物对从样品扩增靶核酸分子的一部分，所述荧光检测步骤使用双链SNP特异性水解探针，其中在一些实施方案中，双链寡核苷酸探针的一条链包括朝向3'端的发夹结构。可优选地在热循环仪中进行多个循环步骤。可使用寡核苷酸引物和寡核苷酸探针实施所述方法以检测样品中靶核酸的SNP的存在。

如本文中所述，可使用利用FRET技术的经标记的杂交水解探针检测扩增产物。一种FRET方式使用TaqMan®技术以检测扩增产物的存在或不存在，并从而检测靶核酸的存在或不存在。TaqMan®技术使用一种经例如一种荧光染料和一种猝灭剂(其可以是荧光的或不是荧光的)标记的单链杂交水解探针。当第一荧光部分由合适波长的光激发时，所吸收的能量根据FRET原理被转移至第二荧光部分。第二荧光部分通常为猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间，经标记的杂交探针结合至靶DNA(即，扩增产物)并在后续的延伸阶段通过例如Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性被降解。因此，荧光部分和猝灭剂部分在空间上变得彼此分离。作为结果，当在猝灭剂不存在的情况下激发第一荧光部分时，则可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。通过实例的方式，ABI PRISM® 7700 序列检测系统(AppliedBiosystems)使用TaqMan®技术，并且适用于实施本文中所述的用于检测样品中靶核酸的存在或不存在的方法。

一般而言，FRET的存在表明样品中靶核酸存在SNP，而FRET的不存在则表明样品中不存在SNP。然而，标本采集不足、运输延误、不恰当的运输条件或使用某些采集拭子(藻酸钙或铝柄(aluminum shaft))均是可能影响测试结果的成功和/或准确度的条件。使用本文所公开的方法，在例如，45个循环步骤之内检测到FRET表明样品中的靶核酸存在SNP。

可用于实施本公开的方法的代表性的生物样品包括但不限于皮肤拭子、鼻腔拭子、伤口拭子、血液培养物、皮肤和软组织感染物(soft tissue infection)。采集和保存生物样品的方法是本领域技术人员已知的。生物样品可进行处理(例如，通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放靶核酸，或在一些情况下，生物样品可以与PCR反应组分以及合适的寡核苷酸直接接触。

在热循环仪的每次运行中，对照样品也可以被循环。阳性对照样品可以使用，例如，对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(而非所述的靶基因的扩增产物)。阳性对照样品还可以扩增，例如，含有靶核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可以使用与用于检测预期靶标相同的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针内部扩增(例如，在样品内)或在单独的样品运行中与患者样品并排扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成败的指标。热循环仪的每次运行还可以包含阴性对照，例如，其缺乏靶模板DNA。阴性对照可以测量污染。这保证了系统和试剂不会产生假阳性信号。因此，对照反应可容易地确定，例如，寡核苷酸引物序列特异性地退火和起始延长的能力以及寡核苷酸探针序列特异性地杂交和进行FRET的能力。

在一个实施方案中，所述方法包括避免污染的步骤。例如，在美国专利号 5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了使用尿嘧啶DNA糖基化酶的酶促方法以减少或消除热循环仪的一次运行与下一次之间的污染。

结合FRET技术的常规PCR方法可用于实施本公开的方法。在一个实施方案中，使用了LightCycler®仪器。下列专利申请描述了如LightCycler®技术中所用到的实时PCR：WO97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。

LightCycler®可以使用PC工作站进行操作并且可以使用Windows NT操作系统。当机器将毛细管依次置于光单元上方时获取来自样品的信号。软件可以在每次测量后立刻实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后，可持续更新所有样品的相对于循环次数的荧光定量显示。生成的数据可以被保存用于进一步分析。

应当理解，本公开的实施方案不为一种或多种市售仪器的配置所限。

制品/试剂盒

本公开还提供了制品或试剂盒以检测靶核酸的SNP。制品可包括如本文所述的用于检测SNP的寡核苷酸引物和双链寡核苷酸探针，连同合适的包装材料。用于检测SNP的代表性的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针能够杂交至靶核酸分子。此外，试剂盒还可包括用于DNA固定、杂交和检测所需的适当包装的试剂和材料，如固体支持物、缓冲液、酶和DNA标准品。本文中公开了设计寡核苷酸引物和寡核苷酸探针的方法，并提供了扩增和杂交靶核酸靶核酸分子中SNP的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针的代表性的实例。

制品还可以包括用于标记寡核苷酸探针的一种或多种荧光部分或，可选地，可以标记试剂盒所提供的寡核苷酸探针。例如，制品可包括用于标记SNP特异性寡核苷酸探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。

制品还可含有包装插页或其上具有说明书的包装标签用于使用寡核苷酸引物和寡核苷酸探针以检测样品中靶核酸的SNP。制品可额外包括用于实施本文所公开方法的试剂(例如，缓冲液、聚合酶、辅因子或防止污染的试剂)。此类试剂可专用于本文所述的市售仪器之一。

将在以下实施例中进一步描述公开的主题的实施方案，其不会限制权力要求书中所述的本发明的范围。

实施例

提供了以下实施例和附图以帮助理解本发明，其真实范围描述于所附权利要求书中。应当理解，可在所描述的程序内做出修改而不脱离本发明的精神。

实施例 I

MTB-RIF TaqMan® SNP 检测

结核病(TB)是一种严重的肺部疾病，其通常由结核分枝杆菌(MTB)或MTB复合物的其他成员所引起。MTB的耐药菌株日渐增多，并且一种特别危险的耐药结核病形式为耐多药结核病(MDR-TB)。MDR-TB被定义为对至少两种最常用的抗结核药物(利福平和异烟肼)发展出耐药性的MTB。大约83-87%的利福平耐药性由编码RNA聚合酶的β亚基的rpoB基因的81个碱基对的利福平耐药性决定区(RRDR)内的单核苷酸多态性造成。

对于每条探针链，突变型特异性双链TaqMan®水解探针被设计成具有5'端荧光团和内部猝灭剂。寡核苷酸探针的每条有义和反义链被设计为SNP特异性的，即与含有目标SNP的靶标的有义和反义突变型版本完全匹配，并且与靶标的野生型版本类似地错配。此外，在一些实施方案中，在寡核苷酸探针的3'端引入额外的一个或多个碱基，其将导致朝向3'端的发夹结构。设计寡核苷酸探针，使得WT和MT间的错配位于报告分子和靠近每条探针链上的5'端的猝灭剂之间。当TaqMan®探针完整时，报告分子和猝灭剂彼此接近，其防止任何荧光的发射。

在PCR过程中，在变性后，寡核苷酸引物和TaqMan®探针退火至互补的DNA链。杂交后并在PCR延伸阶段期间，DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割寡核苷酸探针，这使报告分子和猝灭剂染料分离并检测到荧光。在包括发夹结构的那些实施方案中，靠近寡核苷酸探针的3'端的发夹结构会延缓寡核苷酸探针的3'一半与模板的杂交，并因此有助于根据单个碱基对的差异或错配来区分WT和MT靶标。相比于WT模板，MT发夹TaqMan®探针的5'一半将更有效率地杂交至MT质粒DNA模板。当MT特异性寡核苷酸探针发现WT靶标时，与WT靶标的单个错配将防止杂交和探针切割，并很少或不会检测到荧光。

材料和方法

DNA靶标 – 野生型(WT)和突变型(MT)质粒

MT和WT质粒DNA：所测试的投入量在1e6 cp/PCR至10 cp/PCR的范围内，示于表I中，其显示了结核分枝杆菌中rpoB基因的利福平耐药性决定区(RRDR)的一部分。

表I：野生型和突变型质粒DNA

MTB特异性寡核苷酸：用于野生型和突变型质粒两者的一组正向和反向寡核苷酸引物

显示于表II中的突变型特异性双链TaqMan®探针

表II：有义和反义SNP特异性寡核苷酸探针

名称：E代表Threo-HEX；P代表磷酸；Q代表BHQ-2猝灭剂；L代表丙炔基dC ；U代表丙炔基dU；双下划线字母为SNP的位点；而粗体并加下划线的字母是被改变或被添加以形成发夹的碱基。

平台：LightCycler® 480系统

使用一组正向和反向引物以及双链SNP特异性TaqMan®探针进行实时PCR扩增。以1e6、1e2、1e3和1e1 cp/PCR测试野生型或突变型质粒DNA。PCR反应体积为50 µL，并在下文中列出了主混合物组分和温度概况条件。在LC480平台上进行扩增并使用ATF数据分析软件分析了PCR生长曲线。结果示于图1至6中。

尽管出于清楚和理解的目的相当详细地描述了上述发明，但通过阅读本公开，本领域技术人员将清楚，可在形式和细节上做出各种变化。例如，上述所有技术和装置可以各种组合使用。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

Roche Molecular Systems, Inc.

<120> 使用重叠水解探针检测单核苷酸多态性

<130> P32320-WO-HS

<150> US 14/555343

<151> 2014-11-26

<160> 15

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (2)..(3)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (6)..(6)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (10)..(10)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (12)..(13)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (16)..(16)

<223> 丙炔基dC

<400> 1

accaacaagc gccgac 16

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<400> 2

ttgttggtca accccgacgg gg 22

<210> 3

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (2)..(2)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (3)..(3)

<223> 丙炔基dU

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (5)..(6)

<223> 丙炔基dU

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (9)..(9)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (11)..(11)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (12)..(12)

<223> 丙炔基dU

<400> 3

acuguuggcg cugg 14

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (1)..(2)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (5)..(5)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (9)..(9)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (12)..(12)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (14)..(14)

<223> 丙炔基dC

<400> 4

ccaacagtcg gcgc 14

<210> 5

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (2)..(3)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (4)..(4)

<223> 丙炔基dU

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (6)..(6)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (10)..(10)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (12)..(13)

<223> 丙炔基dC

<400> 5

accuacaagc gccg 14

<210> 6

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (1)..(1)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (2)..(3)

<223> 丙炔基dU

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (5)..(5)

<223> 丙炔基dU

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (9)..(10)

<223> 丙炔基dC

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (13)..(16)

<223> 丙炔基dC

<400> 6

cuuguaggcc aaccccga 18

<210> 7

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 7

gccagctgag ccaattcatg gtccagaaca acccgctgtc ggggttgacc aacaagcgcc 60

gactgtcggc gctggggtcc ggcgg 85

<210> 8

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 8

gccagctgag cctattcatg gaccagaaca acccgctgca ggggttgacc cacaagcgcc 60

gactgttggc gctggggccc ggcgg 85

<210> 9

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 9

gccagctgag ccaattcatg gaccagaaca acccgctgtc ggggttgacc cacaagcgcc 60

gactgtcggc gctggggccc ggcgg 85

<210> 10

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 10

gccagctgag ccaattcatg gaccagaaca acccgctgtc ggggttgacc cacaagcgcc 60

gactgtcggc gctggggccc ggcgg 85

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<400> 11

accaacaagc gccgac 16

<210> 12

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<400> 12

acuguuggcg cugg 14

<210> 13

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<400> 13

ccaacagtcg gcgc 14

<210> 14

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<400> 14

accuacaagc gccg 14

<210> 15

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成探针

<400> 15

cuuguaggcc aaccccga 18

Claims

1.用于检测样品中靶核酸中的单核苷酸多态性(SNP)的方法，所述方法包括：

- 进行扩增步骤，所述扩增步骤包括使样品与包含第一核酸序列的第一寡核苷酸引物和包含第二核酸序列的第二寡核苷酸引物接触，从而当样品中存在任何靶核酸时，产生包含有义链和反义链的扩增产物；

- 进行杂交步骤，所述杂交步骤包括向所述扩增产物提供双链寡核苷酸探针，其包含：

- 第一SNP特异性水解探针，其包含与所述有义链的第一含SNP区域互补的第三核酸序列，所述第一SNP特异性水解探针包含第一相互作用标记和第二相互作用标记、第一5'端和第一3'端；和

- 第二SNP特异性水解探针，其包含与所述反义链的含SNP区域互补的第四核酸序列，所述第二SNP特异性水解探针包含第三相互作用标记和第四相互作用标记、第二5'端和第二3'端；且

- 检测所述扩增产物的存在或不存在，其中通过检测从所述第一和/或所述第二SNP特异性水解探针释放的可检测标记来测定所述扩增产物的存在，并且所述扩增产物的存在表明在靶核酸中存在SNP，且其中从所述第一和/或所述第二SNP特异性水解探针释放的可检测标记的不存在指示所述扩增产物的不存在且在靶核酸中不存在SNP，

其中所述第一相互作用标记包含第一5'末端的第一供体荧光部分，且所述第二相互作用标记包含在第一SNP特异性水解探针上第一供体荧光部分的不超过8个核苷酸之内的对应的第一受体荧光部分，且其中第三相互作用标记包含第二5'末端的第二供体荧光部分，且所述第四相互作用标记包含在第二SNP特异性水解探针上第二供体荧光部分的不超过8个核苷酸之内的对应的第二受体荧光部分。

2.权利要求1所述的方法，其中所述第二SNP特异性水解探针包含朝向第二3'端的发夹结构，所述发夹结构包含非天然存在的核酸序列的区域，其包含一个或多个额外的核苷酸以产生发夹结构。

3.权利要求1所述的方法，其中所述第一受体荧光部分是第一猝灭剂，且其中所述第二受体荧光部分是第二猝灭剂。

4.权利要求1所述的方法，其中所述扩增使用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。

5.权利要求1的所述方法，其中所述寡核苷酸引物的第一和/或第二核酸序列和/或所述水解探针的第三和/或第四核酸序列包含至少一个修饰的核苷酸。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸引物的第一和第二核酸序列和/或所述水解探针的第三和第四核酸序列具有40或更少个核苷酸。

7.用于检测样品中靶核酸中的SNP的试剂盒，其包含：

- 包含第一核酸序列的第一寡核苷酸引物和包含第二核酸序列的第二寡核苷酸引物，从而当所述样品中存在靶核酸时，特异性地产生扩增引物，所述扩增引物包含靶核酸的有义链和反义链；和

- 双链寡核苷酸探针，其包含：

- 第一SNP特异性水解探针，其包含与所述靶核酸的有义链的第一含SNP区域互补的第三核酸序列，所述第一SNP特异性水解探针包含第一相互作用标记和第二相互作用标记、第一5'端和第一3'端；和

- 第二SNP特异性水解探针，其包含与所述靶核酸的反义链的含SNP区域互补的第四核酸序列，所述第二SNP特异性水解探针包含第三相互作用标记和第四相互作用标记、第二5'端和第二3'端，

8.权利要求7所述的试剂盒，其中所述第二SNP特异性水解探针包含朝向第二3'端的发夹结构，所述发夹结构包含非天然存在的核酸序列的区域，其包含一个或多个额外的核苷酸以产生发夹结构。

9.权利要求7所述的试剂盒，其中所述第一受体荧光部分是第一猝灭剂，且其中所述第二受体荧光部分是第二猝灭剂。

10.权利要求7所述的试剂盒，其还包含具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。

11.权利要求7至10中任一项所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸引物的第一和第二核酸序列和/或所述水解探针的第三和第四核酸序列具有40或更少个核苷酸。

12.双链寡核苷酸探针，其用于当靶核酸中存在SNP时检测SNP，所述双链寡核苷酸探针包含：

- 第一SNP特异性水解探针，其包含与所述靶核酸的有义链的第一含SNP区域互补的第一核酸序列，所述第一SNP特异性水解探针包含第一相互作用标记和第二相互作用标记、第一5'端和第一3'端；和

- 第二SNP特异性水解探针，其包含与所述靶核酸的反义链的含SNP区域互补的第二核酸序列，所述第二SNP特异性水解探针包含第三相互作用标记和第四相互作用标记、第二5'端和第二3'端，

13.权利要求12所述的双链寡核苷酸探针，其中所述第二SNP特异性水解探针包含朝向第二3'端的发夹结构，所述发夹结构包含非天然存在的核酸序列的区域，其包含一个或多个额外的核苷酸以产生发夹结构。

14.权利要求12所述的双链寡核苷酸探针，其中所述第一受体荧光部分是第一猝灭剂，且其中所述第二受体荧光部分是第二猝灭剂。

15.权利要求12至14中任一项所述的双链寡核苷酸探针，其中所述水解探针的第一和第二核酸序列具有40或更少个核苷酸。