WO2011006306A1 - 锁核酸和小沟结合物共修饰的核酸片段 - Google Patents

锁核酸和小沟结合物共修饰的核酸片段 Download PDF

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邵俊斌
沈步超
倪卫琴
赵红喜
朱勤玮
张彬彬
马丽丽
舒峰
朱旭平
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上海之江生物科技有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a method for labeling oligonucleotides.
  • both the probe and the primer have a certain length limitation.
  • Primers are generally designed to be 18 to 25 bases in length, while TaqMman probes are typically 2 CT40 bases in length.
  • the general probes and primers tend to be unsatisfactory, and the sensitivity and specificity are poor.
  • the MGB full name minor groove binder which is a small groove conjugate, is a chemical group derived from certain antibiotic molecules. It can be embedded in the minor groove of the DNA double helix to form non-covalent binding. Generally, the oligonucleotide can be annealed. Increasing the temperature by more than 10 degrees can shorten the length of the primer or probe, improve the specificity and bring convenience to the design.
  • Locked nuc le ic ac id (LNA) a novel nucleic acid analog that contains a 2'-oxy 4' carbon methylene linkage, which limits the flexibility of the furanoribose ring and thus its structure Locked into a rigid double-loop mode, thus improving hybridization efficiency and superior stability.
  • the chemical structure of the LNA single molecule determines the stability of the oligonucleotide sequence after hybridization with the target sequence. Compared with the unlabeled, the double strand is in the same salt solution, and each additional monomer LNA molecule will cause its annealing temperature. Increasing 8° C o shortens the length of the primer or probe, increases specificity and facilitates design. However, these two methods sometimes fail to fully meet the design requirements due to their limited annealing temperature. Summary of the invention
  • the object of the present invention is to overcome the deficiencies in the prior art and to provide a better method for labeling oligonucleotides for DNA mutation recognition detection and SNP recognition.
  • the invention provides a method of labeling oligonucleotides, i.e., labeling LNA and labeling MGB on the same oligonucleotide strand.
  • the MGB is labeled at the 3' end of the oligonucleotide strand; the LNA is labeled on an individual nucleotide of the oligonucleotide strand. Further, the individual nucleotide is a base in which a mutation occurs.
  • the designed sequence can be automatically synthesized and labeled by the phosphoramidite synthesis method by an oligonucleotide automatic synthesizer.
  • the oligonucleotide strands suitable for labeling of the invention are 10-18 bases in length.
  • the method of labeling oligonucleotides of the present invention can be used for DNA mutations and recognition detection of SNPs.
  • a second aspect of the present invention discloses a nucleic acid fragment co-modified by LNA (Locked Nucleic Acid) and MGB (Minor Groove Binder), which is an oligonucleotide chain labeled with both LNA and MGB.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • MGB Minor Groove Binder
  • the MGB is labeled at the T-terminus of the oligonucleotide strand; the LNA is labeled on an individual base of the oligonucleotide strand.
  • the labeled nucleic acid fragment is a Taqman probe, and the 5' end of the oligonucleotide strand is further labeled with a reporter fluorophore, and the 3' end is labeled with a quenching group that does not emit light.
  • the reporter fluorophore is FAM or VIC
  • the non-luminescent quenching group is NFQ.
  • the third aspect of the invention discloses the use of the above oligonucleotide chain as a primer, Taqman probe.
  • the oligonucleotide chain of the present invention can be used as a primer or a Taqman probe for DNA mutation recognition detection. It was found that MGB and LNA were simultaneously labeled with modified oligonucleotides, which further improved their stability compared to a single label, thereby increasing the annealing temperature. This not only allows the experimenter to have more choices in the design, but also increases the specificity of the oligonucleotide sequence.
  • the novel oligonucleotide of the present invention is modified by using a combination of MGB (minor groove binder) and LNA (Locked nucleic acid, LNA): 1) The Tm value is increased by 12_25 ° C, which is better than the Tm value using only one modification technique. Increasing 8_15 °C increased by about 10 °C. This ensures that the oligonucleotide is shorter than the single or unmodified sequence under the condition that the Tm value is satisfied, and 2) the composition requirements of A, G, C, and T in the oligonucleotide sequence are lowered. These changes result in an increase in the ability of oligonucleotides to recognize nucleic acid sequence mutations and SNPs.
  • Example 1 Taking Taqman probe as an example
  • Primers and probes were designed using the adefovir (ADV) mutation of hepatitis B virus as a detection template.
  • the probe is designed with the mutated sequence as the target sequence.
  • MGB probe MGB-ADV-236-3: 5'-FAM - TGGGTATACATTTAACCC -MGBNFQ (SEQ ID NO: 4) (Minor groove binder/Non-fluorescent quencher), the probe sequence conforms to the MGB provided by ABI Design Principles.
  • the designed sequence was synthesized by a phosphoramidite synthesis method by an oligonucleotide automatic synthesizer.
  • LNA probe LNA-ADV-236-4: 5'-FAM-tatacAtttaaCcCc-BHQl (SEQ ID NO: 5) This probe sequence conforms to the LNA design principles provided by EXIQ0N.
  • the probe sequence conforms to the MGB design principles provided by ABI and the LNA design principles provided by EXIQON.
  • the designed sequence was synthesized by a phosphoramidite synthesis method by an oligonucleotide automatic synthesizer.
  • the common probe can not detect the mutation site, and the MGB and LNA probes can sometimes detect the mutation site, but compared with the new probe. It has poor sensitivity, specificity, fluorescence release and stability. A slight change in the reaction conditions and the reaction system causes a difference in the detection results and is also inferior in repeatability.

Description

锁核酸和小沟结合物共修饰的核酸片段
技术领域 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及寡核苷酸的标记方法。
背景技术 为了保证在 PCR扩增过程中， 探针或引物与模板的结合效率， 探针和引物都有一定的长 度的限制。 一般所设计的引物长度在 18~25个碱基， 而像 TaqMman探针的长度一般为 2CT40 个碱基。 但在实际过程中， 在一些突变位点， SNP 和高变异病毒的检测中， 一般的探针和引 物往往检测效果不理想， 灵敏度和特异性很差。
MGB全名 minor groove binder即小沟结合物， 是源于某些抗菌素分子的化学基团， 其 能嵌入 DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合，一般可以将寡核苷酸的退火温度提高 10度 以上，可以縮短引物或探针的长度，提高特异性和给设计带来方便。锁核酸（Locked nuc le i c ac id , LNA) ， 是新型的核酸类似物， 它包含了 2' -氧 4' 碳亚甲基连接， 这个连接限制了呋 喃核糖环的灵活性， 因而将其结构锁定成一个刚性的双环模式， 因此而提高杂交效率和优越 的稳定性。 LNA 单分子的化学结构决定了寡核苷酸序列与目标序列杂交后的稳定性， 与未标 记相比， 其双链在相同的盐溶液中， 每增加一个单体 LNA分子将导致其退火温度提升 8° C o 可以縮短引物或探针的长度， 提高特异性和给设计带来方便。 但是这两种方法由于其提高退 火温度有限， 因此有时也不能完全满足设计的要求。 发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷， 提供一种更好的标记寡核苷酸的方法， 用于 DNA 突变识别检测和 SNP的识别。
本发明一方面提供了一种标记寡核苷酸的方法， 为在同一条寡核苷酸链上即标记 LNA又 标记 MGB。
所述 MGB标记在所述寡核苷酸链的 3 端;所述 LNA标记在所述寡核苷酸链的个别核苷酸上。 进一步的， 所述个别核苷酸为发生突变的碱基。 在确定 MGB及 LNA在寡核苷酸链上的位置后， 可通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成 方法自动合成并标记设计好的序列。
本发明适合标记的寡核苷酸链的长度为 10-18个碱基。
本发明的标记寡核苷酸的方法可用于 DNA突变和 SNP的识别检测。
本发明第二方面公开了一种 LNA (Locked Nucleic Acid) 和 MGB (Minor Groove Binder) 共修饰的核酸片段， 为既标记有 LNA又标记有 MGB的寡核苷酸链。
进一步的， 所述 MGB标记在所述寡核苷酸链的; T端； 所述 LNA标记在所述寡核苷酸链的 个别碱基上。
进一步的，所述经标记的核酸片段为 Taqman探针，所述寡核苷酸链的 5' 端还标记有 报告荧光基团， 3' 端标记有不发光的淬灭基团。
较佳的， 所述报告荧光基团为 FAM或 VIC， 不发光的淬灭基团为 NFQ。
本发明第三方面公开了上述寡核苷酸链作为引物、 Taqman探针的应用。
进一步的， 本发明的寡核苷酸链可作为引物或 Taqman探针用于 DNA突变识别检测。 研究发现， 将 MGB与 LNA同时标记修饰寡核苷酸， 相比单个标记可进一步提高其稳定性， 从而使其退火温度提高。 这样不仅让实验者在设计中拥有更大的选择空间， 还可以提高寡核 苷酸序列的特异性。
本发明的新型寡核苷酸通过运用 MGB (minor groove binder)和 LNA (Locked nucleic acid, LNA) 的组合修饰： 1) 使 Tm值提高了 12_25°C,比只运用一种修饰技术的 Tm值提高 8_15°C提高了 10°C左右。 这可以保证寡核苷酸在满足 Tm值的条件下， 比单修饰或不修饰的 序列更短， 2) 寡核苷酸序列中对 A，G，C，T的组成要求降低。 这些改变使得寡核苷酸:对核酸 序列突变和 SNP的识别能力增强。
本专利运用非常广泛， 可以有效的运用到引物， Taqman探针等。 附图说明 图 1: 反应条件 1反应体系 1- -样口口 1的 PCR结果
图 2: 反应条件 1反应体系 1- -样口口 2的 PCR结果
图 3: 反应条件 1反应体系 1- -样口口 3的 PCR结果
图 4: 反应条件 1反应体系 1- -样口口 4的 PCR结果
图 5: 反应条件 1反应体系 2- -样口口 1的 PCR结果 图 6: 反应条件 1反应体系 2-样品 2的 PCR结果 图 7: 反应条件 1反应体系 2-样品 3的 PCR结果 图 8: 反应条件 1反应体系 2-样品 4的 PCR结果 图 9: 反应条件 1反应体系 3-样品 1的 PCR结果 图 10: 反应条件 1反应体系 3- -样口口 3 2的 PCR结果 图 11 : 反应条件 1反应体系 3- -样口口 3 3的 PCR结果 图 12: 反应条件 1反应体系 3- -样口口 3 4的 PCR结果 图 13: 反应条件 2反应体系 1- -样口口 3 1的 PCR结果 图 14: 反应条件 2反应体系 1- -样口口 3 2的 PCR结果 图 15: 反应条件 2反应体系 1- -样口口 3 3的 PCR结果 图 16: 反应条件 2反应体系 1- -样口口 3 4的 PCR结果 图 17: 反应条件 2反应体系 2- -样口口 3 1的 PCR结果 图 18: 反应条件 2反应体系 2- -样口口 3 2的 PCR结果 图 19: 反应条件 2反应体系 2- -样口口 3 3的 PCR结果 图 20: 反应条件 2反应体系 2- -样口口 3 4的 PCR结果 图 21 : 反应条件 2反应体系 3- -样口口 3 1的 PCR结果 图 22: 反应条件 2反应体系 3- -样口口 3 2的 PCR结果 图 23: 反应条件 2反应体系 3- -样口口 3 3的 PCR结果 图 24: 反应条件 2反应体系 3- -样口口 3 4的 PCR结果 图 25: 反应条件 3反应体系 1- -样口口 3 1的 PCR结果 图 26: 反应条件 3反应体系 1- -样口口 3 2的 PCR结果 图 27: 反应条件 3反应体系 1- -样口口 3 3的 PCR结果 图 28: 反应条件 3反应体系 1- -样口口 3 4的 PCR结果 图 29: 反应条件 3反应体系 2- -样口口 3 1的 PCR结果 图 30: 反应条件 3反应体系 2- -样口口 3 2的 PCR结果 图 31 : 反应条件 3反应体系 2- -样口口 3 3的 PCR结果 图 32: 反应条件 3反应体系 2- -样口口 3 4的 PCR结果 图 33: 反应条件 3反应体系 3- -样口口 3 1的 PCR结果 图 34: 反应条件 3反应体系 3- -样口口 3 2的 PCR结果 图 35: 反应条件 3反应体系 3-样品 3的 PCR结果
图 36: 反应条件 3反应体系 3-样品 4的 PCR结果 具体实施方式
以下列举具体实例以进一步阐述本发明， 应理解实例并非用于限制本发明的保护范围。 实施例 1 : 以 Taqman探针为例
1. 引物、 探针的设计与合成
以乙型肝炎病毒的阿德福韦 （ADV) 突变为检测模板， 设计引物和探针。
设计原理： 1)引物以能够扩增出包含阿德福韦 （ADV) 突变的一段核苷酸序列为目的， 按照引物设计原则进行设计.
2)探针以突变序列为目标序列进行设计。
设计的目标： 在乙肝阳性标本中， 未发生阿德福韦 （ADV) 突变的样本由于探针不能与 之结合， 所以不能释放出荧光信号； 相反突变样本与目的核苷酸片段结合产生荧光信号。 引物: Forward primer: ADV-236-1: 5'- TGGGCCTCAGTCCGTTTC-3' ( SEQ ID NO:l ) Reverse primer. : ADV-236-2： 5 ' -CCAATTACATATCCCATGAAGTTAAG— 3 ' (SEQ ID NO:2) 1) 普通 Taqman探针, 2) MGB探针, 3 ) LNA探针, 4) 新探针.
各种探针的制备：
1 ·普通 Taqman探针： ADV-236-3: 5'-FAM - TGGGTATACATTTAACCCC -BHQ1 ( SEQ ID NO:3 )
2. MGB探针： MGB-ADV-236-3: 5'-FAM - TGGGTATACATTTAACCC -MGBNFQ ( SEQ ID NO:4) (Minor groove binder/Non-fluorescent quencher), 该探针序列符合 ABI公司提供 的 MGB设计原则。
1 ) 以 MGB为； T端设计 TGGGTATACATTTAACCC核苷酸序列；
2) 通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成方法合成设计好的序列。
3. LNA探针： LNA-ADV-236-4: 5'-FAM -tatacAtttaaCcCc-BHQl ( SEQ ID NO:5 ) 该探针序列符合 EXIQ0N公司提供的 LNA设计原则。
1 ) 设计 tatacAtttaaCcCc核苷酸序列， 在突变的位置用 LNA进行标记；
2) 通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成方法合成设计好的序列。 4.新探针： MGB-LNA-ADV-236-5: 5'-FAM - acatttaaCccc -MGBNFQ(Minor groove binder/Non-fluorescent quencher) ( SEQ ID NO:6)
(注： 如 A, C表示为这个碱基是用 LNA特殊单体标记的）
该探针序列符合 ABI公司提供的 MGB设计原则和 EXIQON公司提供的 LNA设计原则。
1 ) 以 MGB为 3、端设计 acatttaaCccc核苷酸序列；
2) 通过寡核苷酸自动合成仪按亚磷酰胺合成方法合成设计好的序列。
实验样本： 4个不同浓度的乙型肝炎阿德福韦 （ADV) 变异模板为样本。
反应体系 1 :
模板 4μ1
10 X PCR reaction buffer 4μ1
MgCl2 (25mM) 3μ1
Forward primer (20 μΜ) 0. 5μ1
Reverse primer (20 μΜ ) 0. 5μ1
probe (20 μΜ) 0. 3μ1
dNTP dOmM each) 0. 8μ1
Taq DNA polymerase ( 5U) 0. 4μ1
双蒸水 26. 5μ1
总体积 40μ1 反应体系 2:
模板 4μ1
10 X PCR reaction buffer 4μ1
MgCl2 (25mM) 4μ1
Forward primer (20 μΜ) 0. 5μ1
Reverse primer (20 μΜ ) 0. 5μ1
probe (20 μΜ) 0. 3μ1
dNTP dOmM each) 0. 8μ1
Taq DNA polymerase ( 5U) 0. 4μ1
双蒸水 25. 5μ1 总体积 40μ1 反应体系 3:
模板 4μ1
10 X PCR reaction buffer 4μ1
MgCl2 (25mM) 6μ1
Forward primer (20 μΜ) 0. 5μ1
Reverse primer (20 μΜ ) 0. 5μ1 probe (20 μΜ) 0. 3μ1 dNTP dOmM each) 0. 8μ1
Taq DNA polymerase ( 5U) 0. 4μ1 双蒸水 23. 5μ1 总体积 40μ1 反应条件 1 :
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
对比结果 （结果参见图 1-9):
Figure imgf000009_0002
通过不同反应体系和反应条件的对比实验， 我们可以看出， 普通探针无法对突变位点进行检 测， MGB和 LNA的探针虽然有时也能检测到突变位点， 但是与新探针相比， 其在检测灵敏度， 特异性， 荧光释放以及稳定性都比较差。 反应条件和反应体系的稍微改变就会引起检测结果 的差异， 重复性也较差。

Claims

权利 要求
1. 一种标记寡核苷酸的方法， 为在同一条寡核苷酸链上即标记 LNA又标记 MGB。
2. 如权利要求 1所述标记寡核苷酸的方法， 其特征在于， 所述 MGB标记在所述寡核苷酸链 的; T端； 所述 LNA标记在所述寡核苷酸链的个别核苷酸上。
3. 如权利要求 2所述标记寡核苷酸的方法， 其特征在于， 所述个别核苷酸为发生突变的碱 基。
4. 如权利要求 1所述标记寡核苷酸的方法， 其特征在于， 所述寡核苷酸链的长度为 10-18 个碱基。
5. 一种 LNA和 MGB共修饰的核酸片段， 为既标记有 LNA又标记有 MGB的寡核苷酸链。
6. 如权利要求 5所述 LNA和 MGB共修饰的核酸片段， 其特征在于， 所述 MGB标记在所 述寡核苷酸链的; T端； 所述 LNA标记在所述寡核苷酸链的个别碱基上。
7. 如权利要求 6所述 LNA和 MGB共修饰的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段为 Taqman 探针， 所述寡核苷酸链的 5 ' 端还标记有报告荧光基团， 3 ' 端标记有不发光的淬灭基团。
8. 如权利要求 5所述 LNA和 MGB共修饰的核酸片段， 其特征在于， 所述寡核苷酸链的长 度为 10-18个碱基。
9. 如权利要求 5-8任一权利要求所述 LNA和 MGB共修饰的核酸片段作为引物或 Taqman探 针的应用。
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